Nous décrivons un protocole simple utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire de base pour générer et purifier de grandes quantités d’une protéine de fusion contenant de la myéline, de la glycoprotéine oligodendrocytaire de souris. Cette protéine peut être utilisée pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale entraînée par les lymphocytes T et B.
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Article de méthode
Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études
Dans cet article
Résumé
Résumé
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC), dont on pense qu’elle survient à la suite de réponses auto-immunes ciblant la myéline. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal le plus courant de maladie auto-immune du SNC et est généralement induite par l’immunisation avec des peptides courts représentant des épitopes de cellules T CD4+ immunodominants des protéines de myéline. Cependant, les lymphocytes B reconnaissent directement les protéines non transformées, et l’immunisation avec un peptide court n’active pas les lymphocytes B qui reconnaissent la protéine native. Étant donné que de récents essais cliniques sur des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B dans le traitement de la SP ont suggéré que les lymphocytes B jouent un rôle dans l’apparition de maladies chez l’humain, il est urgent de disposer de modèles animaux intégrant la reconnaissance de l’auto-antigène par les lymphocytes B. À cette fin, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion contenant le domaine extracellulaire de la version murine de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) ainsi que des fusions N-terminales d’un His-tag à des fins de purification et de la protéine thiorédoxine pour améliorer la solubilité (MOG tag). Un site de clivage de la protéase du virus de gravure du tabac (TEV) a été incorporé pour permettre l’élimination de toutes les séquences de marqueur, ne laissant que le domaine extracellulaire pur MOG1-125. Ici, nous décrivons un protocole simple utilisant uniquement un équipement de laboratoire standard pour produire de grandes quantités demarqueur MOG pur ou MOG1-125. Ce protocole génère constamment plus de 200 mg de protéine demarquage MOG. L’immunisation avecl’étiquette MOG ou le MOG1-125 génère une réponse auto-immune qui comprend des lymphocytes B pathogènes qui reconnaissent le MOG natif de la souris.
Introduction
La SEP est une maladie humaine chronique caractérisée par une inflammation et les maladies neurodégénératives du système nerveux central qui est censée être entraînée par une réponse auto-immune dirigée vers la myéline. La perte de la myéline et des axones au fil du temps le résultat de la baisse progressive de la fonction cognitive et motrice 1. "Auto-immune expérimentale encéphalomyélite" est un terme générique pour les modèles animaux de la maladie auto-immune dirigée vers la myéline du SNC. Comme MS humaine, EAE est généralement caractérisée par une infiltration de cellules immunitaires du système nerveux central et, dans certains cas, 2 dém....
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Protocole
1. L'induction de protéines
NOTE: Dans les étapes suivantes, BL21 bactéries Escherichia coli transformées avec un vecteur pET-32 contenant la séquence de la protéine MOG tag de fusion (voir référence 5 et la figure 1) sont cultivées à des densités élevées et sont ensuite induites pour exprimer la balise protéine MOG . Voir Figure 2 pour calendrier global - noter que les jours sont des points d'arrêt approximatives et alternatives sont notées dans le protocole. Si à partir de l' ADN tag vecteur pET-32 MOG purifié, il sera nécessaire de transfor....
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Résultats
Une fois la purification terminée, les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et le produit final de l' étape 6.4 doivent être exécutés sur un gel de protéine (figure 3A). MOG tag devrait d' abord apparaître comme une bande 31,86 kDa dans l'échantillon T O / N, mais pas T 0, et devrait être le seul groupe dans le produit pur final. Pour tester si la balise protéine MOG a correctement repliée, la b.......
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Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole pour la production de MOG protéine étiquette et comment générer MOG pur 1-125 de la protéine MOG d'étiquette. Ce protocole est basé à la fois sur la base des procédés de purification de protéines His-tag standard, ainsi qu'un protocole décrit précédemment pour la production d'une protéine à base de MOG âgée 15. Bien qu'il ne soit pas décrit ici, l'utilisation primaire de la protéine MOG tag est d'induire l&.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Société canadienne de la sclérose en plaques. RWJ est le récipiendaire d’une bourse de doctorat de la Société canadienne de la sclérose en plaques de la famille Waugh.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| BL21 E. coli-pet32-MOGtag | Kerfoot lab | Ces bactéries sont nécessaires à la fabrication de la protéine MOGtag. Des stocks de glycérol de ces bactéries sont disponibles sur demande. | |
| LB bouillon meunier | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicilline | bio basique | AB0028 | Reconsitituter la poudre en 50 % d’éthanol/ 50 % H2O à 100 mg/ml. Stocker à -20 ° ;C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsitititu la poudre en H2O à 1M et stocker à -20 ° ;C. |
| Lysozyme poule-œuf | Bioshop | LYS702.10 | Reconstituer en H2O à 50 mg/ml et stocker à -80 ° ;C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| de vie | saline tamponnée au phosphate | 20012-027 | La solution saline tamponnée au phosphate commerciale n’est pas nécessaire, toute solution saline tamponnée au phosphate standard fabriquée en laboratoire est suffisante. |
| Chlorure de sodium | Bioshop SOD004.1 | ||
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | La qualité doit être supérieure à 98 % de pureté. |
| 0,5 M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Sulfate de nickel (II) | Bioshop | NIC700.500 | |
| Résine de liaison de His | EMD Millipore | 69670-3 | Stocker dans 20 % d’éthanol 80 % H2O à 4 ° ; C |
| Éthanol anhydre | Alcools commerciaux | P016EAAN | Diluer avec de l’eau au besoin. |
| Acide acétique glacial | Bioshop | ACE222.1 | |
| Acétate de sodium trihydraté | Bioshop | SAA305.500 | |
| Albumine sérique bovine standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad dosage des protéines concentré de réactif | colorant bio-rad | 500-0006 | |
| Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique dihydraté | scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Tube de dialyse | Snakeskin Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoéthanol | Sigma | M3148-25ml | Ce réactif ne doit pas être manipulé en dehors d’une hotte. |
| AcTEV protéase | lifetechnologies | 12575-015 | La production de votre propre protéase TEV peut être réalisée à l’aide de (https://www.addgene.org/8827/) et purifiée comme dans la référence 17 |
| Polyéthylèneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyéthylèneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp fond plat 96 plaque de puits | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Spectromètre de microplaques Eon | Biotek | 11-120-611 | Cet équipement utilise le logiciel d’analyse de données Gen5. |
| Logiciel d’analyse de données Gen5 | BioTek | ||
| dodécylsulfate de sodium | Bioshop | SDS001 | |
| bleu de bromophénol | Bioshop | BRO777 | |
| Glycérol | Bioshop | GLY001 | |
| Colonnes de dessalage des protéines | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| Gel préfabriqué 12 % polyacrylamide | bio-rad | 456-1045 | |
| Réactif de coloration rapide | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| Plateau d’échantillons à lumière blanche | bio-rad | 1708272 ; | Utilisé avec l’imageur gel dock EZ pour les taches de bleu coomassie |
| Échelle protéique | bio-rad | 1610375 |
Références
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G.
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Réimpressions et autorisations
