确定脂肪水平在基于浮力法 Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54744

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Kelsey E. Hazegh¹, Tânia Reis¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, and Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

这里，我们提出以测量在第三龄（L3） 果蝇幼虫阶段有机体脂肪含量的方法。这种方法利用脂肪组织相对较低的密度与改变脂肪储存幼虫区分。基于浮力分析是快速，重现性好，经济的筛选有价值的工具。

Introduction

果蝇已遗传学等基本生物学问题的研究中已经使用了一个多世纪。在过去的几十年中，已经变得清楚的是果蝇是在许多人类疾病的研究的强有力的工具。由于70 -与人类疾病相关的基因有80％有确定的飞行直系同源基因^{1 - 4，} 果蝇提供来研究复杂疾病的简化还没有翻译系统。代谢尤其是从这样的研究中受益。不仅是新陈代谢的苍蝇和人类之间高度保守的基因，但有关机关和细胞类型也非常相似^2,5。例如，苍蝇同时存储三酰基甘油酯（TAG）和糖原，功能类似于在哺乳动物肝脏和白色脂肪组织^6中执行的脂肪体。用果蝇作为人类肥胖的模式已经大大提高了我们的脂质的理解代谢和肥胖⁷的遗传学。发展的幼虫阶段为，因为它是专门用于饲养pupariation期间使用能量的存储学习营养素存储或利用的偏析特别有用。

目前，在果蝇确定脂肪储存水平的许多不同的定量方法。最广泛使用的方法是耦合比色测定^{（CCA）8,9。} CCA被用于确定人血清中的TAG水平制定并在该甘油从甘油三酯的骨架中释放将发生一些反应，最终导致在氧化还原偶联反应产生有色产物的前提进行操作。然后光的特定波长的吸光度测定来确定本甘油的初始量。然而，甘油，也可以从单 - 和二酰基甘油酯除了TAG解放，因此可能无法为s的精确测量灌装液位体脂肪^9。此外，粉碎成蝇眼色素可以与一些吸光度读数干扰和结果^9,10复杂化。因此，CCA必须伴随并通过薄层色谱（TLC），其允许可通过光密度^10,11来定量最脂质家庭分离验证。然而，一些脂质类，如甾醇不能被分析和必须量化以不同的方式^12。质谱（MS）是定量主要细胞脂质^12,13的所有类的精确方式。然而，MS分析所需要的脂类提取程序都是耗时（多数回吐将近一整天），成本高。在这里，我们提出了一个替代方法快速，廉价地确定在果蝇的幼虫L3生物体的脂肪含量。

下面提出的方法利用在脂肪组织和瘦组织之间的密度差。哺乳动物发吨组织具有大约为0.9g / ml的¹⁴而骨骼肌的密度为1.06克/毫升¹⁵的密度。这种差异意味着，动物脂肪较高的卖场会比动物脂肪较低的门店，这将让他们在固定密度的解决方案，更好的浮动密度较低。此属性，可大量而被价格便宜，非侵入性动物的极快的筛选。基于浮力分析已经同时用于确认改变脂肪水平的公知的调节剂，以及识别肥胖^16,17的新的基因和神经调节的表型。

Protocol

1.苍蝇利益的基因型收集鸡蛋

注：理想的十字架包括150处女蝇和至少75男性。股票集合应该包含至少200苍蝇。

1. 准备葡萄板。
   1. 37.5克琼脂添加到1.5升蒸馏水在一个4升烧瓶中。
   2. 高压灭菌水/琼脂混合在121°C（250°F）50分钟。
   3. 虽然水/琼脂的搭配是高压灭菌50克蔗糖添加至500ml葡萄汁，并在加热搅拌板上搅拌棒搅拌，直至蔗糖溶解。
   4. 关火，继续搅拌至葡萄汁/蔗糖混合液冷却到低于70ºC。测试用醇温度计的内部温度。
   5. 添加3克果蝇抗真菌剂（ 例如 ，Tegosept）温热葡萄汁/蔗糖混合物并搅拌到溶解。
   6. 当水/琼脂混合物超出高压釜，让该烧瓶通过偶尔旋流冷却到触摸。
   7. 使用血清吸管至8加 - 将10毫升葡萄混合物的一个小培养皿（35×10mm的样式）的盖子。使混合物冠高于该盖壁的高度，以形成凸状。
   8. 允许葡萄板在4ºC冷却，在室温下2小时，然后存放在密封的容器中。
2. 准备酵母泥。
   1. 加6毫升磷酸盐缓冲液（PBS）至4 g活活性干酵母在50ml锥形管中，并用刮铲，直到顺利混合。
   2. 商店酵母粘贴在4ºC。
3. 添加酵母膏的小译者语（约1/8茶匙），以葡萄板的中间。平息用锅铲任何粗糙的边缘。
4. 放置葡萄板在培养箱中，直到它们达到室温。
5. 转移兴趣苍蝇打入一个鸡蛋收集室和地点葡萄板W¯¯第i个酵母泥顶部向内面对的问题。磁带葡萄板鸡蛋收集室，以避免让板脱落。请务必写上葡萄板底部重要的基因型和日期信息。
6. 颠覆鸡蛋收集室，让苍蝇在葡萄板产卵。
7. 将箱子或覆盖了鸡蛋收集室，并将其放置在25ºC的孵化器。
8. 允许苍蝇产卵4 - 6小时。
9. 通过采取葡萄板出了蛋收集室和转移苍蝇回到他们的食物瓶端集合。用铲子从葡萄板擦去多余酵母泥。商店葡萄板在培养箱较大的培养皿在25ºC为24〜小时。

2.将幼虫实验食品

1. 实验准备食物。
   注：此配方食品是基于布卢明顿股票中心食谱^18。重要的变化通过徘徊阶段的定时所评估包括增加酵母优化食物的营养价值的量（间112 - 25ºC蛋收集之后120小时）。虽然我们已经发现这个配方理想的健康和我们的实验幼虫发育，任何食物配方是与阳性和阴性对照，其实例在步骤3.10中列出可接受给出校准。
   1. 测量1600毫升蒸馏水。
   2. 混合134克玉米面，10.6克果蝇琼脂II型，以及一些水（〜500毫升）中的1L烧杯中。混合2分钟有电动打蛋机。
   3. 混合70克活活性干酵母，18.4克豆粉，84.8克麦芽提取物，和一些水（〜500毫升）中的另一个1升烧杯中。混合2分钟有电动打蛋机。
   4. 漩涡每个烧杯，倒入一个4升烧瓶中。使用剩余的水冲洗出烧杯并加入到烧瓶中。
   5. 测量140毫升光玉米糖浆，并加入到烧瓶中，纷飞混合。</ LI>
   6. 高压釜在121℃（250°F）在液体环境50分钟。
   7. 高压灭菌后，倒入食品成4升烧杯中，并使其冷却。用电动搅拌机混合帮助冷却过程。
   8. 一旦烧瓶冷却足以碰，添加8.8毫升丙酸和16.8毫升果蝇抗真菌剂/乙醇溶液。拌匀。 （通过添加380克果蝇抗真菌剂，以1升200标准乙醇，搅拌在一个温暖的板直至溶解，确保溶液不超过70ºC使果蝇抗真菌剂溶液）。
   9. 倾食品到小瓶直至食品是大约1英寸深，并允许在室温下冷却2 - 3小时。在25ºC插瓶，存放在一个孵化器。一个星期内使用。
2. 沉浸刮刀几次进食物的小瓶的顶层得分它。这将有助于幼虫洞穴和饲料。
3. 22 - 24小时后取卵有端，用小画笔收集大致相同尺寸的50一龄（L1）的幼虫。将幼虫在实验食物。清洁在实验室画笔擦拭，并确保有继续上到另一个基因型前的画笔没有剩余的幼虫。
4. 幼虫放入小瓶在25ºC的孵化器，并允许开发。

3.确定在幼虫脂肪含量

1. 准备解决方案。
   1. 准备1升10倍PBS股票。
      1. 80克氯化钠，2克的KCl，14.4克Na ₂ HPO _4，和2.4克KH ₂ PO ₄加入到800毫升水中在含有搅拌棒的2L烧杯中。无热搅拌，直到所有的盐引入。把pH值至7.4。增加体积至1L水。
   2. 准备2升1X PBS。添加200毫升10倍的PBS原液至1800毫升水中。
   3. 用1×PBS中的这个股票，使20％w / v的蔗糖。
2. 从取出幼虫的小瓶培养箱一旦有20 - 40幼虫徘徊小瓶的侧面（一般在鸡蛋集合后第五天）。记录测定的日期和时间，以及徘徊幼虫的数目。
3. 通过加入11.5毫升PBS中并9毫升20％蔗糖到50ml锥形管中制备试验溶液。
4. 20％蔗糖添加到小瓶直到0.5 - 来自小瓶的顶部1英寸。
5. 用刮刀轻轻挑起食物来自由幼虫顶层仍在食品挖洞。所有幼虫将上升到蔗糖溶液的表面上。
6. 使用镊子轻轻幼虫从步骤3.3转移到初始蔗糖浓度。
7. 用刮刀轻轻搅拌此溶液的幼虫。
8. 盖上锥形管和颠覆多次到解决方案充分混合。
9. 摘帽锥形管和漩涡营造一个温和的旋涡。
10. 允许幼虫定居，或者浮到溶液或SI的顶nking底部。等待2 - 5分钟幼虫定居。
    注意：如果仍有幼虫都没有绝对不是沉浮，挑一条线使用作为一个分界点标记幼虫无论是作为浮动或下沉。应用此同样的标准对所有的基因型。我们使用的角度在锥形管作为我们的边界。ADP或SIR2 ¹⁷突变幼虫的底部可以被用作阳性对照和lsd2 ¹⁹的突变体可以被用作用于测定的校准阴性对照。
11. 记录浮动幼虫数和测试的特定浓度。
12. 1毫升20％蔗糖添加到实验溶液，以增加其密度。
13. 重复步骤3.7至3.10。记录浮动幼虫数和这个新的浓度。
14. 继续步骤3.12和3.13直到幼虫的至少95％的浮动。
15. 使用镊子收集所有的幼虫放入盛有PBS解剖菜。
16. OBS显微镜及注意事项，如果有任何一个小幼虫，预蛹，蛹，或基因型之间的任何其他差异下ERVE幼虫。
    注：在理想情况下，所有的幼虫应该出现均匀，并在同一发育阶段。我们只观察到在这些条件下是一致的脂肪测量。
17. 记录幼虫的总数。
18. 使用镊子，10幼虫转移到实验室擦拭干。标签的离心管中，并放置10个幼虫在管。
19. 闪冻在液氮中的幼虫。在-20ºC储存管。

Representative Results

图1表示了如何基于浮力的测定可以在遗传操作的幼虫检测更高和更低的脂肪储存，例如， 图1A示出神经元的某些子集（E347）的幼虫大脑激励或沉默诱导较低和较高的脂肪分别商店。相同的遗传背景对照是在这两种情况下使用。 图1B提供了如何通过密度测定法获得的这种表型是由中性脂质提取和定量通过GCMS证实一个例子。

图1. 在幼虫大脑的特定区域神经元功能是必要的和足够的身体脂肪调节 。在指定的E347-GAL4行的神经元活动是由石^DN的过度沉默或由NB的过度活化，如在面板指示，并且进行了评估在体内脂肪的效果。（A）中漂浮的幼虫在不同密度溶液平衡的百分比。五幼虫每生物重复检查，N = 7 -每个基因型9生物学重复（B）身体脂肪百分比由GCMS ^17,20测量（总中性脂质包括三酰基甘油和磷脂按体重分频）（N = 8）。蓝线或条代表GAL4-只（无UAS）动物划线为w ^1118，以控制用于遗传背景的影响。的P值表示从双尾t检验的结果。 **** P <0.0001，*** p = 0.0001至0.001，** P = 0.001〜0.01，* P = 0.01〜0.05。误差棒显示SEM表示。这个数字已被修改^16。 请点击此处查看本图的放大版本。

Discussion

有很多已研究出一种测定脂质水平⁸技术众多^{- 10。}但是，上述每种方法带有由以上概述的基于浮力的测定法解决了一些重大的缺点。首先，这个实验非常快。测试一个完整的浓度梯度时间不超过30 - 60分钟。这是对目前使用的大部分技术的巨大改善。例如，通过质谱脂质定量需要7 - 9小时以分离脂质和另一个几个小时来分析它们。这是一个强大的威慑力上的大量动物进行画面时。通过测量一个快速的浮力表型，可以迅速集中在具有感兴趣的表型基因型。第二，密度测定法仅需要普通试剂如盐（PBS）和蔗糖。这使得它更容易和更便宜的筛选大量幼虫或快速测试一个有趣的基因型。最后，这个协议我S非侵入性的幼虫仍然活着底。这允许诸如特定脂质定量或转录物或蛋白质分析对动物进行进一步的实验。此外，回收的幼虫可能会被允许继续生长到成年。

这种技术比其他的一个额外的好处是增加了灵敏度，以在一个种群中脂肪含量的微小变化。通过在50幼虫群体进行整体的浓度梯度，在人群中脂肪水平轻微位移将由在中间浓度的变化来确定，虽然浓度在该幼虫开始浮动并且完全浮动可能并不比对照组不同。在人口这个小的移位可能并不总是被其它脂肪定量方法，因为它们需要大量组幼虫来分析鉴定。另一方面密度测定询问种群的个体，并且可以因此确定第ESE在总体人口分布的微小变化或变化。

作为这种技术依赖于溶液，以产生可靠的结果的密度，这是极为重要的是，PBS和蔗糖溶液始终如一制成。我们已经发现，不同的PBS食谱产生在溶液中的密度差别，从而导致不同的结果。我们使用上述获得一致的结果的配方。此外，从相同批次1×PBS中的使20％的蔗糖是重要的，因为它会导致在相同的背景溶液的密度。如果两种溶液分别进行，在PBS中浓度的微小变化可能带来额外的密度变量超出除了蔗糖与实验锥形瓶中。最后，蒸发可以是一个问题，因为随着时间的推移的解决方案将变得更加浓缩的水的蒸发。紧紧盖住瓶和每周重拍溶液因此重要的是，这样的实验解决方案保持一致。

在上述概述的步骤，有几种关键的步骤，如果改变，可能会导致由浮力测定不准确的结果。首先，转移到实验食物小瓶幼虫是相同的年龄是重要的。转移幼虫大小不同会导致在在执行浮力检测时间不同发育阶段的幼虫。此协议已被开发，以确定在游荡L3幼虫中脂肪水平的变化，并且不会对早期L3或预蛹或更高准确工作。早第三龄幼虫具有同时预蛹和蛹水槽即使在最高浓度下使用，以脂肪水平的独立地浮起的倾向。出于这个原因，在L1幼虫转移的年龄是至关重要的。同样地，在该小瓶是采取以执行浮力测定点是很重要的。为与上述相同的发育时间的原因，小瓶应仅采取时20 -40幼虫徘徊，以确保准确的密度测量。此外，L1的数目传送可能影响结果为好。在这个协议中使用的宽瓶让50幼虫没有发展竞争中吃。幼虫比这个转移一个更大的数字将导致食品的竞争，并可能影响脂肪量存储的独立基因型。

可能有这样的非常高的脂肪水平的基因型，大多数或所有的幼虫将漂浮在第一浓度。在这种情况下，该协议可以通过以获得人口密度分布的全谱减小起始溶液的浓度来进行修改。另一方面，特定的基因型可以是这样倾斜，没有幼虫在初始蔗糖浮动。在这种情况下，最初的步骤可以被省略，并且使用较高起始浓度。该测定是非常灵活的，并且可以进行修改，以更好地适应大范围的脂肪水平。我们建议使用控件如适当的野生型动物（用于遗传背景对照），阳性对照（建立脂肪突变体，如ADP或Sir2的^17），和阴性对照（公布贫突变体如lsd2 ^19）。适当使用该协议将允许集合今后检查，以确定代谢和肥胖倾向的新的监管机构。此外，该协议用于在任何领域的研究人员提供了一种简单的方法来测试他们的兴趣遗传操作是否导致在脂肪含量的变化，而不需要复杂的协议或昂贵的设备。该协议将有助于阐明遗传和肥胖之间的复杂关系。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50 ml Conical	Fisher	50-869-569