إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
التصلب العصبي المتعدد هو مرض يصيب الإنسان تتميز التهاب مزمن والتنكس العصبي للجهاز العصبي المركزي والتي يعتقد أن تكون مدفوعة من قبل رد فعل المناعة الذاتية الموجهة نحو المايلين. فقدان المايلين ومحاور مع مرور الوقت تؤدي إلى الانحسار التدريجي لالمعرفية والحركية وظيفة 1. "التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ" هو مصطلح شامل لنماذج حيوانية من أمراض المناعة الذاتية الموجهة نحو الجهاز العصبي المركزي المايلين. مثل MS الإنسان، وعادة ما يتميز EAE بواسطة تسلل الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي، وفي بعض الحالات، إزالة الميالين 2. ومع ذلك، فإن الدرجة التي تشبه أي نموذج EAE نظرا MS البشري في جزء يعتمد على نوع أو سلالة المستخدمة وعلى مدى تعقيد استجابة المناعة الذاتية الكامنة مكافحة المايلين.
المناعة الذاتية مكافحة الميلين يمكن أن يتسبب تجريبيا في العديد من الطرق، ولكن الأسلوب الأكثر شيوعا اليوم هي لتحصين الفئران مع الببتيد قصيرة من الأحماض الأمينية محاكاة CD4 سائد مناعيا <sتصل> + الخلايا التائية حاتمة للبروتين النخاعين. وهذا يمثل الحد الأدنى المطلوب للحث على الاستجابة المسببة للأمراض. ولعل الأكثر شيوعا من هذه هو الببتيد حمض أميني 21 مشتقة من بروتين سكري المايلين دبقية قليلة التغصن (MOG 35-55)، والذي يستخدم للحث على EAE في C57BL / 6 الفئران 3. ومع ذلك، بالنسبة لبعض أغراض تجريبية من المرغوب فيه أو حتى من الضروري تحصين مع مستضدات بروتين أكبر وبالفعل هناك العديد من المزايا لهذا على تحصين مع الببتيد قصيرة. أولا، بسبب تقييد MHC، الببتيدات قصيرة وعادة ما تكون فعالة إلا في نطاق محدود جدا من السلالات، بينما أكبر مستضدات البروتين تمثل إما البروتين الكامل أو مجال معين يمكن معالجة عادة لعرضها في عدة سلالات الفئران الفطرية أو حتى في أنواع مختلفة 4. ثانيا، مستضد بروتين أكبر قادر على إحداث استجابة مناعية أكثر تعقيدا تضم أكثر من أنواع الخلايا الليمفاوية في الاعتراف مستضد، بدلا من limitinز مستضد الاعتراف لخلايا CD4 + T. على سبيل المثال، الخلايا البائية عبر من مستقبلات الخلايا البائية (BCR) تتفاعل مباشرة مع كامل بدلا من معالجتها البروتين. نحن وآخرون قد أظهرت أن الخلايا البائية تفعيلها من خلال MOG 35-55 التحصين لا تعترف البروتين MOG 5. منذ تجلت الخلايا البائية مؤخرا للعب دور الممرضة في MS البشري 6، نماذج EAE التي تتضمن الخلايا البائية في أمراض المناعة الذاتية هي ذات أهمية متزايدة.
وعلى الرغم من مزايا استخدام المضادات البروتين أكبر للحث على EAE، لا تزال هناك بعض المصادر المتاحة تجاريا لهذه البروتينات. في الواقع، في حين أن الببتيدات القصيرة مثل MOG 35-55 يمكن توليفها بشكل سريع جدا وبتكلفة منخفضة نسبيا، والخيارات التجارية للبروتين MOG محدودة والتكلفة إلى حد كبير أكثر لشراء. ومع ذلك، هناك العديد من ناقلات التعبير المتاحة للمجموعات بحثية لتوليد MOG نطاق خارج الخلية (MOG 1-125) أنفسهم. Howeveص، وتقوم كل الأنظمة التعبير التي حددناها في الأدب على التقنيات القديمة التي منذ تم استبدال أنظمة التعبير أكثر كفاءة 7. وعلاوة على ذلك، تعتمد في الغالب على الفئران أو الإنسان MOG 8. بالنسبة لبعض التحقيقات من المناعة الذاتية في الفئران، مستضد على أساس مستضد ذاتي الماوس MOG هو الأفضل. وأخيرا، جميع البروتينات على أساس MOG التي حددناها، سواء التجارية أو ناقلات التعبير، هي البروتينات الانصهار التي تحتوي على الأحماض الأمينية إضافية إلى قاعدة MOG 1-125. وتشمل هذه شعارا لتنقية وتسلسل عادة أخرى أيضا، وكثير منها مع وظيفة لم نتمكن من التعرف عليها.
لمعالجة هذه القيود، ولدت لنا بروتين الانصهار رواية تقوم على الماوس MOG نطاق خارج الخلية لتنصهر علامة تحتوي على thioredoxin لمكافحة الذوبان معروفة من البروتين MOG 5. يحتوي على تسلسل العلامة أيضا تسلسل 6xHis لتنقية والبروتياز شركة كلي TEVموقع avage التي تسمح لإزالة كاملة من جميع تسلسل علامة، إذا رغبت في ذلك. هذا هو الأسلوب الوحيد الذي ندرك لتوليد النقي MOG 1-125 البروتين. لتسهيل إنتاج كميات كبيرة من البروتين، وتسلسل MOG 1-125 كان كودون الأمثل للتعبير عن البكتيريا وتم إدراج MOG البروتين العلامة الاندماج في النظام التعبير PET-32. هنا، نحن تصف بالتفصيل بروتوكول لإنتاج وتنقية MOG العلامة البروتين، وزارة النفط والغاز النقي 1-125، وذلك باستخدام المعدات غير المتخصصة المتاحة لمعظم مختبرات علم المناعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، التي وصفناها بروتوكول لإنتاج MOG البروتين العلامة وكيفية توليد MOG النقي 1-125 من البروتين العلامة MOG. ويستند هذا البروتوكول على حد سواء على أساس طرق تنقية البروتين القياسية صاحب العلامة، وكذلك بروتوكول سبق وصفها لتوليد البروتين كبار السن على أساس …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
References
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
- Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
- Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
- Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
- Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
- Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
- Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
- Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
- Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
- Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).
