Summary
यहाँ हम तीसरे instar (L3) ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लार्वा चरण में जीवधारी वसा के स्तर को मापने के लिए एक तरीका मौजूद है। इस विधि को बदल मोटी दुकानों के साथ लार्वा के बीच अंतर करने के लिए वसा ऊतकों की अपेक्षाकृत कम घनत्व का लाभ उठाते। उछाल आधारित विश्लेषण, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और किफायती जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर आनुवंशिकी और अन्य बुनियादी जैविक सवालों के अध्ययन में एक सदी से भी अधिक के लिए इस्तेमाल किया गया है। पिछले कुछ दशकों में, यह स्पष्ट हो गया है कि ड्रोसोफिला कई मानव रोगों के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण है। के रूप में 70 - मानव रोगों के साथ जुड़े जीन का 80% एक की पहचान की मक्खी ortholog 1 - 4, ड्रोसोफिला, जिसमें जटिल रोगों का अध्ययन करने के लिए एक सरल अभी तक अनुवाद प्रणाली प्रदान करता है। विशेष रूप से इस तरह के चयापचय अध्ययन से लाभ हुआ है। इतना ही नहीं चयापचय की आनुवंशिकी अच्छी तरह मक्खियों और मनुष्यों के बीच संरक्षित कर रहे हैं, लेकिन प्रासंगिक अंगों और सेल प्रकार भी बहुत समान 2,5 हैं। उदाहरण के लिए, मक्खी दुकानों दोनों triacylglycerides (टैग) और ग्लाइकोजन, कार्यों स्तनधारी जिगर और सफेद वसा ऊतकों 6 में प्रदर्शन उन के अनुरूप की वसा शरीर। ड्रोसोफिला मानव मोटापे के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग करना बेहद लिपिड की हमारी समझ में सुधार हुआ हैचयापचय और मोटापे 7 की आनुवंशिकी। विकास के लार्वा चरण के रूप में यह खिलाने के लिए समर्पित है और ऊर्जा का भंडारण pupariation दौरान इस्तेमाल किया जाएगा भंडारण या उपयोग करने के लिए पोषक तत्वों का अलगाव के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
वर्तमान में, वहाँ ड्रोसोफिला में वसा भंडारण स्तर को निर्धारित करने के लिए कई अलग अलग मात्रात्मक तरीके हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि मिलकर वर्णमिति परख (सीसीए) 8,9 है। सीसीए मानव सीरम में टैग का स्तर निर्धारित करने के लिए विकसित की है और आधार यह है कि ट्राइग्लिसराइड्स की रीढ़ की हड्डी से मुक्त ग्लिसरॉल कई प्रतिक्रियाओं से गुजरना होगा, अंततः एक redox युग्मित प्रतिक्रिया एक रंग उत्पाद पैदा करने में जिसके परिणामस्वरूप पर संचालित किया गया था। प्रकाश के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के absorbance तो ग्लिसरॉल वर्तमान की प्रारंभिक राशि का निर्धारण करने के लिए मापा जाता है। हालांकि, ग्लिसरॉल भी मोनो और टैग करने के अलावा diacylglycerides से मुक्त हो सकते हैं और इसलिए एस के एक सटीक उपाय नहीं हो सकताtored शरीर में वसा 9। इसके अलावा, कुचल वयस्क मक्खियों की आंख वर्णक कुछ absorbance रीडिंग के साथ हस्तक्षेप और परिणाम 9,10 जटिल हो सकता है। इसलिए, सीसीए के साथ और पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) है, जो सबसे लिपिड परिवारों की जुदाई कि डेन्टिसिटोमीटरी 10,11 द्वारा quantitated किया जा सकता है के लिए अनुमति देता है द्वारा मान्य किया जाना चाहिए। हालांकि, sterols जैसे कुछ लिपिड कक्षाएं विश्लेषण नहीं किया जा सकता है और एक अलग तरह 12 मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) प्रमुख सेलुलर लिपिड 12,13 के सभी वर्गों quantitate के लिए एक सही तरीका है। हालांकि, लिपिड निकासी एमएस द्वारा विश्लेषण करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं दोनों समय लेने (सबसे लेने के लिए लगभग एक पूरा दिन) और महंगी हैं। यहाँ हम एक वैकल्पिक तरीका जल्दी से और सस्ते ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की L3 लार्वा में जीवधारी वसा का स्तर निर्धारित करने के लिए उपस्थित थे।
नीचे प्रस्तुत विधि वसा ऊतक और दुबला ऊतक के बीच घनत्व में अंतर का लाभ उठाते। स्तनधारी एफएटी ऊतक 1.06 g / एमएल 15 के घनत्व के रूप में लगभग 0.9 ग्राम / मिलीलीटर 14 जबकि कंकाल की मांसपेशी के एक घनत्व है। इस अंतर का मतलब है कि वसा की अधिक दुकानों के साथ जानवरों जो उन्हें तय घनत्व की एक समाधान में बेहतर फ्लोट करने की अनुमति देगा वसा के निचले स्टोर, के साथ जानवरों की तुलना में कम घनत्व होगा। यह संपत्ति जानवरों जबकि दोनों सस्ती और गैर-आक्रामक जा रहा है की एक बड़ी संख्या के अत्यंत त्वरित जांच के लिए अनुमति देता है। उछाल के आधार पर विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से मोटापा 16,17 के नए आनुवंशिक और तंत्रिका संबंधी नियामकों की पहचान के रूप में वसा के स्तर के ज्ञात नियामकों फेरबदल के phenotypes पुष्टि करने के लिए दोनों का इस्तेमाल किया गया है।
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Protocol
1. ब्याज की जीनोटाइप के साथ मक्खियों से अंडे ले लीजिए
नोट: आदर्श पार 150 कुंवारी मक्खियों और कम से कम 75 पुरुषों से मिलकर बनता है। स्टॉक संग्रह में कम से कम 200 मक्खियों से मिलकर चाहिए।
- अंगूर की प्लेटें तैयार करें।
- एक 4 एल फ्लास्क में 1.5 एल आसुत जल को 37.5 ग्राम अगर जोड़ें।
- 121 डिग्री सेल्सियस (250 एफ) पर 50 मिनट के लिए आटोक्लेव पानी / अगर मिश्रण।
- जबकि पानी / अगर मिश्रण autoclaving है, 500 मिलीलीटर अंगूर का रस करने के लिए 50 ग्राम सूक्रोज जोड़ सकते हैं और एक गर्म हलचल प्लेट पर हलचल पट्टी के साथ हलचल जब तक सुक्रोज भंग कर रहा है।
- गर्मी बंद करें और 70 डिग्री सेल्सियस के नीचे करने के लिए अंगूर का रस / सुक्रोज मिश्रण को ठंडा करने के लिए सरगर्मी जारी है। परीक्षण एक शराब थर्मामीटर के साथ आंतरिक तापमान।
- 3 जी ड्रोसोफिला विरोधी कवक एजेंट (जैसे, Tegosept) अंगूर का रस / सुक्रोज मिश्रण को गर्म और भंग करने के लिए हलचल करने के लिए जोड़ें।
- जब पानी / अगर मिश्रण आटोक्लेव से बाहर है, कभी कभी कुप्पी घूमता द्वारा स्पर्श करने के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
- एक छोटा सा पेट्री प्लेट (35 x 10 मिमी शैली) के ढकने के लिए अंगूर मिश्रण के 10 मिलीलीटर - 8 जोड़ने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें। ढक्कन दीवारों की ऊंचाई एक उत्तल आकार बनाने के लिए अधिक से अधिक है मिश्रण की ताजपोशी के लिए अनुमति दें।
- अंगूर प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए शांत करने के लिए और फिर एक कंटेनर में स्टोर की अनुमति दें।
- खमीर पेस्ट तैयार करें।
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 4 जी को लाइव सक्रिय सूखे खमीर के लिए 6 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर समाधान (पीबीएस) जोड़ें और चिकनी जब तक एक रंग के साथ मिश्रण।
- स्टोर खमीर 4 डिग्री सेल्सियस पर पेस्ट करें।
- खमीर पेस्ट का एक छोटा सा टूकड़ा (लगभग 1/8 छोटा चम्मच) एक अंगूर थाली के बीच में जोड़े। एक रंग के साथ किसी न किसी किनारों के नीचे चिकनी।
- एक मशीन में अंगूर की प्लेटें प्लेस, जब तक वे परिवेश के तापमान पर पहुंच गया है।
- एक अंडा संग्रह कक्ष और जगह अंगूर प्लेट w में ब्याज की मक्खियों स्थानांतरणith खमीर पेस्ट शीर्ष पर अंदर की ओर का सामना करना पड़। अंडा संग्रह चैम्बर के लिए टेप अंगूर की थाली दे प्लेट बाहर गिर से बचने के लिए। अंगूर प्लेट के नीचे पर महत्वपूर्ण जीनोटाइप और तारीख की जानकारी के बारे में सुनिश्चित करें।
- समाप्त कर देना अंडा संग्रह कक्ष मक्खियों अंगूर थाली पर अंडे देना करने की अनुमति।
- एक बॉक्स की जगह या अंडा संग्रह कक्षों पर कवर और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में जगह है।
- 6 घंटा - मक्खियों 4 के लिए अंडे देना करने की अनुमति दें।
- अंडा संग्रह कक्ष से बाहर अंगूर की थाली ले रही है और मक्खियों भोजन के अपने बोतल में वापस स्थानांतरित द्वारा संग्रह समाप्त करें। अंगूर की थाली से किसी भी अतिरिक्त खमीर पेस्ट बंद पोंछने के लिए एक रंग का प्रयोग करें। एक बड़ा पेट्री ~ के लिए 24 घंटा 25 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में पकवान में स्टोर अंगूर थाली।
2. प्रायोगिक खाद्य स्थानांतरण लार्वा
- प्रयोगात्मक भोजन तैयार करें।
नोट: यह खाना नुस्खा ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र नुस्खा 18 पर आधारित है। महत्वपूर्ण परिवर्तनके रूप में मंच भटक के समय के द्वारा मूल्यांकन भोजन के पोषण का महत्व अनुकूलन करने के लिए खमीर की राशि बढ़ शामिल है (112 के बीच - 120 मानव संसाधन 25 डिग्री सेल्सियस पर अंडा संग्रह के बाद)। हम यह नुस्खा स्वास्थ्य और हमारे प्रयोगात्मक लार्वा के विकास के लिए आदर्श पाया है, जबकि किसी भी खाद्य नुस्खा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण, जिनमें से उदाहरण कदम 3.10 में सूचीबद्ध हैं के साथ स्वीकार्य दिया अंशांकन है।- 1600 मिलीलीटर उपाय आसुत जल।
- मिक्स 134 जी cornmeal, 10.6 छ ड्रोसोफिला अग्रवाल प्रकार द्वितीय, और एक 1 एल बीकर में पानी की कुछ (~ 500 मिलीलीटर)। एक मोटर चालित हाथ मिक्सर के साथ 2 मिनट के लिए ब्लेंड।
- 70 ग्राम लाइव सक्रिय सूखी खमीर, 18.4 ग्राम सोया आटा, 84.8 छ माल्ट निकालने, और एक अन्य 1 एल बीकर में पानी की कुछ (~ 500 मिलीलीटर) मिक्स। एक मोटर चालित हाथ मिक्सर के साथ 2 मिनट के लिए ब्लेंड।
- प्रत्येक बीकर भंवर और एक 4 एल कुप्पी में डाल देना। बीकर बाहर कुल्ला और फ्लास्क में जोड़ने के लिए शेष पानी का प्रयोग करें।
- उपाय 140 मिलीलीटर प्रकाश कॉर्न सिरप और फ्लास्क को जोड़ने के लिए, घूमता द्वारा मिश्रण। </ Li>
- तरल की स्थापना में 121 डिग्री सेल्सियस (250 एफ) पर 50 मिनट के लिए आटोक्लेव।
- autoclaving के बाद, एक 4 एल बीकर में भोजन डालना और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। एक मोटर चालित हाथ मिक्सर के साथ सम्मिश्रण से ठंडा करने की प्रक्रिया में मदद करें।
- एक बार जब कुप्पी को छूने के लिए पर्याप्त ठंडा हो गया है, 8.8 मिलीग्राम propionic एसिड और 16.8 मिलीलीटर ड्रोसोफिला विरोधी कवक एजेंट / इथेनॉल समाधान जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। (380 जी ड्रोसोफिला विरोधी कवक एजेंट एल 1 200 प्रमाण इथेनॉल जोड़ने और एक गर्म प्लेट जब तक भंग पर क्रियाशीलता, यकीन है कि समाधान 70 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है बनाकर ड्रोसोफिला विरोधी कवक एजेंट समाधान करें।)
- शीशियों में भोजन डालो जब तक भोजन लगभग 1 इंच गहरी है और 2 के लिए आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं - 3 घंटा। 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में शीशियों और दुकान प्लग। एक सप्ताह के भीतर का प्रयोग करें।
- एक रंग यह स्कोर करने के लिए भोजन की शीशी के ऊपर परत में कई बार उतर रही है। यह लार्वा बिल और खिलाने के लिए मदद मिलेगी।
- 22 - 24 घंटे के बाद अंडा संग्रह हैएंडेड, 50 प्रथम instar (एल 1) एक ही अनुमानित आकार के लार्वा इकट्ठा करने के लिए एक छोटे तूलिका का उपयोग करें। प्रयोगात्मक भोजन में लार्वा रखें। एक प्रयोगशाला पर तूलिका साफ साफ करने और यह सुनिश्चित करने के लिए एक और जीनोटाइप जारी रखने से पहले तूलिका पर कोई शेष लार्वा देखते हैं कि।
- लार्वा की शीशी 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में डाल दिया है और विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
3. लार्वा में वसा के स्तर का निर्धारण करते हैं
- समाधान तैयार करें।
- 1 एल 10x पीबीएस शेयर तैयार करें।
- एक 2 एल हलचल पट्टी युक्त बीकर में 800 मिलीलीटर पानी के लिए 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 2 जी KCl, 14.4 छ ना 2 HPO 4, और 2.4 जी एच 2 4 पीओ जोड़ें। कोई गर्मी के साथ हिलाओ जब तक सभी लवण शामिल कर रहे हैं। 7.4 पीएच को ले आओ। पानी के साथ 1 एल मात्रा बढ़ाएँ।
- 2 एल 1x पीबीएस तैयार करें। 1800 मिलीलीटर पानी के लिए 200 मिलीलीटर 10x पीबीएस शेयर समाधान जोड़ें।
- 1x पीबीएस के इस स्टॉक का उपयोग करने के लिए डब्ल्यू 20% / वी सुक्रोज।
- 1 एल 10x पीबीएस शेयर तैयार करें।
- से लार्वा की शीशी निकालें(आम तौर पर अंडे संग्रह के बाद पांचवें दिन) 40 लार्वा शीशी के पक्षों को भटक - इनक्यूबेटर एक बार 20 से देखते हैं। तारीख और परख के समय के साथ-साथ लार्वा भटक की संख्या रिकॉर्ड।
- एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 11.5 मिलीलीटर पीबीएस और 9 मिलीलीटर 20% सूक्रोज जोड़कर प्रयोगात्मक समाधान तैयार है।
- शीशी के लिए 20% सूक्रोज जोड़ने जब तक यह 0.5 है - शीशी के ऊपर से 1 इंच।
- एक रंग का उपयोग धीरे मुक्त करने के लार्वा को भोजन के ऊपर परत है कि अभी भी भोजन में burrowing रहे हैं हलचल। सभी लार्वा सूक्रोज समाधान की सतह को जन्म देगा।
- संदंश का प्रयोग धीरे 3.3 कदम से प्रारंभिक सुक्रोज एकाग्रता में लार्वा हस्तांतरण करने के लिए।
- एक रंग का उपयोग धीरे इस समाधान में लार्वा हलचल।
- शंक्वाकार ट्यूब टोपी और अच्छी तरह से समाधान मिश्रण करने के लिए कई बार समाप्त कर देना।
- शंक्वाकार ट्यूब खुलना और एक कोमल भंवर बनाने के लिए ज़ुल्फ़।
- लार्वा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, या तो समाधान या एसआई की चोटी पर चलनीचे करने के लिए nking। लार्वा व्यवस्थित करने के लिए 5 मिनट - 2 रुको।
नोट: यदि फिर भी लार्वा कि निश्चित रूप से या तो अस्थायी या डूब नहीं कर रहे हैं, या तो एक फ्लोटर या एक भार के रूप में लार्वा लेबल करने के लिए एक कटऑफ बिंदु के रूप में उपयोग करने के लिए एक लाइन उठाओ। सभी जीनोटाइप के लिए यह एक ही कसौटी लागू करें। हम अपनी सीमा। ADP या sir2 17 उत्परिवर्ती लार्वा के रूप में शंक्वाकार ट्यूब के नीचे एक सकारात्मक नियंत्रण और lsd2 19 म्यूटेंट परख की जांच के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है पर कोण का उपयोग करें। - चल लार्वा की संख्या और विशिष्ट एकाग्रता का परीक्षण रिकॉर्ड।
- प्रयोगात्मक समाधान के लिए 1 मिलीलीटर 20% सूक्रोज जोड़े इसकी घनत्व बढ़ाने के लिए।
- दोहराएँ 3.10 करने के लिए 3.7 के कदम। इस नए एकाग्रता चल लार्वा की संख्या और रिकॉर्ड।
- कदम जारी 3.12 और 3.13 लार्वा के कम से कम 95% चल रहे हैं जब तक।
- पीबीएस के साथ भरा एक विच्छेदन डिश में सभी लार्वा इकट्ठा करने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- ओ बीएसएक माइक्रोस्कोप और टिप्पणी किसी भी छोटे लार्वा, प्यूपा पूर्व, pupae, या जीनोटाइप के बीच किसी भी अन्य मतभेद हैं यदि तहत erve लार्वा।
नोट: आदर्श रूप में, सभी लार्वा सजातीय और एक ही विकास के चरण में दिखाई देनी चाहिए। हम केवल इन परिस्थितियों में लगातार वसा माप मनाया गया है। - लार्वा की कुल संख्या रिकॉर्ड।
- संदंश का प्रयोग, एक प्रयोगशाला के लिए 10 लार्वा हस्तांतरण करने के लिए सूखी पोंछे। एक microcentrifuge ट्यूब लेबल और ट्यूब में 10 लार्वा जगह है।
- फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में लार्वा फ्रीज। -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर।
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Representative Results
चित्रा 1 कैसे उछाल आधारित परख आनुवंशिक छेड़छाड़ लार्वा में दोनों उच्च और निम्न मोटी दुकानों का पता लगा सकते हैं का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 1 ए लार्वा दिमाग में है कि उत्तेजना या न्यूरॉन्स की एक निश्चित सबसेट (E347) का मुंह बंद करने से पता चलता लाती कम और उच्च वसा क्रमशः भंडार। एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि नियंत्रण दोनों ही मामलों में इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 1 बी कैसे इस phenotype घनत्व परख द्वारा प्राप्त तटस्थ लिपिड निष्कर्षण और GCMS द्वारा मात्रा का ठहराव ने पुष्टि की है की एक उदाहरण है।
चित्रा 1. लार्वा मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों में neuronal समारोह के लिए आवश्यक है और शरीर में फैट नियमन के लिए पर्याप्त है। संकेत E347-GAL4 लाइन में neuronal गतिविधि शि डी.एन. की overexpression से खामोश था, या, (ए) विभिन्न घनत्व समाधान में संतुलन पर लार्वा तैर का प्रतिशत एनबी की overexpression से सक्रिय रूप में पैनल में संकेत दिया है, और शरीर में वसा पर प्रभाव का मूल्यांकन किया गया।। पचास लार्वा जैविक को दोहराने के प्रति की जांच की गई, एन = 7 - 9 जीनोटाइप प्रति जैविक प्रतिकृति (बी) के शरीर में वसा प्रतिशत (triacylglycerides और फॉस्फोलिपिड शरीर के वजन से विभाजित सहित कुल तटस्थ लिपिड) के रूप में GCMS 17,20 से मापा (एन = 8)।। GAL4 केवल ब्लू लाइन या सलाखों प्रतिनिधित्व (कोई यूएएस) पशु डब्ल्यू 1118 को पार कर आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए। पी मूल्यों दो पूंछ टी परीक्षण से परिणाम दर्शाते हैं। **** पी <0.0001, *** पी = 0.001 करने के लिए 0.0001, ** पी = 0.001 0.01 करने के लिए, * पी = 0.05 को 0.01। त्रुटि सलाखों SEM दिखा। यह आंकड़ा 16 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
10 - वहाँ तकनीक है कि लिपिड स्तर को मापने के लिए विकसित किया गया है 8 के एक भीड़ हैं। हालांकि, इन तरीकों में से प्रत्येक के कुछ प्रमुख कमियां है कि उछाल आधारित परख ऊपर उल्लिखित से संबोधित कर रहे हैं के साथ आता है। सबसे पहले, इस परख बहुत जल्दी है। 60 मिनट - एक पूर्ण एकाग्रता ढाल का परीक्षण 30 से अधिक लेता है। यह वर्तमान में उपयोग में तकनीक के अधिकांश पर एक बड़ा सुधार है। लिपिड और एक अन्य कई घंटे को अलग-थलग करने के लिए उन्हें का विश्लेषण करने के लिए 9 घंटा - उदाहरण के लिए, एमएस द्वारा लिपिड quantitation 7 लेता है। यह एक मजबूत निवारक जब जानवरों की एक बड़ी संख्या पर एक स्क्रीन प्रदर्शन कर रहा है। एक त्वरित उछाल phenotype मापने के द्वारा, एक जल्दी जीनोटाइप ब्याज की phenotype है उस पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं। दूसरा, घनत्व परख ऐसे लवण (पीबीएस के लिए) और सुक्रोज के रूप में केवल आम अभिकर्मकों की आवश्यकता है। यह यह बहुत आसान और सस्ता लार्वा की एक बड़ी संख्या स्क्रीन या जल्दी से एक दिलचस्प जीनोटाइप परीक्षण करने के लिए बनाता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल मैंगैर-आक्रामक और लार्वा अंत में अभी भी जीवित हैं। यह आगे प्रयोग ऐसे विशिष्ट लिपिड quantitation या प्रतिलिपि या प्रोटीन विश्लेषण के रूप में पशुओं पर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बरामद लार्वा वयस्कता के विकास को जारी रखने की अनुमति दी जा सकती है।
दूसरों पर इस तकनीक का एक अतिरिक्त लाभ की आबादी में वसा के स्तर में छोटे परिवर्तन के प्रति संवेदनशीलता बढ़ जाती है। 50 लार्वा की आबादी पर एक पूरी एकाग्रता ढाल प्रदर्शन करके, जनसंख्या वसा के स्तर में मामूली परिवर्तन, मध्यवर्ती सांद्रता में एक परिवर्तन द्वारा की पहचान की जाएगी, हालांकि एकाग्रता, जिस पर लार्वा तैर शुरू करते हैं और पूरी तरह से जारी कर रहे हैं नियंत्रण से अलग नहीं किया जा सकता । जनसंख्या में यह छोटा सा बदलाव हमेशा अन्य वसा quantitation तरीकों से के रूप में वे लार्वा के एक बड़े समूह की आवश्यकता का विश्लेषण करने के लिए नहीं पहचाना जा सकता है। दूसरी ओर घनत्व परख आबादी के भीतर व्यक्तियों से पूछताछ और फलस्वरूप वीं की पहचान कर सकते हैंकुल जनसंख्या वितरण में छोटे परिवर्तन या बदलाव के ese।
इस तकनीक का समाधान विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन करने के घनत्व पर निर्भर करता है के रूप में, यह बेहद जरूरी है कि पीबीएस और सुक्रोज समाधान लगातार बना रहे हैं। हमने पाया है कि अलग अलग पीबीएस व्यंजनों समाधान घनत्व में मतभेद की उपज है, अलग-अलग परिणाम के लिए अग्रणी। हम नुस्खा अनुरूप परिणाम के लिए ऊपर उल्लिखित का उपयोग करें। इसके अलावा, 1x पीबीएस के एक ही बैच से 20% सूक्रोज बनाने महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एक ही पृष्ठभूमि समाधान घनत्व में परिणाम है। अगर दो समाधान अलग से किए गए थे, पीबीएस घनत्व में मामूली बदलाव प्रयोगात्मक शंक्वाकार शीशी सुक्रोज के अलावा परे अतिरिक्त घनत्व चर में ला सकता है। अन्त में, वाष्पीकरण, एक समस्या हो सकती है, क्योंकि समय के साथ समाधान पानी के वाष्पीकरण के साथ और अधिक केंद्रित हो जाएगा। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कसकर बोतलों टोपी और हर हफ्ते समाधान रीमेक के लिए इतना है कि प्रयोगात्मकसमाधान लगातार बने हुए हैं।
ऊपर उल्लिखित कदम के अलावा, वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि अगर बदल दिया, उछाल परख द्वारा गलत परिणाम में परिणाम हो सकता है। सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि लार्वा प्रयोगात्मक भोजन शीशी में स्थानांतरित कर एक ही उम्र हो। स्थानांतरित करने के लार्वा कि आकार में भिन्न समय उछाल परख प्रदर्शन किया है पर विभिन्न विकासात्मक चरणों में लार्वा में परिणाम होगा। इस प्रोटोकॉल L3 लार्वा भटक में वसा के स्तर में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है और जल्दी L3 या पूर्व या बाद में pupae के लिए सही काम नहीं करेगा। प्रारंभिक तीसरे instar लार्वा जबकि पूर्व pupae और यहां तक कि उच्चतम सांद्रता में pupae सिंक इस्तेमाल किया वसा के स्तर की स्वतंत्र रूप से नाव की प्रवृत्ति है। इस कारण से, एल 1 लार्वा का तबादला वर्ष की आयु महत्वपूर्ण है। इसी तरह, जिस पर बिंदु शीशी उछाल परख प्रदर्शन करने के लिए लिया जाता है महत्वपूर्ण है। एक ही समय विकासात्मक ऊपर कहा कारणों के लिए, शीशियों ही लिया जाना चाहिए जब 20 -40 लार्वा सटीक घनत्व माप सुनिश्चित करने के लिए भटक रहे हैं। इसके अतिरिक्त, एल 1 की संख्या के रूप में अच्छी तरह से परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं स्थानांतरित कर दिया। विस्तृत इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल शीशियों 50 लार्वा विकास के दौरान प्रतियोगिता के बिना खाने के लिए अनुमति देते हैं। लार्वा की एक बहुत बड़ी संख्या इस से स्थानांतरित कर भोजन के लिए प्रतियोगिता का परिणाम देगा और वसा की मात्रा जीनोटाइप के स्वतंत्र संग्रहीत प्रभावित कर सकता है।
वहाँ है कि ज्यादातर या लार्वा के सभी पहले एकाग्रता में जारी करेगी ऐसी अत्यंत उच्च वसा के स्तर के साथ जीनोटाइप हो सकता है। इस मामले में, प्रोटोकॉल आदेश जनसंख्या घनत्व वितरण की एक पूरी स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए शुरू कर समाधान की एकाग्रता कम से संशोधित किया जा सकता है। दूसरी ओर, एक विशिष्ट जीनोटाइप इसलिए दुबला है कि कोई लार्वा प्रारंभिक सुक्रोज में तैरता हो सकता है। इस मामले में, प्रारंभिक कदम हटाया जा सकता है और एक उच्च प्रारंभिक एकाग्रता का इस्तेमाल किया। इस परख बहुत लचीला है और बेहतर वसा के स्तर की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।हम इस तरह के उचित जंगली प्रकार के पशुओं (आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए नियंत्रित), (जैसे ADP या Sir2 17 के रूप में स्थापित वसा म्यूटेंट,) सकारात्मक नियंत्रण, और नकारात्मक नियंत्रण (जैसे lsd2 19 के रूप में प्रकाशित दुबला म्यूटेंट) के रूप में नियंत्रण के उपयोग की सलाह। इस प्रोटोकॉल के उचित उपयोग संग्रह के भविष्य स्क्रीनिंग चयापचय और मोटापे गड़बड़ी के नए नियामकों निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल है कि क्या उनके हित के आनुवंशिक हेरफेर, वसा के स्तर में परिवर्तन का कारण बनता जटिल प्रोटोकॉल या महंगे उपकरण की आवश्यकता के बिना परीक्षण करने के लिए किसी भी क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल आनुवंशिकी और मोटापे के बीच जटिल संबंधों को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | VWR | 214030 | |
| Welch's Original 100% Grape Juice | |||
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Ethanol | 200 proof | ||
| Baker's yeast | Fleichmann's | ||
| Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Malt Extract | Breiss | 5748 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
| Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
| Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
| 35 x 10 mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
| 50 ml Conical | Fisher | 50-869-569 |
References
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