Summary
Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening.
Introduction
Drosophila melanogaster ist seit mehr als einem Jahrhundert in der Erforschung der Genetik und andere grundlegende biologische Fragen verwendet. In den letzten Jahrzehnten hat es klar geworden , dass Drosophila ein mächtiges Werkzeug in der Studie von vielen menschlichen Krankheiten. Da 70-80% der mit menschlichen Krankheiten assoziierten Gene haben ein identifizierter Fliegen ortholog 1. - 4. stellt Drosophila ein vereinfachtes noch übersetzbar System , bei dem komplexe Krankheiten zu studieren. Der Stoffwechsel hat vor allem von einer solchen Studie profitiert. Nicht nur sind die Genetik der Stoffwechsel gut konserviert zwischen Fliegen und Menschen, aber die zuständigen Organe und Zelltypen sind auch sehr ähnlich 2,5. Zum Beispiel kann die Fettkörper der Fliegen speichert beide Triacylglyceride (TAG) und Glykogen, die Funktionen analog zu denen in Säugetierleber und weißen Fettgewebe 6 durchgeführt. Mit Drosophila als Modell für menschliche Fettleibigkeit hat unser Verständnis von Lipid erheblich verbessertStoffwechsel und die Genetik der Adipositas 7. Larvenentwicklungsstadium ist besonders nützlich für die Untersuchung der Segregation von Nährstoffen Lagerung oder Verwendung, wie sie zum Zuführen und die Speicherung von Energie widmet sich während Puparium-Bildung verwendet werden.
Derzeit gibt es viele verschiedene quantitative Methoden der Fettlagerebenen in Drosophila zu bestimmen. Die am weitesten verbreitete Methode ist die gekoppelte kolorimetrischen Assay (CCA) 8,9. CCA wurde zur Bestimmung der TAG Niveaus in menschlichem Serum entwickelt und arbeitet auf der Prämisse, dass aus dem Rückgrat Triglyceriden freigesetzt Glycerin werden mehrere Reaktionen eingehen, letztlich in einer Redox-Reaktion gekoppelt ergeb ein gefärbtes Produkt erzeugen. Die Absorption bestimmter Wellenlängen des Lichts wird dann gemessen, um die anfängliche Menge an Glycerin vorhanden zu bestimmen. Jedoch Glycerin kann auch aus Mono- und Diacylglyceriden neben TAG freigesetzt werden und somit kann kein genaues Maß für s seinwachten Körperfett 9. Außerdem Auge Pigment des zerquetschten erwachsenen Fliegen kann mit einigen Extinktionsablesungen stören und 9,10 Ergebnisse erschweren. Daher muss CCA durch Dünnschichtchromatographie (TLC) begleitet und validiert werden, die für die Trennung der meisten Lipid Familien ermöglicht , die durch Densitometrie 10,11 quantifiziert werden kann. Allerdings können einige Lipidklassen wie Sterole nicht analysiert werden und muss eine andere Art und Weise 12 quantifiziert werden. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine genaue Art und Weise alle Klassen der wichtigsten zellulären Lipiden 12,13 quantitativ zu bestimmen. die Lipidextraktionsverfahren jedoch notwendig, die von MS zu analysieren sind sowohl zeitaufwendig (die meisten Einnahme fast einen ganzen Tag) und kostspielig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode , um schnell und kostengünstig organismal Fettwerte in der L3 - Larven von Drosophila melanogaster bestimmen.
Das Verfahren stellt sich wie folgt nutzt die Differenz in der Dichte zwischen Fettgewebe und magerem Gewebe. Mammalian fat Gewebe hat eine Dichte von etwa 0,9 g / ml 14 während der Skelettmuskulatur als einer Dichte von 1,06 g / ml 15. Dieser Unterschied bedeutet, dass Tiere mit höheren Vorräte an Fett geringere Dichte als Tiere mit geringeren Speicher des Fettes haben, die es ihnen ermöglichen besser fester Dichte in einer Lösung zu schweben. Diese Eigenschaft ermöglicht eine extrem schnelle Screening einer großen Anzahl von Tieren, während sowohl kostengünstige und nicht-invasive sind. Buoyancy-basierte Analyse wurde sowohl die Phänotypen der Änderung bekannten Regulatoren der Fettwerte sowie zu identifizieren , neue genetische und neurologische Regulatoren der Fettleibigkeit 16,17 zur Bestätigung verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sammeln Eier aus Flies mit Genotypen von Interesse
HINWEIS: Ideal Kreuze bestehen aus 150 virgin Fliegen und mindestens 75 Männer. Auf Sammlungen sollten mindestens 200 Fliegen bestehen.
- Bereiten Sie Traubenplatten.
- Hinzufügen 37,5 g Agar 1,5 L destilliertem Wasser in einem 4 l-Kolben.
- Autoklav Wasser / Agar Mix für 50 min bei 121 ° C (250 ° F).
- Während Wasser / Agar Mix Autoklavierung ist, in den 500 ml Traubensaft 50 g Saccharose und rühren mit einem Rührstab auf einem beheizten Rührplatte bis Saccharose gelöst ist.
- Schalten Sie die Hitze und weiterhin Rühren der Traubensaft / Saccharose-Mischung auf unter 70 ° C abkühlen lassen. Testen Sie die Innentemperatur mit einem Alkohol-Thermometer.
- In 3 g Drosophila Anti-Pilz - Mittel (zB Tegosept) Traubensaft / Saccharose - Mischung zu erwärmen und rühren zu lösen.
- Wenn Wasser / agar Mischung aus dem Autoklaven ist, kann der Kolben durch Verwirbelung gelegentlich zur Berührung zu kühlen.
- Verwenden Sie eine serologische Pipette 8 hinzufügen - 10 ml der Traubenmischung auf den Deckel einer kleinen Petrischale (35 x 10 mm-Stil). Die Mischung höher Krone als die Höhe der Deckelwände eine konvexe Form zu bilden.
- Lassen Sie Trauben Platten für 2 Stunden bei Raumtemperatur abkühlen lassen und dann lagern in einem luftdichten Behälter bei 4 ºC.
- Bereiten Sie Hefe-Paste.
- 6 ml Phosphatpufferlösung (PBS) bis 4 g Lebend aktiven Trockenhefe in einem 50 ml konischen Röhrchen und Mischen mit einem Spatel bis glatt.
- Shop Hefe Paste bei 4 ºC.
- Fügen Sie eine kleine Portion (etwa 1/8 tsp) von Hefe-Paste in die Mitte einer Traube Platte. Glätten alle Ecken und Kanten mit einem Spatel.
- Platzieren grape Platten in einem Inkubator, bis sie Umgebungstemperatur erreicht haben.
- Übertragen Sie fliegt von Interesse in einem Eiersammelraum und Platz Trauben Platte with Hefe-Paste auf der Oberseite nach innen zeigen. Bandtraubenplatte an der Eiersammelkammer zu vermeiden, die Platte zu lassen herausfallen. Stellen Sie sicher, wichtige Genotyp und aktuelle Informationen auf der Unterseite der Traube Platte zu schreiben.
- Upend die Eiersammelkammer die Fliegen zu legen ihre Eier auf der Wein Platte zu ermöglichen.
- Legen Sie eine Box oder decken die Eiersammlung Kammern um und legen Sie sie in einem Inkubator bei 25 ° C.
- Lassen Sie Fliegen Eier zu legen für 4 - 6 Stunden.
- End-Kollektion von der Trauben Platte aus dem Ei Sammelkammer zu nehmen und die Fliegen wieder in ihre Flasche Lebensmittel übertragen. Verwenden Sie einen Spachtel überschüssige Hefe-Paste aus der Traube Platte abzuwischen. Store grape Platte in einem größeren Petrischale in einem befeuchteten Inkubator bei 25 ºC für ca. 24 Std.
2. Transfer Larvae zu Experimental Lebensmittel
- Bereiten Sie experimentelle Nahrung.
HINWEIS: Diese Lebensmittel Rezept basiert auf der Mitte Rezept Bloomington Lager 18. Wichtige Änderungenwie beurteilt umfassen Menge an Hefe erhöht den Nährwert der Lebensmittel zu optimieren, indem Timing des Wanderns Stufe (zwischen 112-120 Stunden nach der Eizellenentnahme bei 25 ° C). Während wir dieses Rezept ideal für die Gesundheit und die Entwicklung unserer experimentellen Larven gefunden haben, ist ein Lebensmittel Rezept akzeptabel gegeben Kalibrierung mit positiven und negativen Kontrollen, von denen Beispiele in Schritt 3.10 aufgeführt sind.- Messen 1600 ml destilliertem Wasser.
- Mischungs 134 g Maismehl, 10,6 g Agar Drosophila Typ II, und ein Teil des Wassers (~ 500 ml) in einem 1 l Becherglas. Mischung für 2 min mit einem motorisierten Handmixer.
- Mischen Sie 70 g Lebend Trockenhefe, 18,4 g Sojamehl, 84,8 g Malzextrakt, und ein Teil des Wassers (~ 500 ml) in einem anderen 1-Liter-Becher. Mischung für 2 min mit einem motorisierten Handmixer.
- Swirl jeden Becher und gießen Sie in einem 4-Liter-Kolben. Verwenden Sie das restliche Wasser, um die Becher ausspülen und fügen Sie in den Kolben.
- Messen Sie 140 ml Licht Maissirup und in den Kolben gegeben, mischen durch Schwenken. </ Li>
- Autoklav für 50 min bei 121 ºC (250 ºF) in der flüssigen Umgebung.
- Nach dem Autoklavieren gießen Lebensmittel in einen 4-Liter-Becher und abkühlen lassen. Helfen Sie den Kühlprozess, indem sie mit einem motorisierten Handmixer gemischt werden.
- Sobald der Kolben zu berühren abgekühlt genug, fügen Sie 8,8 ml Propionsäure und 16,8 ml Drosophila Anti-Pilz - Mittel / Ethanol - Lösung. Gut mischen. (Make Drosophila Anti-Pilz - Mittel - Lösung durch Zugabe von 380 g Drosophila Anti-Pilz - Mittel auf 1 L 200 Proof Ethanol und Rühren auf einer warmen Platte , bis sie gelöst, so dass sicher , dass die Lösung nicht mehr als 70 ° C nicht überschreitet.)
- Gießen Sie Lebensmittel in Fläschchen, bis das Essen etwa 1 Zoll tief ist und erlauben für 2 bei RT abkühlen - 3 Stunden. Stecken Fläschchen und lagern in einem Inkubator bei 25 ° C. Verwenden Sie innerhalb einer Woche.
- Tauchen Sie ein Spatel mehrmals in die obere Schicht des Fläschchens von Lebensmitteln es zu punkten. Dies wird dazu beitragen, die Larven zu wühlen und füttern.
- 22 bis 24 Stunden nach der Eiersammlung hatended mit einem kleinen Pinsel 50 erste Larvenstadium (L1) Larven der gleichen ungefähren Größe zu sammeln. Legen Larven in der experimentellen Nahrung. Reinigen Sie den Pinsel auf einem Labortuch und sicherzustellen, dass es keine restlichen Larven auf dem Pinsel, bevor zu einem anderen Genotyp weiter.
- Legen Fläschchen Larven in einem Inkubator bei 25 ° C und erlauben zu entwickeln.
3. Bestimmen Fettwerte in Larvae
- Bereiten Sie Lösungen.
- Bereiten Sie 1 L 10x PBS Lager.
- Hinzufügen , 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 und 2,4 g KH 2 PO 4 bis 800 ml Wasser in einem 2 l Becherglas einen Rührstab enthält. Rühren Sie ohne Hitze, bis alle Salze eingeschlossen sind. Bringen pH auf 7,4. Erhöhen Sie Volumen auf 1 l mit Wasser.
- Bereiten Sie 2 L 1x PBS. In 200 ml 10x PBS-Stammlösung zu 1800 ml Wasser.
- Verwenden Sie diese Lager von 1x PBS 20% w / v Saccharose zu machen.
- Bereiten Sie 1 L 10x PBS Lager.
- Entfernen Sie die Fläschchen von Larven aus derInkubator einmal gibt es von 20 bis 40 Larven die Seiten des Fläschchens wandern nach oben (in der Regel am fünften Tag nach dem Ei Sammlungen). Notieren Sie Datum und Uhrzeit des Tests sowie die Anzahl der Larven wandern.
- Bereiten experimentelle Lösung durch Zugabe von 11,5 ml PBS und 9 ml 20% Saccharose zu einem 50 ml konischen Röhrchen.
- In 20% Saccharose in das Fläschchen, bis sie 0,5 - 1 Zoll von der Spitze des Fläschchens.
- Verwenden Sie einen Spachtel, um sanft die oberste Schicht der Nahrung frei Larven schüren, die noch in der Nahrung wühlen. Alle Larven werden auf die Oberfläche der Saccharoselösung ansteigen.
- Verwenden einer Pinzette vorsichtig auf die Larven in die Ausgangssaccharosekonzentration von Schritt 3.3 übertragen.
- Verwenden Sie einen Spachtel vorsichtig auf die Larven in dieser Lösung rühren.
- Verschließen Sie die konischen Röhrchen und den Kopf stellen mehrmals gründlich die Lösung mischen.
- Die Kappe des konischen Rohrs und wirbeln eine sanfte Wirbel zu erzeugen.
- Lassen Sie die Larven zu regeln, entweder schwimmend an die Spitze der Lösung oder sinking nach unten. Warten Sie 2 bis 5 min für Larven zu begleichen.
HINWEIS: Wenn es noch Larven sind, die nicht auf jeden Fall entweder oder sinkende schwimmend, eine Linie wählen als Cutoff-Punkt zu verwenden, um die Larven entweder als Floater oder einem Platinen zu beschriften. Wenden Sie dieses gleiche Kriterium für alle Genotypen. Wir verwenden den Winkel an der Unterseite des konischen Rohrs als unsere Grenze. Adp oder sir2 17 mutant Larven kann als positive Kontrolle und LSD2 19 Mutanten als negative Kontrolle für die Kalibrierung des Assays verwendet werden , werden verwendet werden. - Notieren Sie die Anzahl der schwimmenden Larven und die spezifische Konzentration getestet.
- 1 ml 20% Saccharose in die Versuchslösung ihre Dichte zu erhöhen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,7-3,10. Notieren Sie die Anzahl der schwimmenden Larven und diese neue Konzentration.
- Weiterhin Schritten 3.12 und 3.13 bis mindestens 95% der Larven schwimmen.
- Verwenden einer Pinzette alle Larven in eine Dissektion Schale mit PBS gefüllt zu sammeln.
- Observe Larven unter dem Mikroskop und zur Kenntnis, wenn es irgendwelche kleinen Larven, Pre-Puppen, Puppen oder andere Unterschiede zwischen den Genotypen.
HINWEIS: Im Idealfall alle Larven sollte homogen und in der gleichen Entwicklungsstufe erscheinen. Wir haben nur konsequent Fettmessungen unter diesen Bedingungen beobachtet. - Notieren Sie sich die Gesamtzahl der Larven.
- Mit einer Pinzette, übertragen 10 Larven in ein Labor wischen, um zu trocknen. Beschriften Sie eine Mikrozentrifugenröhrchen und legen 10 Larven in die Röhre.
- Blitzeis die Larven in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ºC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Auftriebsbasierten Assay erkennen kann sowohl höhere als auch niedrigere Fettreserven in genetisch manipulierten Larven. 1A zeigt , daß bei Anregung oder Silencing einer bestimmten Untergruppe von Neuronen (E347) im Larven Gehirn induziert niedrigere und höhere Fett Geschäfte sind. Die gleichen genetischen Hintergrund - Kontrolle wurde in beiden Fällen verwendet. 1B zeigt ein Beispiel dafür , wie dies durch die Dichte Assay erhalten Phänotyp durch neutrale Lipid - Extraktion und Quantifizierung durch GCMS bestätigt wird.
Abbildung 1. Neuronale Funktion in bestimmten Regionen des Gehirns Larval ist notwendig und ausreichend für die Körperfett - Verordnung. Neuronale Aktivität in der angegebenen E347-GAL4 Linie wurde durch die Überexpression von Shi DN zum Schweigen gebrachtOder durch Überexpression von NB aktiviert, wie in den Tafeln angedeutet, und die Auswirkungen auf das Körperfett beurteilt. (A) Prozent der Larven im Gleichgewicht in unterschiedlicher Dichte Lösungen schwimmen. Fünfzig Larven wurden pro biologische Replikation untersucht, n = 7 bis 9 biologischen Replikaten pro Genotyp (B) Prozent Körperfett (total neutralen Lipiden einschließlich durch das Körpergewicht geteilt Triacylglyceriden und Phospholipide), gemessen durch GCMS 17,20 (n = 8).. Blaue Linien oder Balken stellen GAL4-only (kein UAS) Tiere gekreuzt w 1118 für Effekte von genetischen Hintergrund zu steuern. P-Werte stellen die Ergebnisse von zweiseitigen t-Tests. **** P <0,0001, *** P = 0,0001 bis 0,001, ** P = 0,001 bis 0,01, * P = 0,01 bis 0,05. Die Fehlerbalken zeigen SEM. Diese Zahl wurde 16 geändert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es gibt eine Vielzahl von Techniken , die entwickelt wurden Lipidspiegel 8 zu messen - 10. Allerdings kommt jedes dieser Verfahren einige wesentliche Nachteile, die durch den Auftrieb basierenden Assay oben umrissenen adressiert sind. Erstens ist dieser Test sehr schnell. eine vollständige Konzentrationsgradienten Prüfung dauert nicht länger als 30 - 60 min. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber den meisten der Techniken, die derzeit im Einsatz. Zum Beispiel Lipid-Quantifizierung von MS dauert 7 bis 9 h die Lipide und noch mehrere Stunden zu isolieren, um sie zu analysieren. Dies ist eine starke abschreckende Wirkung, wenn ein Bildschirm auf einer großen Anzahl von Tieren durchführen. Durch einen schnellen Auftrieb Phänotyp zu messen, kann man schnell auf den Genotypen konzentrieren, die den Phänotyp von Interesse haben. Zweitens erfordert die Dichte Assay nur gemeinsame Reagenzien wie Salze (z PBS) und Saccharose. Dies macht es viel einfacher und billiger, eine große Anzahl von Larven zu screenen, oder schnell eine interessante Genotyp testen. Schließlich ist dieses Protokoll is nicht-invasive und die Larven sind am Ende noch am Leben. Dies ermöglicht eine weitere Experimente an Tieren wie spezifische Lipid Quantifizierung oder Transkript oder Protein-Analyse durchgeführt werden. Zusätzlich können wiederhergestellt Larven erlaubt sein Wachstum bis zum Erwachsenenalter fortsetzen.
Ein zusätzlicher Vorteil dieser Technik gegenüber anderen ist in Fettwerte in einer Population Empfindlichkeit auf kleine Änderungen erhöht. Durch die Ausführung, bei der eine ganze Konzentrationsgefälle bei einer Bevölkerung von 50 Larven, leichte Verschiebungen in der Bevölkerung Fettwerte durch eine Änderung in den mittleren Konzentrationen identifiziert werden, obwohl die Konzentration der Larven beginnen schwimmend und sind vollständig sein kann, nicht als die Kontrollen anders schwebten . Diese kleine Verschiebung in der Bevölkerung nicht immer von anderen Fettquantifizierungsverfahren identifiziert werden, da sie eine große Gruppe von Larven erfordern zu analysieren. Der Dichtetest auf der anderen Seite abfragt Individuen in der Bevölkerung und kann folglich erkennen these kleine Veränderungen oder Verschiebungen in der Gesamtbevölkerung Verteilung.
Da diese Technik auf der Dichte der Lösung beruht zuverlässige Ergebnisse zu erzeugen, ist es äußerst wichtig, dass das PBS und Saccharoselösungen konsistent hergestellt werden. Wir haben festgestellt, dass verschiedene PBS Rezepte Unterschiede in Lösungsdichte erzeugen, zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Wir verwenden das Rezept oben für konsistente Ergebnisse dargestellt. Darüber hinaus ist die Herstellung von 20% Saccharose aus der gleichen Charge von 1x PBS wichtig, da es in dem gleichen Hintergrund Lösungsdichte führt. Wenn die beiden Lösungen getrennt hergestellt wurden, geringfügige Variationen in der Dichte in PBS zusätzliche Dichtevariable über die Zugabe von Saccharose zu dem experimentellen konische Phiole bringen könnte. Schließlich kann Verdunstung ein Problem sein, weil im Laufe der Zeit werden die Lösungen mit dem Verdampfen von Wasser stärker konzentriert werden. Es ist daher wichtig, um die Flaschen fest an der Kappe und die Lösung jede Woche neu zu gestalten, so daß die experimentellenLösungen konsistent bleiben.
Unter den oben beschriebenen Schritte, gibt es mehrere wichtige Schritte, dass, wenn verändert, in ungenauen Ergebnissen durch den Auftrieb Assay führen kann. Zunächst ist es wichtig, dass die Larven in die experimentelle Lebensmittelfläschchen übertragen im gleichen Alter sein. Übertragen von Larven, die in der Größe variieren werden zu der Zeit wird der Auftrieb Assay durchgeführt in verschiedenen Entwicklungsstadien in larvae. Dieses Protokoll wurde Änderungen in Fettwerte in wandernden L3-Larven zu bestimmen, entwickelt und wird für Anfang L3 oder Pre-Puppen oder später nicht genau arbeiten. Frühe dritte Larvenstadium haben eine Tendenz, unabhängig von Fettwerte zu schweben, während pre-Puppen und Puppenkörper auch bei den höchsten Konzentrationen eingesetzt. Aus diesem Grund übertragen das Alter der L1-Larven ist kritisch. In ähnlicher Weise, bei der der Punkt das Fläschchen mit dem Auftrieb Assay durchzuführen genommen wird, ist wichtig. Aus den gleichen Entwicklungszeit oben genannten Gründen sollte die Vials nur eingenommen werden, wenn 20 -40 Larven wandern genaue Dichtemessungen zu gewährleisten. Außerdem übertragen die Anzahl der L1 als auch Ergebnisse beeinflussen können. Die breiten Fläschchen in diesem Protokoll verwendet werden, erlauben 50 Larven während der Entwicklung, ohne den Wettbewerb zu essen. Eine viel größere Anzahl von Larven als diese übertragen werden in Konkurrenz um Nahrung führen und kann die Menge an Fett gespeichert unabhängig von Genotyp beeinflussen.
Es kann Genotypen mit solchen extrem hohen Fettwerte sein, die meisten oder alle der Larven in der ersten Konzentration schweben. In diesem Fall kann das Protokoll durch eine Verringerung der Konzentration der Ausgangslösung, um ein volles Spektrum der Bevölkerung Dichteverteilung zu erhalten, modifiziert werden. Auf der anderen Seite kann ein spezifischer Genotyp so mager sein, dass keine Larven in der anfänglichen Saccharose schwimmt. In diesem Fall können die anfänglichen Schritte weggelassen werden und eine höhere Ausgangskonzentration verwendet. Dieser Assay ist sehr flexibel und kann modifiziert werden, um besser eine breite Palette von Fettwerte passen.Wir empfehlen die Verwendung von Steuerungen wie zB entsprechende Wildtyp - Tiere (für genetische Hintergrund gesteuert), positive Kontrollen (etablierte Fett Mutanten, wie adp oder Sir2 17) und Negativkontrollen (veröffentlicht mageren Mutanten , wie LSD2 19). Geeignete Verwendung dieses Protokolls wird künftig Screening von Sammlungen ermöglichen, neue Regulatoren der Stoffwechsel und Adipositas Veranlagung bestimmen. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll eine einfache Möglichkeit für Forscher in allen Bereichen zu testen, ob ihre genetische Manipulation von Interesse Veränderung der Fettspiegel verursacht, ohne die Notwendigkeit komplexer Protokolle oder teure Ausrüstung. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, die komplexen Beziehungen zwischen Genetik und Adipositas aufzuklären.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
- Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
- Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
- Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
- Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).
- Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
- Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
- Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).
- Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
- Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
- Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
- Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
- Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
- Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
- Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).
- Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm (2014).
- Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
