Summary
Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.
Introduction
Drosophila melanogaster è stato utilizzato per più di un secolo nello studio della genetica e di altre questioni biologiche fondamentali. Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che la Drosophila è un potente strumento per lo studio di molte malattie umane. Il 70 - 80% di geni associati a malattie umane hanno una mosca ortologo identificata 1 - 4, Drosophila fornisce un sistema semplificato ma traducibile in cui studiare le malattie complesse. Il metabolismo, in particolare, ha beneficiato di tale studio. Non solo la genetica del metabolismo ben conservati tra le mosche e gli esseri umani, ma gli organi competenti e tipi di cellule sono molto simili a 2,5. Ad esempio, il grasso corporeo dei negozi mosca entrambi Triacilgliceroli (TAG) e di glicogeno, funzioni analoghe a quelle svolte nel fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo bianco 6. Utilizzando Drosophila come modello per l'obesità umana ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di lipidiil metabolismo e la genetica di obesità 7. Lo stadio larvale di sviluppo è particolarmente utile per studiare la segregazione di nutrienti stoccaggio o utilizzo come è dedicata all'alimentazione e l'immagazzinamento di energia da utilizzare durante pupariation.
Attualmente, ci sono molti metodi quantitativi diversi della determinazione dei livelli di stoccaggio dei grassi in Drosophila. Il metodo più diffuso è il saggio colorimetrico accoppiato (CCA) 8,9. CCA è stato sviluppato per determinare i livelli TAG nel siero umano e opera sulla premessa che glicerolo liberato dalla spina dorsale di trigliceridi subirà diverse reazioni, che si traduce in una reazione redox-coupled generando un prodotto colorato. Assorbanza di specifiche lunghezze d'onda di luce viene poi misurata per determinare la quantità iniziale di glicerolo presente. Tuttavia, glicerolo può anche essere liberato da mono- e diacylglycerides oltre al TAG e quindi non può essere una misura accurata di storato grasso corporeo 9. Inoltre, l'occhio del pigmento di mosche adulte schiacciati può interferire con alcune letture di assorbanza e complicare i risultati 9,10. Pertanto, CCA deve essere accompagnato e convalidato cromatografia su strato sottile (TLC), che permette la separazione delle maggior parte delle famiglie di lipidi che può essere quantificata mediante densitometria 10,11. Tuttavia, alcune classi di lipidi, come steroli non possono essere analizzati e devono essere quantificati un modo diverso 12. La spettrometria di massa (MS) è un modo preciso per quantificare tutte le classi di grandi lipidi cellulari 12,13. Tuttavia, le procedure di estrazione dei lipidi necessari per analizzare da MS sono sia in termini di tempo (più presa quasi un giorno intero) e costosa. Qui vi presentiamo un metodo alternativo per determinare rapidamente ed economicamente livelli di grasso organismal nelle larve L3 di Drosophila melanogaster.
Il metodo presentato sotto sfrutta la differenza di densità tra tessuto adiposo e tessuto magro. fa mammiferit tessuto ha una densità di circa 0,9 g / ml 14 mentre il muscolo scheletrico come una densità di 1,06 g / ml 15. Questa differenza significa che gli animali con elevate riserve di grasso avranno densità inferiore rispetto agli animali con i negozi più bassi di grasso, che permetteranno loro di galleggiare meglio in una soluzione della densità fisso. Questa proprietà consente estremamente rapido lo screening di un gran numero di animali pur essendo sia poco costoso e non invasivo. Analisi di galleggiabilità-based è stato utilizzato sia per confermare i fenotipi di alterare regolatori noti di livelli di grasso, nonché di individuare nuovi regolatori genetici e neurologici di obesità 16,17.
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Protocol
1. raccogliere le uova dalle mosche con genotipi di interesse
NOTA: croci ideali sono costituite da 150 mosche vergini e almeno 75 maschi. collezioni di archivio deve essere composto da almeno 200 mosche.
- Preparare piatti d'uva.
- Aggiungere 37,5 g di agar a 1,5 L di acqua distillata in un matraccio 4 L.
- Autoclave miscela acqua / agar per 50 min a 121 ° C (250 ° F).
- Mentre l'acqua / miscela agar è autoclave, aggiungere 50 g di saccarosio al succo d'uva da 500 ml e mescolare con un ancoretta su un piatto mescolare fino a quando riscaldato il saccarosio si scioglie.
- Spegnere il fuoco e continuare a mescolare per raffreddare la miscela succo d'uva / saccarosio al di sotto di 70 ° C. Testare la temperatura interna con un termometro alcool.
- Aggiungere 3 g Drosophila agente anti-fungine (ad esempio, Tegosept) per riscaldare il succo d'uva miscela / saccarosio e mescolare per sciogliere.
- Quando l'acqua / miscela agar è fuori dell'autoclave, permettono raffreddare il pallone al tatto agitando occasionalmente.
- Utilizzare una pipetta sierologica aggiungere 8 - 10 ml della miscela dell'uva al coperchio di una piccola piastra di Petri (stile 35 x 10 mm). Lasciare la miscela a corona superiore alla altezza delle pareti del coperchio per formare una forma convessa.
- Lasciare le piastre uva raffreddare per 2 ore a temperatura ambiente e poi conservare in un contenitore ermetico a 4 ° C.
- Preparare pasta di lievito.
- Aggiungere 6 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 g vivo lievito secco attivo in una provetta conica da 50 ml e mescolare con una spatola fino liscio.
- Conservare lievito in pasta a 4 ° C.
- Aggiungere un piccolo ciuffo (circa 1/8 cucchiaino) di pasta di lievito per mezzo di una piastra di uva. Lisciare eventuali asperità con una spatola.
- Posizionare le piastre di uva in un incubatore fino a quando non hanno raggiunto la temperatura ambiente.
- Trasferire le mosche di interesse in un piatto di camera di raccolta delle uova e del luogo d'uva with pasta di lievito rivolta verso l'interno sulla parte superiore. Nastro piatto d'uva per la camera di raccolta delle uova per evitare che la piastra di cadere. Assicurati di scrivere importanti genotipo e informazioni aggiornate sulla parte inferiore della piastra di uva.
- Capovolgere la camera di raccolta delle uova per consentire le mosche di deporre le uova sulla piastra di uva.
- Posizionare una casella o coprire la sorveglianza delle camere di raccolta delle uova e metterli in un incubatore a 25 ° C.
- Consentire mosche per deporre le uova per 4 - 6 ore.
- Terminare raccolta prendendo la piastra dell'uva fuori della camera di raccolta uovo e trasferire le mosche indietro nel loro bottiglia di cibo. Utilizzare una spatola per eliminare ogni pasta di lievito in eccesso dalla piastra di uva. piatto d'uva Conservare in una più grande capsula di Petri in un incubatore umidificato a 25 ° C per ~ 24 ore.
2. Trasferimento larve di Experimental alimentari
- Preparare il cibo sperimentale.
NOTA: Questa ricetta cibo è basato sulla Bloomington Stock Center ricetta 18. importanti cambiamentiincludono una maggiore quantità di lievito per ottimizzare il valore nutrizionale degli alimenti, come valutato dal tempi di vagare fase (tra 112-120 ore dopo la raccolta delle uova a 25 ° C). Mentre abbiamo trovato questa ricetta ideale per la salute e lo sviluppo del nostro larve sperimentale, ogni ricetta cibo è dato di calibrazione accettabile con controlli positivi e negativi, esempi dei quali sono elencati al punto 3.10.- Misura 1.600 ml di acqua distillata.
- Mescolare 134 g di farina di mais, 10,6 g Drosophila Agar Tipo II, e una parte dell'acqua (~ 500 ml) in 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato.
- Mescolare 70 g di lievito secco attivo vivo, 18,4 g di farina di soia, 84,8 g estratto di malto, e una parte dell'acqua (~ 500 ml) in un altro 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato.
- Agitare ogni bicchiere e versare in un pallone da 4 L. Usare l'acqua residua per sciacquare i bicchieri e aggiungere nel pallone.
- Misurare 140 ml di sciroppo di mais luce e aggiungere al pallone, mescolare agitando. </ Li>
- Autoclave per 50 minuti a 121 ° C (250 ° F) in ambiente liquido.
- Dopo la sterilizzazione in autoclave, versare il cibo in un 4 L bicchiere e lasciare raffreddare. Aiutare il processo di raffreddamento miscelando con un miscelatore della mano motorizzato.
- Una volta che il pallone si è raffreddato abbastanza da toccare, aggiungere 8,8 ml di acido propionico e 16,8 ml di soluzione di Drosophila agente / etanolo anti-fungine. Mescolare bene. (Fare soluzione agente Drosophila anti-fungine con l'aggiunta di 380 g Drosophila agente anti-fungine a 1 L 200 etanolo prova e mescolare in un piatto caldo fino sciolto, facendo attenzione che la soluzione non sia superiore a 70 ° C.)
- Versare il cibo in fiale fino a quando il cibo è di circa 1 pollice profondo e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 2-3 ore. Collegare flaconi e conservare in un incubatore a 25 ° C. Utilizzare entro una settimana.
- Tuffo una spatola più volte nello strato superiore del flaconcino di cibo per segnare esso. Questo aiuterà le larve di scavare e mangimi.
- 22 - 24 ore dopo la raccolta delle uova haended, utilizzare un pennello piccolo per raccogliere 50 primo stadio (L1) larve della stessa dimensione approssimativa. Posizionare larve nel cibo sperimentale. Pulire il pennello su un laboratorio wipe e garantire che non vi siano restante larve sul pennello prima di proseguire per un altro genotipo.
- Mettere flacone di larve in un incubatore a 25 ° C e permettere di sviluppare.
3. Determinare i livelli di grassi nelle larve
- Preparare soluzioni.
- Preparare 1 L 10x PBS magazzino.
- Aggiungere 80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, e 2,4 g KH 2 PO 4-800 ml di acqua in un bicchiere 2 L contenente un ancoretta. Mescolare con nessun calore fino a quando tutti i sali sono incorporati. Portare il pH a 7,4. Aumentare il volume di 1 litro con acqua.
- Preparare 2 L 1x PBS. Aggiungere 200 ml di soluzione di PBS 10x magazzino a 1.800 ml di acqua.
- Utilizzare questo stock di PBS 1x per rendere il 20% w / v di saccarosio.
- Preparare 1 L 10x PBS magazzino.
- Rimuovere il flacone di larve dallaincubatore una volta ci sono 20 - 40 larve di vagare fino ai lati del flacone (generalmente il quinto giorno dopo collezioni di uova). Registrare la data e l'ora del test, nonché il numero di vagare larve.
- Preparare la soluzione sperimentale aggiungendo 11,5 ml di PBS e 9 ml 20% di saccarosio in una provetta conica da 50 ml.
- Aggiungere 20% di saccarosio al flaconcino finché è 0.5 - 1 pollice dalla parte superiore della fiala.
- Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente lo strato superiore di cibo per le larve liberi che sono ancora scavando nel cibo. Tutti larve salirà alla superficie della soluzione di saccarosio.
- Utilizzare pinze per trasferire delicatamente le larve nella concentrazione di saccarosio iniziale dal punto 3.3.
- Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente le larve in questa soluzione.
- Chiudere la provetta conica e capovolgere più volte per mescolare accuratamente la soluzione.
- Togliere il tubo conico e agitare per creare un vortice gentile.
- Lasciare che le larve di stabilirsi, o galleggianti alla parte superiore della soluzione o sinking al fondo. Attendere 2-5 minuti per le larve di stabilirsi.
NOTA: Se ci sono ancora larve, che non sono sicuramente variabile o affondare, scegliere una linea da utilizzare come punto di taglio per etichettare le larve sia come un galleggiante o una zavorra. Applicare questo stesso criterio a tutti i genotipi. Usiamo l'angolo al fondo della provetta conica come nostro confine. Adp o sir2 17 larve mutante può essere utilizzato come controllo positivo e LSD2 19 mutanti possono essere utilizzati come controllo negativo per la calibrazione del test. - Registrare il numero di larve flottante e la concentrazione specifica testato.
- Aggiungere 1 ml di 20% di saccarosio alla soluzione sperimentale per aumentarne la densità.
- Ripetere i passaggi 3,7-3,10. Registrare il numero di larve galleggianti e questa nuova concentrazione.
- Continuare passi 3.12 e 3.13 fino ad almeno il 95% delle larve sono galleggianti.
- Utilizzare pinze per raccogliere tutte le larve in un piatto dissezione pieno di PBS.
- observe larve al microscopio e nota se ci sono piccole larve, pupe pre-, pupe, o qualsiasi altre differenze tra genotipi.
NOTA: Idealmente, tutte le larve deve apparire omogenea e allo stesso stadio di sviluppo. Abbiamo osservato soltanto misurazioni del grasso consistenti in queste condizioni. - Registrare il numero totale di larve.
- Utilizzando pinze, trasferire 10 larve di un laboratorio di pulire a secco. Etichettare una provetta e posizionare 10 larve nel tubo.
- Flash congelare le larve in azoto liquido. Conservare il tubo a -20 ° C.
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Representative Results
La figura 1 rappresenta un esempio di come il dosaggio galleggiamento-based può rilevare sia depositi grassi superiori e inferiori in larve geneticamente manipolati. La figura 1A mostra che eccitazione o silenziamento di un certo sottoinsieme di neuroni (E347) nel cervello larvale induce grassi inferiori e superiori negozi rispettivamente. Lo stesso controllo background genetico è stato utilizzato in entrambi i casi. Figura 1B fornisce un esempio di come questo fenotipo ottenuto mediante il saggio densità viene confermata mediante estrazione dei lipidi neutri e quantificazione dal GCMS.
Figura 1. funzione neuronale in specifiche regioni del cervello larvale è necessario e sufficiente per il regolamento di grasso corporeo. Attività neuronale nella linea E347-GAL4 indicato è stato messo a tacere da sovraespressione di Shi DN, Oppure attivata tramite sovraespressione di NB, come indicato nei pannelli, ed effetti sul grasso corporeo sono stati valutati. (A) Percentuale di larve galleggianti all'equilibrio in soluzioni di densità diverse. Cinquanta larve sono stati esaminati per campione biologico, n = 7 - 9 repliche biologiche per genotipo grasso (B) corpo Percent (lipidi neutri totali comprese triacilgliceroli e fosfolipidi divisa per il peso corporeo) come misurato dalla GCMS 17,20 (n = 8).. Le linee blu o barre rappresentano GAL4-only (senza UAS) gli animali hanno attraversato a w 1118 per controllare gli effetti del background genetico. valori di P rappresentano i risultati di test t a due code. **** P <0.0001, *** P = 0,0001 al 0.001 ** P = 0,001 al 0,01, * P = 0.01 0.05. Le barre di errore mostrano SEM. Questa cifra è stata modificata 16. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono una moltitudine di tecniche che sono state sviluppate per misurare i livelli di lipidi 8 - 10. Tuttavia, ciascuno di questi metodi viene fornito con alcuni importanti inconvenienti che sono indirizzati mediante il saggio galleggiamento basato descritto sopra. In primo luogo, questo test è estremamente rapido. Test di un gradiente di piena concentrazione non richiede più di 30 - 60 min. Questo è un enorme miglioramento sulla maggior parte delle tecniche attualmente in uso. Ad esempio, lipidi quantificazione da MS prende 7-9 ore per isolare i lipidi e altre diverse ore per analizzarli. Questo è un forte deterrente durante l'esecuzione di uno schermo su un gran numero di animali. Misurando un fenotipo galleggiamento rapido, si può mettere a fuoco rapidamente sui genotipi che hanno il fenotipo di interesse. In secondo luogo, il saggio di densità richiede soltanto reagenti comuni quali sali (per PBS) e saccarosio. Questo rende molto più semplice ed economico per lo screening di un gran numero di larve o rapidamente testare genotipo interessante. Infine, questo mi protocollos non invasiva e le larve sono ancora vivi alla fine. Questo permette ulteriori sperimentazioni da effettuare sugli animali, come specifica quantificazione dei lipidi o trascrizione o analisi delle proteine. Inoltre, le larve recuperato può essere consentito di continuare a crescere fino all'età adulta.
Un ulteriore vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri viene aumentata sensibilità alle piccole variazioni di livelli di grasso in una popolazione. Eseguendo un intero gradiente di concentrazione su una popolazione di 50 larve, piccoli spostamenti nei livelli di grasso popolazione saranno identificati da un cambiamento nelle concentrazioni intermedie, sebbene la concentrazione alla quale le larve iniziano flottante e sono totalmente galleggiare non può essere diverso rispetto ai controlli . Questo piccolo spostamento nella popolazione non può sempre essere identificato da altri metodi di quantificazione grasso in quanto richiedono un grande gruppo di larve da analizzare. Il dosaggio densità invece interroga individui all'interno della popolazione e può quindi identificare these piccole modifiche o cambiamenti nella distribuzione complessiva della popolazione.
Poiché questa tecnica si basa sulla densità della soluzione per produrre risultati affidabili, è estremamente importante che il PBS e soluzioni di saccarosio sono fatti in modo coerente. Abbiamo scoperto che diverse ricette PBS producono differenze di densità della soluzione, portando a risultati diversi. Usiamo la ricetta sopra descritta per ottenere risultati coerenti. Inoltre, rendendo il saccarosio 20% dallo stesso lotto di 1x PBS è importante in quanto determina la stessa densità della soluzione di sfondo. Se le due soluzioni sono state fatte separatamente, leggere variazioni di densità PBS potrebbero portare variabile densità aggiuntiva oltre aggiunta di saccarosio al flaconcino conica sperimentale. Infine, l'evaporazione può essere un problema, perché nel tempo le soluzioni diventeranno più concentrato con l'evaporazione dell'acqua. È quindi importante cap bottiglie ermeticamente e per ristabilire la soluzione ogni settimana in modo che sperimentalesoluzioni rimangono costanti.
Tra i punti di cui sopra, ci sono diversi passaggi critici che se alterato, potrebbe portare a risultati non accurati da parte del test di galleggiabilità. In primo luogo, è importante che le larve trasferito nel flaconcino cibo sperimentale sia la stessa età. Trasferimento di larve che variano in dimensioni comporterà larve a diversi stadi di sviluppo al momento viene eseguito il test di galleggiabilità. Questo protocollo è stato sviluppato per determinare i cambiamenti nei livelli di grasso nel vagare L3 larve e non funzionerà in modo accurato per L3 precoce o pre-pupe o successiva. All'inizio del terzo instar larve hanno la tendenza a galleggiare indipendentemente dai livelli di grasso, mentre pre-pupe e lavandino pupe anche alle più alte concentrazioni utilizzate. Per questo motivo, l'età delle larve L1 trasferito è critica. Analogamente, il punto in cui viene preso il flaconcino per eseguire il test di galleggiabilità è importante. Per le stesse ragioni di temporizzazione di sviluppo di cui sopra, i flaconcini devono essere prese solo quando 20 -40 larve vagano per garantire misurazioni della densità accurate. Inoltre, il numero di L1 trasferito può influenzare risultati pure. Le ampie fiale utilizzate in questo protocollo consentono 50 larve di mangiare senza concorrenza durante lo sviluppo. Un numero molto maggiore di larve trasferito a questo si tradurrà in competizione per il cibo e può influenzare la quantità di grasso immagazzinato indipendentemente dal genotipo.
Ci possono essere genotipi con tali livelli estremamente elevati di grasso che la maggior parte o tutte le larve galleggerà alla prima concentrazione. In questo caso, il protocollo può essere modificato diminuendo la concentrazione della soluzione di partenza per ottenere uno spettro completo della distribuzione della densità di popolazione. D'altra parte, un genotipo specifico può essere così magra che nessuna larva galleggia in saccarosio iniziale. In questo caso, i passi iniziali possono essere omessi e una concentrazione iniziale più elevata usati. Questo test è molto flessibile e può essere modificato per adattarsi meglio un'ampia gamma di livelli di grasso.Si consiglia l'uso di controlli, come adeguati animali wild type (controllata per il background genetico), controlli positivi (mutanti grassi stabilito, come ADP o Sir2 17), e controlli negativi (mutanti magre pubblicati, come LSD2 19). L'uso appropriato di questo protocollo permetterà futuro proiezione di collezioni per determinare nuovi regolatori del metabolismo e l'obesità predisposizione. Inoltre, questo protocollo fornisce un modo semplice per i ricercatori in ogni campo per verificare se la loro manipolazione genetica di interesse provoca un cambiamento nei livelli di grassi, senza la necessità di protocolli complesse o costose attrezzature. Questo protocollo contribuirà a chiarire la complessa relazione tra la genetica e l'obesità.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
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