Summary
نحن هنا نقدم وسيلة لقياس مستويات الدهون عضوي في الطور الثالث (L3) مرحلة اليرقات من ذبابة الفاكهة. هذه الطريقة يستغل كثافة منخفضة نسبيا من الأنسجة الدهنية للتمييز بين اليرقات مع مخازن الدهون المتغيرة. التحليل القائم على الطفو هو أداة قيمة لفحص السريع، واستنساخه، واقتصادية.
Introduction
وقد استخدمت ذبابة الفاكهة لأكثر من قرن في دراسة علم الوراثة وغيرها من المسائل البيولوجية الأساسية. في العقود القليلة الماضية، أصبح من الواضح أن ذبابة الفاكهة هو أداة قوية في دراسة العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. كما 70-80٪ من الجينات المرتبطة مع الأمراض التي تصيب الإنسان لها ortholog الطيران تحديده و1-4، تقدم ذبابة الفاكهة نظام بعد للترجمة مبسطة للدراسة الأمراض المعقدة. وقد استفاد الأيض بشكل خاص من هذه الدراسة. ليست فقط في علم الوراثة من عملية التمثيل الغذائي المحفوظة جيدا بين الذباب والبشر، ولكن الأجهزة المختصة وأنواع الخلايا هي أيضا مشابهة جدا 2،5. على سبيل المثال، الدهون في الجسم من مخازن الطيران على حد سواء triacylglycerides (TAG) والجليكوجين، وظائف مماثلة لتلك التي تقوم في الكبد الثدييات والدهنية البيضاء الأنسجة 6. عن طريق ذبابة الفاكهة كنموذج للسمنة الإنسان قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للدهنالتمثيل الغذائي وعلم الوراثة من السمنة 7. مرحلة اليرقات التنمية هي مفيدة بشكل خاص لدراسة فصل المواد المغذية إلى تخزين أو استخدام لأنها مخصصة لتغذية وتخزين الطاقة لاستخدامها خلال pupariation.
حاليا، هناك العديد من الأساليب الكمية المختلفة لتحديد مستويات التخزين الدهون في ذبابة الفاكهة. الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع هو فحص اللونية إلى جانب (CCA) 8،9. وقد وضعت التقييم القطري المشترك لتحديد مستويات TAG في مصل الدم البشري وتعمل على فرضية أن الجلسرين تتحرر من العمود الفقري من الدهون الثلاثية سيخضع العديد من ردود الفعل، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رد فعل يقترن الأكسدة توليد منتج ملون. ثم يتم قياس امتصاص موجات محددة من الضوء لتحديد المبلغ الأولي من الجلسرين الحاضر. ومع ذلك، الجلسرين ويمكن أيضا أن تتحرر من أحادية وdiacylglycerides بالإضافة إلى TAG، وبالتالي قد لا تكون مقياسا دقيقا لياليtored الدهون في الجسم 9. وعلاوة على ذلك، صبغة عين الذباب الكبار سحق يمكن أن تتداخل مع بعض قراءات الامتصاصية وتعقيد النتائج 9،10. لذلك، CCA يجب أن يصاحب ويصادق عليها طبقة رقيقة اللوني (TLC)، والذي يسمح لفصل معظم الأسر الدهون التي يمكن quantitated من كثافة 10،11. ومع ذلك، بعض الطبقات الشحمية مثل الجامدة لا يمكن تحليلها ويجب أن يكون كميا بطريقة مختلفة (12). مطياف الكتلة (MS) هو وسيلة دقيقة ل quantitate جميع الطبقات من الدهون الخلوية الرئيسية 12،13. ومع ذلك، فإن إجراءات استخراج الدهون اللازمة لتحليل بواسطة MS على حد سواء وقتا طويلا (أكثر جني ما يقرب من يوم كامل) ومكلفة. هنا نقدم طريقة بديلة لتحديد بسرعة وبتكاليف زهيدة مستويات العضوي الدهون في اليرقات L3 من ذبابة الفاكهة.
الطريقة المعروضة أدناه يستغل الفرق في الكثافة بين الأنسجة الدهنية والأنسجة العجاف. اتحاد كرة القدم الثديياتر الأنسجة لديها كثافة من حوالي 0.9 جم / مل 14 بينما العضلات والهيكل العظمي كما كثافة 1.06 جم / مل 15. هذا الاختلاف يعني أن الحيوانات مع مخازن أعلى من الدهون سيكون أقل كثافة من الحيوانات مع مخازن أقل من الدهون، والتي سوف تسمح لهم تطفو أفضل في حل من كثافة ثابتة. هذه الخاصية تسمح لفحص سريع للغاية لعدد كبير من الحيوانات في حين يجري كل غير مكلفة وغير الغازية. وقد تم استخدام التحليل القائم على الطفو على حد سواء لتأكيد الظواهر من تغيير التنظيمية المعروفة من مستويات الدهون وكذلك لتحديد المنظمين وراثية وعصبية جديدة من السمنة 16،17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع البيض من الذباب مع تراكيب وراثية من الفائدة
ملاحظة: الصلبان المثالية تتكون من 150 الذباب البكر ولا يقل عن 75 من الذكور. يجب أن تتكون مجموعات الأسهم لا يقل عن 200 الذباب.
- إعداد لوحات العنب.
- إضافة 37.5 غرام أجار إلى 1.5 لتر من الماء المقطر في قارورة 4 لتر.
- الأوتوكلاف مزيج الماء / أجار لمدة 50 دقيقة في 121 درجة مئوية (250 درجة فهرنهايت).
- في حين أن المياه / مزيج أجار هو التعقيم، إضافة 50 غرام السكروز إلى 500 مل من عصير العنب ويحرك مع بقضيب على طبق من اثارة ساخنة حتى يذوب السكروز.
- إيقاف الحرارة ويستمر التحريك لتبريد عصير العنب / خليط السكروز إلى أقل من 70 درجة مئوية. اختبار درجة الحرارة الداخلية مع الحرارة الكحول.
- إضافة 3 ز ذبابة الفاكهة عامل مضاد للفطريات (على سبيل المثال، Tegosept) لتسخين عصير العنب / خليط السكروز ويحرك المزيج حتى يذوب.
- عندما تكون المياه / خليط أجار هو من الأوتوكلاف، والسماح للقارورة لتبرد لمسة من يحوم في بعض الأحيان.
- استخدام ماصة المصلية لإضافة 8-10 مل من خليط العنب إلى غطاء لوحة بتري صغيرة (35 × 10 مم النمط). يسمح هذا المزيج على تتويج أعلى من ارتفاع الجدران غطاء لتشكيل شكل محدب.
- السماح لوحات العنب لتبرد لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم تخزينها في وعاء محكم في 4 درجة مئوية.
- تحضير عجينة الخميرة.
- إضافة 6 مل من محلول العازلة الفوسفات (PBS) إلى 4 ز الحية الخميرة المجففة نشطة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتخلط مع ملعقة حتى تصبح ناعمة.
- متجر الخميرة لصق في 4 درجة مئوية.
- إضافة وجبة بوظة صغيرة (حوالي 1/8 ملعقة شاي) من عجينة الخميرة في وسط لوحة العنب. السلس أسفل أي حواف خشنة مع ملعقة.
- وضع لوحات العنب في حاضنة حتى وصلت درجة الحرارة المحيطة.
- نقل الذباب من الاهتمام إلى لوحة غرفة جمع البيض ومكان العنب ثإيث الخميرة لصق التي تواجه الداخل على القمة. شريط لوحة العنب إلى غرفة جمع البيض لتجنب السماح لوحة تسقط. تأكد من كتابة المعلومات الوراثي والتاريخ مهمة على الجزء السفلي من لوحة العنب.
- إنقلب غرفة جمع البيض للسماح للالذباب لتضع بيضها على لوحة العنب.
- وضع مربع أو تغطية على المخادع جمع البيض ووضعها في حاضنة عند 25 درجة مئوية.
- السماح الذباب لتضع بيضها ل4-6 ساعة.
- إنهاء جمع بأخذ لوحة العنب من غرفة جمع البيض ونقل الذباب العودة الى زجاجة للغذاء. استخدام ملعقة لتمحو أي معجون الخميرة الزائدة من لوحة العنب. متجر لوحة العنب في طبق بتري أكبر في حاضنة ترطيب عند 25 درجة مئوية ل~ 24 ساعة.
2. نقل اليرقات إلى التجريبية للأغذية
- إعداد الطعام التجريبية.
ملاحظة: تستند هذه وصفة الطعام على الأسهم بلومينغتون مركز صفة 18. تغييرات هامةوتشمل كمية من الخميرة لتحسين القيمة الغذائية للطعام زيادة وفقا لتقييم توقيت تجول مرحلة (ما بين 112-120 ساعة بعد جمع البيض عند 25 درجة مئوية). في حين وجدنا هذه الوصفة مثالية للمحافظة على الصحة والتنمية اليرقات التجريبية لدينا، أي وصفة طعام مقبولة معايرة معين مع الضوابط الإيجابية والسلبية، والأمثلة التي يتم سردها في الخطوة 3.10.- قياس 1600 مل من الماء المقطر.
- مزيج 134 غ دقيق الذرة، 10.6 غرام ذبابة الفاكهة آجار من النوع الثاني، وبعض من الماء (~ 500 مل) في كوب 1 لتر. ويخلط لمدة 2 دقيقة مع خلاط اليد الآلية.
- خلط 70 جم الحية الخميرة النشطة الجافة، 18.4 غرام طحين الصويا، 84.8 غرام الشعير استخراج، وبعض من الماء (~ 500 مل) في كوب 1 L آخر. ويخلط لمدة 2 دقيقة مع خلاط اليد الآلية.
- دوامة كل كوب وتصب في قارورة 4 لتر. استخدام المياه المتبقية لشطف من الأكواب وإضافة إلى القارورة.
- قياس 140 مل شراب الذرة الخفيفة وإضافة إلى قارورة، مزيج من قبل دوامات. </ لى>
- الأوتوكلاف لمدة 50 دقيقة في 121 درجة مئوية (250 درجة فهرنهايت) في إعداد السائل.
- بعد التعقيم، صب الطعام في كوب 4 لتر والسماح لتبرد. مساعدة عملية التبريد عن طريق مزج مع يد خلاط الآلية.
- مرة واحدة في قارورة قد بردت يكفي للمس، إضافة 8.8 مل حمض البروبيونيك و 16.8 مل ذبابة الفاكهة المضادة للفطريات حل كيل / الإيثانول. اخلط جيدا. (جعل الحل وكيل ذبابة الفاكهة مضاد للفطريات عن طريق إضافة 380 غرام ذبابة الفاكهة عامل مضاد للفطريات إلى 1 L 200 الإيثانول دليل واثارة على طبق من الحارة حتى يذوب، والتأكد من الحل لا تتجاوز 70 درجة مئوية).
- صب الطعام في قوارير حتى الطعام ما يقرب من 1 بوصة العميق والسماح لتبرد على RT لمدة 2-3 ساعة. المكونات قارورة وتخزينها في حاضنة عند 25 درجة مئوية. استخدام في غضون اسبوع.
- يغرق ملعقة عدة مرات في الطبقة العليا من القارورة من المواد الغذائية ليسجل ذلك. وهذا سوف يساعد على اليرقات إلى الجحر والأعلاف.
- 22-24 ساعة بعد جمع البيض لديهاالعضوية، واستخدام الفرشاة الصغيرة لجمع 50 الأولى الطور (L1) يرقات من نفس الحجم التقريبي. وضع اليرقات في الغذاء التجريبي. تنظيف الفرشاة على مختبر مسح وضمان عدم وجود اليرقات المتبقية على الفرشاة قبل الاستمرار في التركيب الوراثي آخر.
- ضع قارورة من اليرقات في حاضنة عند 25 درجة مئوية، والسماح لتطوير.
3. تحديد مستويات الدهون في يرقات
- إعداد الحلول.
- إعداد 1 لتر 10X الأسهم برنامج تلفزيوني.
- إضافة 80 جم كلوريد الصوديوم، 2 غرام بوكل، 14.4 غ نا 2 هبو 4، و 2.4 ز KH 2 PO 4-800 مل من الماء في كوب 2 لتر تحتوي على بقضيب. يقلب مع عدم وجود الحرارة حتى يتم دمج جميع الأملاح. جلب الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. زيادة حجم إلى 1 لتر من الماء.
- إعداد 2 لتر برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 200 مل من محلول 10X الأسهم PBS إلى 1800 مل من الماء.
- استخدام هذا المخزون من برنامج تلفزيوني 1X لجعل 20٪ ث / ت السكروز.
- إعداد 1 لتر 10X الأسهم برنامج تلفزيوني.
- إزالة قارورة من اليرقات منحاضنة مرة واحدة هناك 20-40 اليرقات تجول حتى الجانبين من القارورة (عادة في اليوم الخامس بعد جمع البيض). تسجيل تاريخ ووقت الفحص، فضلا عن عدد من التيه اليرقات.
- يعد حل التجريبية بإضافة 11.5 مل PBS و 9 مل السكروز 20٪ إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إضافة 20٪ سكروز إلى القارورة حتى يتم 0،5-1 بوصة من أعلى القارورة.
- استخدام ملعقة لاثارة بلطف صعودا في الطبقة العليا من الغذاء ليرقات الحرة التي ما زالت تختبئ في الطعام. فإن جميع اليرقات تطفو على السطح من الحل السكروز.
- استخدام ملقط لنقل بلطف اليرقات إلى تركيز السكروز الأولي من الخطوة 3.3.
- استخدام ملعقة لاثارة بلطف اليرقات في هذا الحل.
- غطاء الأنبوب المخروطي وإنقلب عدة مرات لمزيج دقيق الحل.
- إرفع قبعة أنبوب مخروطي الشكل ودوامة لخلق دوامة طيف.
- السماح لليرقات ليستقر، إما تطفو إلى أعلى من الحل أو الاشتراكيةnking إلى أسفل. الانتظار 2-5 دقائق ليرقات ليستقر.
ملاحظة: إذا كان لا يزال هناك اليرقات التي ليست بالتأكيد إما عائمة أو غرق، واختيار خط لاستخدامها كنقطة قطع لتسمية اليرقات إما العوام أو ثقالة. تطبيق هذا المعيار نفسه لجميع المورثات. نحن نستخدم زاوية في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل لدينا حدود. ADP أو sir2 17 يرقات متحولة يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية وlsd2 يمكن استخدام 19 المسوخ كعنصر تحكم السلبية للمعايرة من الفحص. - تسجيل عدد من اليرقات العائمة وتركيز محدد اختبارها.
- إضافة 1 مل 20٪ سكروز إلى حل تجريبي لزيادة كثافته.
- كرر الخطوات من 3،7-3،10. تسجيل عدد من اليرقات العائمة وهذا التركيز الجديد.
- مواصلة الخطوات 3.12 و 3.13 حتى لا يقل عن 95٪ من اليرقات تطفو.
- استخدام ملقط لجمع كل اليرقات في طبق تشريح مليئة برنامج تلفزيوني.
- طب التوليداليرقات erve تحت المجهر وملاحظة إذا كان هناك أي يرقات صغيرة، قبل الشرانق، الشرانق، أو أي اختلافات أخرى بين المورثات.
ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن تظهر جميع اليرقات متجانسة وفي هذه المرحلة التنموية نفسها. وقد لاحظنا فقط قياسات الدهون متسقة في ظل هذه الظروف. - تسجيل عدد من اليرقات.
- باستخدام ملقط، نقل 10 اليرقات إلى مختبر مسح لتجف. تسمية أنبوب microcentrifuge ووضع 10 اليرقات في أنبوب.
- فلاش تجميد اليرقات في النيتروجين السائل. تخزين أنبوب في -20 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمثل الشكل 1 مثال على كيفية الفحص القائمة على الطفو يمكن الكشف عن كل من ارتفاع وانخفاض مخازن الدهون في اليرقات التلاعب بها وراثيا. الشكل 1A يدل على أن الإثارة أو إسكات مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية (E347) في الدماغ اليرقات يدفع الدهون أقل وأعلى مخازن على التوالي. تم استخدام نفس تحكم الخلفية الوراثية في كلتا الحالتين الشكل يوفر 1B مثال عن كيفية ويؤيد هذا النمط الظاهري الحصول عليها عن طريق فحص كثافة عن طريق استخراج دهن محايد وتقدير من قبل GCMS.
الشكل 1. العصبية وظيفة في مناطق معينة من الدماغ اليرقات هو ضروري وكاف لتنظيم الدهون في الجسم. ساد الصمت نشاط الخلايا العصبية في خط E347-GAL4 المحددة من قبل overexpression من شي DN، أو تفعيلها من خلال overexpression من NB، كما هو مبين في لوحات، وجرى تقييم الآثار المترتبة على الدهون في الجسم. (A) نسبة عائمة اليرقات في التوازن في الحلول المختلفة الكثافة. تم فحص خمسين اليرقات في تكرار البيولوجي، ن = 7-9 مكررات البيولوجية في التركيب الوراثي الدهون (ب) الجسم في المئة (الدهون الكلية محايدة بما triacylglycerides والدهون الفوسفاتية مقسوما على وزن الجسم) مقاسا GCMS 17،20 (ن = 8). خطوط زرقاء أو أشرطة تمثل GAL4 فقط (لا UAS) الحيوانات عبرت إلى w 1118 للسيطرة على الآثار المترتبة على خلفية وراثية. وتمثل القيم ف نتائج الاختبارات ر الذيل يومين. **** P <0.0001، *** P = ،0001-،001 **، P = ،001-،01، * P = 0،01-0،05. تظهر أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. تم تعديل هذا الرقم 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من التقنيات التي تم تطويرها لقياس مستويات الدهون 8-10. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب يأتي مع بعض العوائق الرئيسية التي تتم معالجتها بواسطة الفحص القائمة على الطفو المبينة أعلاه. أولا، هذا الاختبار هو سريع للغاية. اختبار التدرج التركيز الكامل لا تستغرق أكثر من 30 - 60 دقيقة. هذا هو تحسن كبير على معظم التقنيات المستخدمة حاليا. على سبيل المثال، دهن الكميات التي كتبها MS يأخذ 7-9 ساعة لعزل الدهون وعدة ساعات أخرى لتحليلها. هذا هو رادعا قويا عند إجراء الشاشة على عدد كبير من الحيوانات. عن طريق قياس النمط الظاهري الطفو السريع، ويمكن للمرء أن التركيز بسرعة على المورثات التي لها النمط الظاهري للاهتمام. الثانية، وفحص كثافة يتطلب فقط الكواشف الشائعة مثل الأملاح (لPBS) والسكروز. وهذا يجعل من الاسهل بكثير وأقل تكلفة لفحص عدد كبير من اليرقات أو بسرعة اختبار وراثي للاهتمام. وأخيرا، وهذا ط بروتوكولق غير الغازية واليرقات لا تزال على قيد الحياة في نهاية المطاف. وهذا يسمح مزيد من التجارب التي يتعين القيام بها على الحيوانات مثل الكميات الدهون محددة أو نص أو تحليل البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسمح اليرقات تعافى لمواصلة النمو إلى مرحلة البلوغ.
وتزداد فائدة إضافية لهذه التقنية مقارنة مع الآخرين حساسية للتغيرات صغيرة في مستويات الدهون في عدد السكان. عن طريق إجراء تركيز التدرج كله على السكان من 50 اليرقات، وسيتم تحديد تحولات طفيفة في مستويات الدهون في عدد السكان بنسبة تغير في تركيزات الوسيطة، على الرغم من أن التركيز الذي تبدأ اليرقات العائمة وطرحت تماما قد لا يكون مختلفا عن الضوابط . قد لا يكون دائما التعرف على هذا التحول صغير في عدد السكان بطرق الدهون الكميات الأخرى لأنها تتطلب مجموعة كبيرة من اليرقات لتحليل. فحص كثافة من ناحية أخرى يستجوب الأفراد في أوساط السكان، ويمكن بالتالي تحديد عشرجنوب شرقي تغييرات صغيرة أو التحولات في توزيع السكان بشكل عام.
كما تعتمد هذه التقنية على كثافة المحلول إلى نتائج موثوق بها، فإنه من المهم للغاية أن برنامج تلفزيوني وحلول السكروز تتم باستمرار. لقد وجدنا أن مختلف وصفات برنامج تلفزيوني تنتج الاختلافات في الكثافة حل، مما يؤدي إلى نتائج متفاوتة. نحن نستخدم الوصفة المذكورة أعلاه لنتائج متسقة. وعلاوة على ذلك، مما يجعل من السكروز 20٪ من نفس دفعة من برنامج تلفزيوني 1X أمر مهم لأنه يؤدي في نفس كثافة حل الخلفية. لو كانت تلك الحلول على نحو منفصل، يمكن أن تكون هناك اختلافات طفيفة في كثافة برنامج تلفزيوني جلب متغير إضافي كثافة ما وراء إضافة السكروز إلى قارورة المخروطية التجريبية. وأخيرا، يمكن التبخر يكون مشكلة، لأن أكثر من مرة الحلول ستصبح أكثر تركيزا مع تبخر الماء. ولذلك فمن المهم للحد من الزجاجات بإحكام ولإعادة صياغة حل كل أسبوع بحيث التجريبيةلا تزال حلول متسقة.
ومن بين الخطوات المذكورة أعلاه، هناك العديد من الخطوات الهامة التي إذا غيرت، يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير دقيقة عن طريق الفحص الطفو. أولا، من المهم أن اليرقات نقلها إلى القارورة الغذاء التجريبية تكون في نفس الفئة العمرية. ونقل اليرقات التي تختلف في الحجم تؤدي إلى اليرقات في مراحل تنموية مختلفة في وقت إجراء الفحص الطفو. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد التغيرات في مستويات الدهون في تجول L3 اليرقات ولن تعمل بدقة لL3 الباكر أو قبل الشرانق أو في وقت لاحق. في وقت مبكر الثالثة يرقات العمر لديهم ميل لتعويم مستقل من مستويات الدهون في حين قبل الشرانق والمصارف الشرانق حتى على أعلى تركيزات استخدامها. لهذا السبب، عمر اليرقات L1 نقل أمر بالغ الأهمية. وبالمثل، فإن النقطة التي يتم أخذ قارورة لإجراء فحص الطفو هو المهم. لنفس الأسباب توقيت التنموي ذكر أعلاه، ينبغي أن تؤخذ في قارورة فقط عند 20 -هي تتخبط 40 يرقات لضمان قياسات دقيقة الكثافة. بالإضافة إلى ذلك، نقل عدد من L1 يمكن أن تؤثر على النتائج أيضا. قارورة واسعة المستخدمة في هذا البروتوكول تسمح 50 يرقات لتناول الطعام دون منافسة خلال التنمية. وهناك عدد أكبر بكثير من اليرقات نقل من هذا يؤدي التنافس على الغذاء ويمكن أن تؤثر على كمية الدهون المخزنة مستقلة عن التركيب الوراثي.
قد تكون هناك المورثات مع مثل هذه المستويات من الدهون عالية للغاية أن معظم أو كل من اليرقات سوف تطفو على تركيز الأول. في هذه الحالة، قد يتم تعديل البروتوكول من خلال خفض تركيز المحلول بدءا من أجل الحصول على مجموعة كاملة من توزيع الكثافة السكانية. من ناحية أخرى، قد يكون وراثى محدد الخالية من الدهون بحيث لا يرقة يطفو في السكروز الأولي. في هذه الحالة، قد يتم حذف الخطوات الأولية والتركيز انطلاق أعلى استخدامها. هذا الاختبار هو مرن جدا ويمكن تعديلها لتناسب بشكل أفضل مجموعة واسعة من مستويات الدهون.ونحن ننصح استخدام الضوابط المناسبة مثل الحيوانات البرية من نوع (الخاضعة للرقابة لخلفية وراثية)، الضوابط الإيجابية (المسوخ الدهون المعمول بها، مثل ADP أو Sir2 17)، وضوابط السلبية (نشرت المسوخ العجاف مثل lsd2 19). والاستخدام المناسب لهذا البروتوكول يسمح فحص المستقبلي للمجموعات لتحديد المنظمين جديدة من عملية التمثيل الغذائي والاستعداد السمنة. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول وسيلة سهلة للباحثين في أي مجال لاختبار ما إذا كان التلاعب الجيني اهتمامهم يؤدي إلى تغيير في مستويات الدهون، دون الحاجة إلى بروتوكولات معقدة أو معدات باهظة الثمن. وهذا البروتوكول يساعد على إلقاء الضوء على العلاقة المعقدة بين علم الوراثة والبدانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
- Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
- Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
- Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
- Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).
- Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
- Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
- Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).
- Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
- Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
- Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
- Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
- Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
- Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
- Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).
- Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm (2014).
- Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
