Summary
Nous présentons ici une méthode pour mesurer les niveaux de graisse organismales dans le troisième stade (L3) de stade larvaire de Drosophila melanogaster. Cette méthode exploite la densité relativement faible du tissu adipeux pour différencier les larves avec des réserves de graisse altérées. analyse basée sur Buoyancy est un outil précieux pour le dépistage rapide, reproductible et économique.
Introduction
Drosophila melanogaster a été utilisé pendant plus d' un siècle dans l'étude de la génétique et d' autres questions biologiques de base. Au cours des dernières décennies, il est devenu clair que la drosophile est un outil puissant dans l'étude de nombreuses maladies humaines. Comme 70 - 80% des gènes associés à des maladies humaines ont une mouche orthologue identifié : 1 - 4, Drosophila fournit un système encore traduisible simplifié dans lequel pour étudier les maladies complexes. Métabolisme en particulier, a bénéficié d'une telle étude. Non seulement la génétique du métabolisme bien conservés entre les mouches et les humains, mais les organes et types de cellules sont également très similaires 2,5. Par exemple, le corps gras des magasins de mouche deux triacylglycérides (TAG) et le glycogène, des fonctions analogues à celles effectuées dans le foie des mammifères et adipeux blanc tissu 6. En utilisant la drosophile comme modèle pour l' obésité humaine a considérablement amélioré notre compréhension des lipidesle métabolisme et la génétique de l' obésité 7. Le stade larvaire du développement est particulièrement utile pour l'étude de la ségrégation des éléments nutritifs pour le stockage ou l'utilisation car il est dédié à l'alimentation et le stockage de l'énergie pour être utilisé pendant la nymphose.
Actuellement, il existe de nombreuses méthodes quantitatives différentes de la détermination des niveaux de stockage de graisse chez la drosophile. La méthode la plus largement utilisée est le dosage colorimétrique couplé (CCA) 8,9. CCA a été développé pour la détermination des niveaux de TAG dans le sérum humain et fonctionne sur le principe que le glycérol libéré de l'épine dorsale de triglycérides va subir plusieurs réactions, entraînant finalement une réaction d'oxydoréduction couplé générant un produit coloré. Absorbance de longueurs d'onde spécifiques de la lumière est ensuite mesurée pour déterminer la quantité initiale de glycérol présent. Cependant, le glycérol peut également être libéré de mono- et diacylglycérides en plus de TAG et ne peut donc pas être une mesure précise de sTored graisse corporelle 9. En outre, le pigment de l' œil des mouches adultes écrasées peut interférer avec certaines lectures d'absorbance et compliquer les résultats 9,10. Par conséquent, l' ACC doit être accompagné et a été validée par chromatographie sur couche mince (TLC), ce qui permet la séparation de la plupart des familles de lipides qui peut être quantifiée par densitométrie 10,11. Cependant, certaines classes de lipides tels que les sterols ne peuvent pas être analysés et quantifiés doivent être 12 d' une manière différente. La spectrométrie de masse (MS) est un moyen précis pour quantifier toutes les classes de lipides majeurs cellulaires 12,13. Cependant, les procédures nécessaires à l'analyse par MS d'extraction des lipides sont à la fois la consommation de temps (le plus près d'une prise de journée complète) et coûteux. Nous présentons ici une méthode alternative pour déterminer rapidement et à moindre coût des niveaux de graisse organismal chez les larves L3 de Drosophila melanogaster.
La méthode présentée ci-dessous exploite la différence de densité entre le tissu adipeux et le tissu maigre. fa Mammaliant tissu a une densité d'environ 0,9 g / ml , 14 tandis que le muscle squelettique comme une masse volumique de 1,06 g / ml 15. Cette différence signifie que les animaux avec des magasins plus élevés de matières grasses auront une densité plus faible que les animaux avec des magasins inférieurs de graisse, ce qui leur permettra de flotter mieux dans une solution de densité fixe. Cette propriété permet de dépistage extrêmement rapide d'un grand nombre d'animaux tout en étant à la fois peu coûteux et non invasif. Analyse basée Flottabilité-a été utilisé à la fois pour confirmer les phénotypes de modifier les régulateurs connus des niveaux de graisse ainsi que pour identifier les nouveaux régulateurs génétiques et neurologiques de l' obésité 16,17.
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Protocol
1. Collecter des oeufs de mouches avec Génotype d'intérêt
NOTE: croix Idéal se composent de 150 mouches vierges et au moins 75 hommes. collections d'actions devraient se composer d'au moins 200 mouches.
- Préparer des plaques de raisin.
- Ajouter 37,5 g d'agar à 1,5 L d'eau distillée dans un 4 L flacon.
- Autoclave mélange eau / agar pendant 50 minutes à 121 ºC (250 ºF).
- Alors que l'eau / mélange agar est autoclavage, ajouter 50 g de saccharose à 500 ml de jus de raisin et remuer avec une barre d'agitation sur une plaque d'agitation chauffé jusqu'à ce que le saccharose est dissous.
- Eteignez le feu et continuez de remuer pour refroidir le jus de raisin / mélange de saccharose à moins de 70 ° C. Testez la température interne avec un thermomètre à alcool.
- Ajouter 3 g agent de Drosophila anti-fongique (par exemple, Tegosept) pour chauffer le jus de raisin / mélange de saccharose et mélanger pour dissoudre.
- Lorsque mélange eau / agar est hors de l'autoclave, laisser refroidir le ballon au toucher par tourbillonnement de temps en temps.
- Utiliser une pipette sérologique pour ajouter 8 - 10 ml du mélange de raisin sur le couvercle d'une petite boîte de Pétri (35 x 10 mm de style). Laisser le mélange à couronne supérieure à la hauteur des parois de couvercle pour former une forme convexe.
- Permettre aux plaques de raisin pour refroidir pendant 2 heures à température ambiante puis stocker dans un récipient hermétique à 4 ºC.
- Préparer la pâte de levure.
- Ajouter 6 ml de solution tampon phosphate (PBS) à 4 g de levure sèche actif en direct dans un tube conique de 50 ml et mélanger avec une spatule jusqu'à consistance lisse.
- levure de magasin coller à 4 ºC.
- Ajouter une petite cuillerée (environ 1/8 c) de pâte de levure au milieu d'une plaque de raisin. Lisser les bords rugueux avec une spatule.
- Placer des plaques de raisin dans un incubateur jusqu'à ce qu'ils aient atteint la température ambiante.
- Transfert mouches d'intérêt dans une plaque chambre de collecte d'œufs et le lieu de raisin with pâte de levure vers l'intérieur sur le dessus. Ruban plaque de raisin à la chambre de collecte des œufs pour éviter de laisser la plaque tomber. Assurez-vous d'écrire le génotype et la date des informations importantes sur le fond de la plaque de raisin.
- Upend la chambre de collecte des œufs pour permettre aux mouches pondent leurs œufs sur la plaque de raisin.
- Placez une boîte ou recouvrir la collection des chambres d'œufs et de les placer dans un incubateur à 25 ° C.
- Permettre aux mouches pondent des œufs pour 4-6 heures.
- Fin collection en prenant la plaque de raisin hors de la chambre de collecte d'œufs et de transférer les mouches de nouveau dans leur bouteille de nourriture. Utilisez une spatule pour essuyer la pâte de levure en excès de la plaque de raisin. Magasin plaque de raisin dans une boîte de Pétri plus grand dans un incubateur humidifié à 25 ° C pendant environ 24 heures.
2. Transfert Larves Experimental alimentaire
- Préparer la nourriture expérimentale.
NOTE: Cette recette alimentaire est basée sur le centre Bloomington stocks recette 18. Des changements importantscomprennent quantité de levure pour optimiser la valeur nutritive de la nourriture a augmenté comme évalué par le calendrier de la phase errante (entre 112-120 heures après la collecte des œufs à 25 ° C). Alors que nous avons trouvé cette recette idéale pour la santé et le développement de nos larves expérimentale, toute recette de nourriture est acceptable d'étalonnage donnée avec des contrôles positifs et négatifs, dont des exemples sont énumérés à l'étape 3.10.- Mesurer 1600 ml d'eau distillée.
- Mélangez 134 g farine de maïs, 10,6 g de Drosophila agar de type II et une partie de l'eau (~ 500 ml) dans un bêcher de 1 litre. Mélanger pendant 2 min avec un mélangeur à main motorisé.
- Mélanger 70 g de levure sèche active en direct, 18,4 g de farine de soja, 84,8 g d'extrait de malt, et un peu d'eau (~ 500 ml) dans un autre bécher de 1 L. Mélanger pendant 2 min avec un mélangeur à main motorisé.
- Agiter chaque bêcher et verser dans un flacon 4 L. Utiliser l'eau restante pour rincer les béchers et ajouter dans le flacon.
- Mesurer 140 ml de sirop de maïs léger et ajouter dans le ballon, mélanger par tourbillonnement. </ Li>
- Autoclave pendant 50 minutes à 121 ºC (250 ºF) dans le cadre de liquide.
- Après autoclavage, versez la nourriture dans un 4 L bêcher et laisser refroidir. Aide le processus de refroidissement par mélange avec un mélangeur à main motorisé.
- Une fois que le ballon a refroidi suffisamment pour toucher, ajouter 8,8 ml d'acide propionique et 16,8 ml de solution / agent éthanol anti-fongique drosophile. Bien mélanger. (Ajouter la solution d'agent anti-fongique Drosophila en ajoutant 380 g Drosophila agent anti-fongique à 1 200 L d' éthanol et la preuve d' agitation sur une plaque chaude jusqu'à dissolution, assurant que la solution ne dépasse pas 70 ° C.)
- Versez la nourriture dans des flacons jusqu'à ce que la nourriture est d'environ 1 pouce de profondeur et laisser refroidir à température ambiante pendant 2 - 3 h. Branchez flacons et stocker dans un incubateur à 25 ° C. Utiliser dans une semaine.
- Plongez une spatule à plusieurs reprises dans la couche supérieure de la fiole de nourriture pour le marquer. Cela aidera les larves à creuser et se nourrir.
- 22 - 24 heures après la collecte des œufs aended, utilisez un petit pinceau pour recueillir 50 premier stade (L1) des larves de la même taille approximative. Placer les larves dans la nourriture expérimentale. Nettoyer le pinceau sur un laboratoire lingette et veiller à ce qu'il n'y ait pas restants larves sur le pinceau avant de continuer à un autre génotype.
- Placez flacon de larves dans un incubateur à 25 ° C et laisser se développer.
3. Déterminer les niveaux de graisse dans Larves
- Préparer des solutions.
- Préparer 1 L 10x PBS stock.
- Ajouter 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, et 2,4 g KH 2 PO 4 à 800 ml d' eau dans un bêcher de 2 L contenant une barre d'agitation. Remuer sans chaleur jusqu'à ce que tous les sels sont incorporés. Amener le pH à 7,4. Augmenter le volume à 1 litre avec de l'eau.
- Préparer 2 L 1 x PBS. Ajouter 200 ml 10x PBS solution mère à 1800 ml d'eau.
- Utilisez ce stock de PBS 1x pour faire 20% p / v de saccharose.
- Préparer 1 L 10x PBS stock.
- Retirer le flacon de larves de laincubateur, une fois il y a 20 - 40 larves errant sur les côtés du flacon (généralement le cinquième jour après la collecte des œufs). Notez la date et l'heure de l'essai, ainsi que le nombre de larves errant.
- Préparer une solution expérimentale par addition de 11,5 ml de PBS et 9 ml de saccharose à 20% dans un tube conique de 50 ml.
- Ajouter 20% de saccharose dans le flacon jusqu'à ce qu'il soit de 0,5 à 1 pouce de la partie supérieure du flacon.
- Utilisez une spatule pour mélanger doucement la couche supérieure de la nourriture aux larves libres qui sont encore fouisseurs dans la nourriture. Toutes les larves se lèvera à la surface de la solution de saccharose.
- Utilisez une pince pour transférer doucement les larves dans la concentration initiale de saccharose de l'étape 3.3.
- Utilisez une spatule pour mélanger doucement les larves dans cette solution.
- Boucher le tube conique et upend plusieurs fois pour bien mélanger la solution.
- Déboucher le tube conique et agiter pour créer un tourbillon doux.
- Laisser les larves de régler, soit flottant au sommet de la solution ou sinking vers le bas. Attendre 2 - 5 min pour les larves de régler.
NOTE: S'il y a encore des larves qui ne sont pas définitivement flottant ou naufrage, choisir une ligne à utiliser comme point de coupure pour marquer les larves soit comme un flotteur ou une platine. Appliquer ce même critère pour tous les génotypes. Nous utilisons l'angle au fond du tube conique en tant que notre limite. Adp ou SIR2 17 larves mutant peut être utilisé comme témoin positif et Isd2 19 mutants peuvent être utilisés en tant que témoin négatif pour la calibration du dosage. - Notez le nombre de larves flottant et la concentration spécifique testée.
- Ajouter 1 ml 20% de saccharose à la solution expérimentale pour augmenter sa densité.
- Répétez les étapes 03.07 à 03.10. Notez le nombre de larves flottant et cette nouvelle concentration.
- Continuer les étapes 3,12 et 3,13 jusqu'à ce qu'au moins 95% des larves sont flottantes.
- Utilisez une pince pour recueillir toutes les larves dans un plat de dissection rempli de PBS.
- observe larves sous un microscope et note s'il y a des petites larves, pré-pupes, chrysalides, ou d'autres différences entre les génotypes.
NOTE: Dans l'idéal, toutes les larves doit apparaître homogène et au même stade de développement. Nous avons seulement observé des mesures de graisse cohérentes dans ces conditions. - Notez le nombre total de larves.
- En utilisant des pinces, transférer 10 larves à un laboratoire essuyez pour sécher. Etiqueter un tube à centrifuger et placer 10 larves dans le tube.
- Flash geler les larves dans de l'azote liquide. Conserver le tube à -20 ºC.
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Representative Results
La figure 1 représente un exemple de la façon dont le dosage à base de flottabilité peut détecter à la fois les réserves de graisse supérieures et inférieures dans les larves génétiquement manipulées. La figure 1A montre que l' excitation ou le silençage d'un certain sous - ensemble de neurones (E347) dans le cerveau des larves induit moins de gras et plus stocke respectivement. Le même contrôle d'arrière - plan génétique a été utilisé dans les deux cas. La figure 1B donne un exemple de ce phénotype obtenu par le dosage de la masse volumique est corroborée par l' extraction des lipides neutres et la quantification par CGSM.
Figure 1. Neuronal Fonction dans les régions spécifiques du cerveau larvaire est nécessaire et suffisante pour le règlement de graisse corporelle. L' activité neuronale dans la ligne E347-GAL4 indiquée a été réduit au silence par la surexpression de Shi DNOu activé par la surexpression du NB, comme il est indiqué dans les tableaux de bord et les effets sur la graisse corporelle ont été évalués. (A) Le pourcentage de larves flottant à l' équilibre dans des solutions différentes de densité. Cinquante larves ont été examinés par répétition biologique, n = 7 - 9 réplicats biologiques par génotype gras (B) du corps de pourcentage (total des lipides neutres , y compris triacylglycérides et phospholipides divisé par le poids corporel) tel que mesuré par GCMS 17,20 (n = 8).. Les lignes bleues ou barres représentent GAL4 uniquement (pas UAS) les animaux croisés pour w 1118 pour contrôler les effets des origines génétiques. les valeurs P représentent les résultats des tests t à deux queues. **** P <0,0001, *** P = 0,0001 à 0,001, ** p = 0,001 à 0,01, de * P = 0,01 à 0,05. Les barres d'erreur indiquent SEM. Ce chiffre a été modifié 16. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il existe une multitude de techniques qui ont été développées pour mesurer les niveaux de lipides 8-10. Cependant, chacun de ces procédés est fourni avec quelques inconvénients majeurs qui sont traités par le dosage à base de flottabilité décrit ci-dessus. Tout d'abord, cet essai est extrêmement rapide. Test d'un gradient de concentration complète prend pas plus de 30 - 60 min. Ceci est une énorme amélioration sur la plupart des techniques actuellement utilisées. Par exemple, des lipides par la quantification MS prend 7-9 heures pour isoler les lipides et encore plusieurs heures pour les analyser. Ceci est un puissant moyen de dissuasion lors de l'exécution d'un écran sur un grand nombre d'animaux. En mesurant une flottabilité phénotype rapide, on peut rapidement se concentrer sur les génotypes qui ont le phénotype d'intérêt. En second lieu, le dosage de la masse volumique ne nécessite que des réactifs usuels tels que les sels (pour PBS) et du saccharose. Cela le rend beaucoup plus facile et moins coûteux à l'écran un grand nombre de larves ou rapidement tester un génotype intéressant. Enfin, ce protocole is non-invasive et les larves sont encore en vie à la fin. Ceci permet une expérimentation plus poussée à réaliser sur les animaux tels que la quantification lipidique spécifique ou d'une transcription ou d'une analyse des protéines. En outre, les larves récupéré peut être autorisé à poursuivre la croissance à l'âge adulte.
Un avantage supplémentaire de cette technique par rapport aux autres est une sensibilité accrue à de petits changements dans les niveaux de graisse dans une population. En réalisant ensemble un gradient de concentration sur une population de 50 larves, de légères variations dans les taux de lipides de la population seront identifiés par une modification des concentrations intermédiaires, bien que la concentration à laquelle les larves commencent flottant et sont totalement flottés peuvent ne pas être différent de celui des contrôles . Ce petit changement dans la population ne peut pas toujours être identifié par d'autres méthodes de quantification des graisses car ils nécessitent un grand nombre de larves à analyser. Le dosage de la densité d'autre part, interroge les individus au sein de la population, et peut par conséquent identifier èmeese petits changements ou des changements dans la répartition globale de la population.
Comme cette technique repose sur la densité de la solution pour obtenir des résultats fiables, il est extrêmement important que le système de fourchettes et des solutions de saccharose sont réalisées de manière cohérente. Nous avons constaté que les différentes recettes PBS produisent des différences de densité de la solution, conduisant à des résultats variables. Nous utilisons la recette décrite ci-dessus pour obtenir des résultats cohérents. En outre, ce qui rend le saccharose à 20% à partir du même lot de 1 x PBS est importante car elle aboutit à la même densité de la solution de fond. Si les deux solutions ont été faites séparément, de légères variations dans la densité du PBS pourrait apporter à la variable de densité supplémentaire au-delà de l'addition de saccharose dans la fiole conique expérimentale. Enfin, l'évaporation peut être un problème, car au fil du temps, les solutions seront plus concentré avec l'évaporation de l'eau. Il est donc important de plafonner les bouteilles hermétiquement et de refaire la solution chaque semaine, alors que le expérimentalsolutions restent cohérentes.
Parmi les étapes décrites ci-dessus, il y a plusieurs étapes critiques que si elle est modifiée, pourraient entraîner des résultats inexacts par le test de flottabilité. Tout d'abord, il est important que les larves transféré dans le flacon alimentaire expérimental est le même âge. Transfert des larves qui varient en taille se traduira par des larves à différents stades de développement au moment du test de flottabilité est effectuée. Ce protocole a été mis au point pour déterminer les changements dans les niveaux de graisse dans l'errance des larves L3 et ne fonctionnera pas avec précision pour L3 précoce ou pré-pupes ou plus tard. Early troisième stade larvaire ont tendance à flotter indépendamment des niveaux de graisse tout en pré-pupes et pupes évier, même aux plus fortes concentrations utilisées. Pour cette raison, l'âge des larves L1 transférée est critique. De même, le point auquel le flacon est prélevé pour effectuer l'essai de flottabilité est importante. Pour les mêmes raisons temporelles de développement énoncés ci-dessus, les flacons doivent être prises que lorsque 20 -40 larves errent pour assurer des mesures précises de densité. En outre, le nombre de L1 transféré peuvent influer sur les résultats aussi bien. Les flacons larges utilisés dans ce protocole permettent 50 larves de manger sans concours au cours du développement. Un plus grand nombre de larves transférées que cela se traduira par la concurrence pour la nourriture et peut affecter la quantité de graisse stockée indépendante du génotype.
Il peut y avoir des génotypes avec de tels niveaux de graisse extrêmement élevés que la plupart ou la totalité des larves flottent à la première concentration. Dans ce cas, le protocole peut être modifié en diminuant la concentration de la solution de départ, afin d'obtenir un spectre complet de la répartition de la densité de population. D'autre part, un génotype spécifique peut être si maigre que ne larve flotte dans le sucrose initial. Dans ce cas, les premières étapes peuvent être omises et une concentration de départ plus élevé utilisé. Ce test est très flexible et peut être modifié pour mieux répondre à un large éventail de niveaux de graisse.Nous conseillons l'utilisation de contrôles tels que les animaux appropriés de type sauvage (contrôlées pour le fond génétique), les contrôles positifs (mutants de graisse établie, comme adp ou SIR2 17), et des contrôles négatifs (mutants maigres publiés tels que Isd2 19). L'utilisation appropriée de ce protocole permettra le dépistage futur des collections afin de déterminer de nouveaux régulateurs du métabolisme et de l'obésité prédisposition. En outre, ce protocole offre un moyen facile pour les chercheurs dans tous les domaines pour vérifier si leur manipulation génétique d'intérêt provoque un changement dans les niveaux de graisse, sans la nécessité de protocoles complexes ou des équipements coûteux. Ce protocole permettra d'élucider la relation complexe entre la génétique et l'obésité.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
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