En Oppdrift-basert metode for å bestemme fettnivåer i Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54744

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kelsey E. Hazegh¹, Tânia Reis¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, and Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Her presenterer vi en metode for å måle organismefettnivåer i tredje stadium (L3) larvestadiet av bananflue. Denne fremgangsmåte utnytter den forholdsvis lave tetthet av fettvev for å skille mellom larver med endrede fettlagre. Oppdrift basert analyse er et verdifullt verktøy for rask, reproduserbar og økonomisk screening.

Introduction

Drosophila melanogaster har blitt brukt i over et århundre i studiet av genetikk og andre grunnleggende biologiske spørsmål. I de siste tiårene har det blitt klart at Drosophila er et kraftig verktøy i studiet av mange menneskelige sykdommer. Som 70 - 80% av gener assosiert med humane sykdommer har en identifisert fly ortolog ^{til 1 - 4,} gir Drosophila en forenklet, men translater system for å studere komplekse sykdommer. Metabolisme spesielt har dratt nytte av en slik studie. Ikke bare er genetikk av stoffskiftet godt konservert mellom fluer og mennesker, men de aktuelle organer og celletyper er også svært lik ^2,5. For eksempel, fettet kroppen av flue butikkene begge triacylglycerides (TAG) og glykogen, funksjoner som er analoge med de som er utført i pattedyrs lever og hvite fettvev ^6. Ved hjelp av Drosophila som en modell for menneskelig fedme er vesentlig forbedret vår forståelse av lipidmetabolisme og genetikk av fedme ^7. Larveutviklingstrinn er spesielt nyttig for å studere segregering av næringsstoffer til lagring eller anvendelse som den er dedikert til mating og lagring av energi som skal brukes under pupariation.

For tiden er det mange forskjellige kvantitative metoder for å bestemme fettlagringsnivåer i Drosophila. Den mest brukte metoden er koplet kolorimetrisk analyse (CCA) ^8,9. CCA ble utviklet for å bestemme Tags nivåer i humant serum og opererer på den forutsetning at glyserol frigjort fra ryggraden av triglyserider vil gjennomgå en rekke reaksjoner, til slutt resulterer i en redox-reaksjon koblet generering av et farget produkt. Absorbansen av bestemte bølgelengder av lys måles så for å bestemme den initiale mengden av glycerol tilstede. Imidlertid kan glyserol også bli frigjort fra mono- og diacylglycerides i tillegg til TAG og kan derfor ikke være et nøyaktig mål på stored kroppsfett ^9. Videre kan øye pigment av knust voksne fluer forstyrre enkelte avlesninger og komplisere resultater ^9,10. Derfor CCA må ledsages og validert ved tynnsjiktskromatografi (TLC), som tillater separasjon av de fleste familier lipid som kan bli kvantifisert ved densitometri ^10,11. Men kan noen lipidklasser som steroler ikke bli analysert og må tallfestes en annen måte ^12. Massespektrometri (MS) er en nøyaktig måte å kvantifisere alle klasser av store cellulære lipider ^12,13. Imidlertid lipid ekstraksjon prosedyrer som er nødvendige for å analysere med MS er både tidkrevende (mest tar nesten en hel dag) og kostbare. Her presenterer vi en alternativ metode for å raskt og billig bestemme organismefettinnhold i L3 larver av bananflue.

Fremgangsmåten som presenteres nedenfor utnytter forskjellen i densitet mellom fettvev og magert vev. pattedyr fat vev har en tetthet på ca. 0,9 g / ml, ¹⁴ mens skjelettmuskulatur som en densitet på 1,06 g / ml ^15. Denne forskjellen gjør at dyr med høyere lagre av fett vil ha lavere densitet enn dyr med lavere lagre av fett, som vil tillate dem å flyte bedre i en oppløsning av fast tetthet. Denne egenskapen gir svært rask screening av et stort antall dyr som samtidig er både billig og ikke-invasiv. Oppdrift basert analyse har blitt brukt både for å bekrefte fenotyper av å endre kjente regulatorer av fettnivåer samt å identifisere nye genetiske og nevrologiske regulatorer av fedme ^16,17.

Protocol

1. Samle egg fra Flies med genotyper av interesse

MERK: Ideell kors består av 150 jomfru fluer og minst 75 hanner. Aksje samlinger bør bestå av minst 200 fluer.

1. Forbered drue plater.
   1. Legg 37,5 g agar til 1,5 liter destillert vann i en 4 liters kolbe.
   2. Autoklav vann / agar blanding i 50 min ved 121 ºC (250 ºF).
   3. Mens vann / agar mix er autoklave, tilsett 50 g sukrose til 500 ml druesaft og rør med en rørepinne på et oppvarmet rør plate før sukrose er oppløst.
   4. Slå av varmen og fortsett omrøring for å kjøle druesaft / sukrose blandingen til under 70 ºC. Test den indre temperatur med en alkohol termometer.
   5. Tilsett 3 g Drosophila anti-sopp middel (f.eks Tegosept) for å varme druesaft / sukrose blandingen og rør til å oppløse.
   6. Når vann / agar blanding er ute av autoklaven, la flasken avkjøles til touch ved å svinge av og til.
   7. Bruk en serologisk pipette for å legge til 8 - 10 ml av drue blandingen til lokket av en liten petriskål (35 x 10 mm stil). Tillat blandingen å krone høyere enn høyden av lokkets vegger for å danne en konveks form.
   8. Tillat drue platene avkjøles i 2 timer ved romtemperatur og deretter lagre i en lufttett beholder ved 4 ºC.
2. Forbered gjær lime.
   1. Tilsett 6 ml fosfatbufferløsning (PBS) til 4 g levende aktiv tørrgjær i en 50 ml konisk rør og blandes med en spatel inntil jevn.
   2. Oppbevares gjær lime ved 4 ºC.
3. Legge til en liten porsjon (ca. 1/8 ts) av gjærpasta til midten av en plate drue. Glatt ned eventuelle grove kantene med en slikkepott.
4. Plasser drue plater i en inkubator inntil de har nådd omgivelsestemperatur.
5. Overfør fluer av interesse i et egg samling kammer og plass drue plate wed gjær lim vender innover på toppen. Tape drue plate til egget oppsamlingskammeret for å unngå å la platen falle ut. Sørg for å skrive viktig genotype og oppdatert informasjon på bunnen av druen plate.
6. Upend egg samling kammeret slik at fluene å legge egg på druen plate.
7. Plasser en boks eller dekke over egg samling kamre og plassere dem i en inkubator ved 25 ºC.
8. Tillat fluer å legge egg for 4-6 timer.
9. Avslutt samlingen ved å ta drue plate ut av egget oppsamlingskammeret og overføre fluene tilbake til sin flaske med mat. Bruk en slikkepott til å tørke av overflødig gjær lim fra drue plate. Oppbevares drue plate i en større petriskål i en fuktet inkubator ved 25 ºC for ~ 24 timer.

2. Overføring Larvene til Experimental Mat

1. Forbered eksperimentell mat.
   MERK: Denne maten oppskriften er basert på Bloomington lager senteret oppskrift ^18. viktige endringerinkluderer økt mengde gjær for å optimalisere den ernæringsmessige verdien av maten som vurderes ved tidspunktet for vandrende scenen (mellom 112-120 timer etter egg samling ved 25 ºC). Mens vi har funnet denne oppskriften perfekt for helse og utvikling av våre eksperimentelle larver, er noe mat oppskrift akseptabelt gitt kalibrering med positive og negative kontroller, eksempler som er oppført i trinn 3.10.
   1. Mål 1600 ml destillert vann.
   2. Bland 134 g maismel, 10,6 g Drosophila Agar type II, og noe av vannet (~ 500 ml) i en 1-liters begerglass. Bland i 2 min med en motorisert hånd blandebatteri.
   3. Bland 70 g levende aktiv tørrgjær, 18,4 g soyamel, 84,8 g maltekstrakt, og noe av vannet (~ 500 ml) i en annen 1 liter begerglass. Bland i 2 min med en motorisert hånd blandebatteri.
   4. Swirl hver beger og hell i en 4 liters kolbe. Bruk gjenværende vann til å skylle ut begrene og legge inn i kolben.
   5. Mål 140 ml lys sirup og legge til kolben, bland ved å svinge. </ Li>
   6. Autoklav i 50 minutter ved 121 ° C (250 ° F) i den flytende omgivelser.
   7. Etter autoklave, hell mat til en 4 L beger og avkjøl. Hjelp kjøleprosessen ved å blande med en motorisert hånd blandebatteri.
   8. Når flasken er avkjølt nok til å røre, tilsett 8,8 ml propionsyre og 16,8 ml Drosophila anti-sopp middel / etanol løsning. Bland godt. (Gjør Drosophila anti-sopp middel løsning ved å tilsette 380 g Drosophila anti-sopp middel til en L 200 etanol og røring på en varm plate til det er oppløst, noe som gjør at løsningen ikke overstiger 70 ºC.)
   9. Hell mat i ampuller før maten er omtrent en tomme dypt og la den avkjøles i romtemperatur i 2-3 timer. Plugg hetteglass og oppbevar i en inkubator ved 25 ºC. Brukes innen en uke.
2. Kast deg en slikkepott flere ganger i det øverste laget av hetteglasset med mat å score det. Dette vil bidra til larvene å hule og mate.
3. 22 - 24 timer etter egg samling harended, bruk en liten pensel til å samle inn 50 første stadium (L1) larver av omtrent samme størrelse. Plasser larver i den eksperimentelle mat. Rengjør pensel på et laboratorium tørke og sikre at det er ingen gjenværende larver på pensel før du fortsetter til en annen genotype.
4. Plasser ampulle av larver i en inkubator ved 25 ° C og tillates å utvikle seg.

3. Bestem fettnivåer i Larver

1. Forbered løsninger.
   1. Forbered en L 10x PBS lager.
      1. Legg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na HPO _{2 til 4,} og 2,4 g KH _{2PO 4 til 800} ml vann i en 2 liters beger inneholdende en rørestav. Rør uten varme til alle salter er innarbeidet. Bringe pH til 7,4. Øke volumet til en L med vann.
   2. Forbered to L 1x PBS. Tilsett 200 ml 10x PBS stamløsning til 1800 ml vann.
   3. Bruk denne bestanden av 1x PBS for å gjøre 20% vekt / volum sukrose.
2. Ta hetteglasset med larver frainkubator når det er 20 - 40 larver vandrende opp sidene av hetteglasset (vanligvis på den femte dagen etter egg samlinger). Noter dato og klokkeslett for analysen samt antall vandrende larver.
3. Fremstille eksperimentell oppløsning ved tilsetning av 11,5 ml PBS og 9 ml 20% sukrose til et 50 ml konisk rør.
4. Tilsett 20% sukrose til hetteglasset inntil det er 0,5 til 1 tomme fra toppen av hetteglasset.
5. Bruk en slikkepott til å forsiktig røre opp det øverste laget av mat til gratis larver som fortsatt gravende i maten. Alle larver vil stige til overflaten av sukrose-løsning.
6. Bruk pinsett ved forsiktig å overføre larvene til utgangs sukrosekonsentrasjon fra trinn 3.3.
7. Bruk en slikkepott til å forsiktig røre larvene i denne løsningen.
8. Cap den koniske rør og upend flere ganger for å grundig blande oppløsningen.
9. Slipp ut konisk rør og virvle å skape en mild vortex.
10. Tillat larvene til å sedimentere, enten flyter opp til toppen av oppløsningen eller sinking til bunnen. Vent 2-5 min for larvene å bosette seg.
    MERK: Hvis det fortsatt er larver som ikke er definitivt enten flytende eller synkende, plukke en linje for å bruke som en cutoff poeng å merke larvene som enten en floater eller et søkke. Bruk denne samme kriteriet til alle genotyper. Vi bruker vinkelen på bunnen av det koniske rør som vår grense. Adp eller SIR2 ¹⁷ mutant larver kan bli anvendt som en positiv kontroll og lsd2 ¹⁹ mutanter kan bli anvendt som en negativ kontroll for kalibrering av analysen.
11. Registrere antall flytende larver og den spesifikke konsentrasjonen testet.
12. Tilsett 1 ml 20% sukrose til den eksperimentelle løsning for å øke dens densitet.
13. Gjenta trinn 03.07 til 03.10. Registrere antall flytende larver og denne nye konsentrasjon.
14. Fortsett trinn 3,12 og 3,13 inntil minst 95% av larvene er flytende.
15. Bruk pinsett til å samle alle larver i en disseksjon tallerken fylt med PBS.
16. ObsErve larver under et mikroskop og notat om det er noen små larver, pre-puppe, puppe, eller andre forskjeller mellom genotyper.
    MERK: Ideelt sett bør alle larver synes homogen, og på samme utviklingsstadiet. Vi har bare observert konsistente fett målinger under disse betingelser.
17. Ta opp det totale antall larver.
18. Bruk pinsett, overføre 10 larver til et laboratorium tørke tørke. Merk en mikro tube og plassere 10 larver i røret.
19. Flash fryse larvene i flytende nitrogen. Oppbevar rør ved -20 ºC.

Representative Results

Figur 1 representerer et eksempel på hvordan den oppdrift-baserte analysen kan detektere både høyere og lavere fettlagre i genetisk manipulert larver. Figur 1A viser at eksitasjon eller stanse av en bestemt undergruppe av nevroner (E347) i larve hjernen induserer lavere og høyere fett butikker henholdsvis. Den samme genetisk bakgrunn kontroll ble benyttet i begge tilfeller. Figur 1B viser et eksempel på hvordan denne fenotype erholdt ved tetthet assay det bekreftes av nøytralt lipid ekstraksjon og kvantifisering av GCMS.

Figur 1. Neuronal funksjon i spesifikke områder av larve Brain er nødvendig og tilstrekkelig for Body Fat forordning. Neuronal aktivitet i den angitte E347-GAL4 linjen ble brakt til taushet av overekspresjon av Shi ^DNEller aktivert ved overekspresjon av NB, som angitt i panelene, og effekter på kroppsfett ble vurdert. (A) Prosent av flytende larver ved likevekt Oppløsnings forskjellige tetthet. Femti larver ble undersøkt pr biologisk replikere, n = 7 - 9 biologiske replikater pr genotype (B) Prosent kroppsfett (totalt nøytrale lipider inkludert triacylglycerides og fosfolipider dividert med kroppsvekt), som målt ved GCMS ^17,20 (n = 8).. Blå linjer eller stolper representerer GAL4-bare (ingen UAS) dyr krysset til w ¹¹¹⁸ for å kontrollere for effekten av genetisk bakgrunn. P-verdiene representerer resultater fra to-tailed t-tester. **** P <0,0001, *** P = 0,0001 til 0,001, ** P = 0,001 til 0,01, * P = 0,01 til 0,05. Feilsøylene viser SEM. Dette tallet har blitt endret ^16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Det finnes et mangfold av teknikker som er utviklet for å måle lipid nivåer ^8-10. Men hver av disse metodene kommer med noen store ulemper som er adressert av oppdrifts-baserte analysen beskrevet ovenfor. For det første er denne analysen ekstremt rask. Teste en full konsentrasjon gradient tar ikke mer enn 30 - 60 min. Dette er en stor forbedring på de fleste av de teknikker som er i bruk. For eksempel, lipid kvantitering ved MS tar 7 - 9 timer for å isolere lipider og ytterligere flere timer for å analysere dem. Dette er en sterk avskrekkende ved utføring av en skjerm på et stort antall dyr. Ved å måle en rask oppdrift fenotype, kan man raskt fokusere på de genotypene som har fenotype av interesse. For det andre krever tetthet analysen bare vanlige reagenser slik som salter (for PBS) og sukrose. Dette gjør det mye enklere og billigere å screene et stort antall larver eller raskt teste en interessant genotype. Til slutt, denne protokollen is non-invasiv og larvene er fortsatt i live på slutten. Dette tillater videre eksperimentering som skal utføres på de dyr som bestemt lipid kvantifisering eller transkript eller proteinanalyse. I tillegg kan utvinnes larver få lov til å fortsette veksten til voksenlivet.

En ytterligere fordel med denne teknikken fremfor andre blir øket følsomhet for små endringer i fettnivået i en populasjon. Ved å utføre en hel konsentrasjonsgradient på en befolkning på 50 larver, vil små endringer i populasjonen fettnivåer bli identifisert ved en endring i de mellomliggende konsentrasjoner, selv om den konsentrasjon ved hvilken larvene begynne flytende og er helt fløt ikke kan være annerledes enn kontrollene . Denne lille endring i populasjonen kan ikke alltid bli identifisert med andre fett kvantiteringsstandarder metoder som de krever en stor gruppe av larver til å analysere. Tettheten assay på den annen side utspør individer i populasjonen og kan følgelig identifisere these små endringer eller endringer i den generelle befolkningen distribusjon.

Da denne teknikken er avhengig av tettheten av løsningen for å fremstille pålitelige resultater, er det svært viktig at PBS og sukrose-løsninger er gjort gjennomgående. Vi har funnet at forskjellige PBS oppskrifter frembringe forskjeller i oppløsning tetthet, noe som fører til varierende resultater. Vi bruker oppskriften som er beskrevet ovenfor for konsistente resultater. Videre, noe som gjør 20% sukrose fra den samme batch av 1 x PBS er viktig fordi det resulterer i samme bakgrunn løsningens tetthet. Dersom de to løsningene ble laget separat, kan små variasjoner i PBS tetthet bringe i ytterligere variabel tetthet utover tilsetning av sukrose til den eksperimentelle koniske hetteglasset. Til slutt kan fordampning være et problem, fordi det over tid løsningene vil bli mer konsentrert med fordampning av vann. Det er derfor viktig å cap flaskene tett og å remake løsningen hver uke, slik at den eksperimentelleløsninger være konsekvent.

Blant fremgangsmåten ovenfor, er det flere viktige skritt at hvis forandret, kan føre til unøyaktige resultater ved oppdriften analysen. For det første er det viktig at larvene overført til den eksperimentelle mat hetteglasset være den samme alder. Overføring av larver som varierer i størrelse vil resultere i larver på forskjellige utviklingsstadier på tidspunktet oppdrifts Analysen utføres. Denne protokollen er utviklet for å bestemme endringer i fettinnhold i vandrende L3 larver og vil ikke arbeide nøyaktig for tidlig L3 eller pre-puppe eller senere. Tidlig tredje stadium larver har en tendens til å flyte uavhengig av fettinnhold, mens pre-puppe og pupper vask selv ved de høyeste konsentrasjonene brukt. Av denne grunn, er alderen på L1 larver overført kritisk. Tilsvarende er det punkt ved hvilket glasset blir tatt for å utføre oppdrifts analysen viktig. For de samme utviklingsmessige timing grunnene nevnt ovenfor, skal hetteglassene tas bare når 20 -40 larvene vandrer for å sikre målinger nøyaktige tetthet. I tillegg er antallet L1 overføres kan påvirke resultatene i tillegg. De brede hetteglass som brukes i denne protokollen tillater 50 larver å spise uten konkurranse under utvikling. En mye større antall larver overført enn dette vil føre til konkurranse om mat og kan påvirke mengden av fett lagret uavhengig av genotype.

Det kan være genotyper med slike ekstremt høye fettinnhold at de fleste eller alle larvene vil flyte på den første konsentrasjonen. I dette tilfelle kan protokollen modifiseres ved å nedsette konsentrasjonen av utgangs-løsning for å oppnå et fullstendig spektrum av befolkningstetthet fordeling av. På den annen side kan en bestemt genotype være så tynn at ingen larver flyter i den første sukrose. I dette tilfelle kan de første trinnene utelates og en høyere utgangskonsentrasjon anvendes. Denne analysen er meget fleksibel og kan modifiseres for å bedre passe et bredt spekter av fettnivåer.Vi anbefaler bruk av kontroller som passende villtype dyr (kontrollert for genetisk bakgrunn), positive kontroller (etablert fett mutanter, slik som ADP eller SIR2 ¹⁷⁾ og negative kontroller (publisert magre mutanter som lsd2 ^19). Riktig bruk av denne protokollen vil tillate fremtidig screening av samlingene for å bestemme nye regulatorer av stoffskiftet og fedme predisposisjon. Videre tilveiebringer denne protokollen en enkel måte for forskere på alle felt å teste hvorvidt deres genetisk manipulering av interesse forårsaker en forandring i fettinnhold, uten behov for kompliserte protokoller eller kostbart utstyr. Denne protokollen vil bidra til å belyse det komplekse forholdet mellom genetikk og fedme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50 ml Conical	Fisher	50-869-569