En Flytkraft-baserad metod för att bestämma fettnivåer i Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54744

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kelsey E. Hazegh¹, Tânia Reis¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, and Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Här presenterar vi en metod för att mäta organismfettnivåer i tredje stadiet (L3) larvstadiet av Drosophila melanogaster. Denna metod utnyttjar jämförelsevis låg densitet av fettvävnad att skilja mellan larver med förändrade fettdepåer. Flytkraft baserad analys är ett värdefullt verktyg för snabb, reproducerbar och ekonomisk screening.

Introduction

Drosophila melanogaster har använts i över ett sekel i studiet av genetik och andra grundläggande biologiska frågor. Under de senaste decennierna har det blivit tydligt att Drosophila är ett kraftfullt verktyg i studiet av många mänskliga sjukdomar. Som 70 - 80% av gener associerade med humana sjukdomar har en identifierad fly ortolog ^1-4 ger Drosophila ett förenklat ännu översättnings system där för att studera komplexa sjukdomar. Metabolism i synnerhet har dragit nytta av sådan studie. Inte bara är genetiken av metabolism väl bevarade mellan flugor och människor, men de relevanta organen och celltyper är också mycket lik ^2,5. Till exempel, det fett kroppen av flugan lagrar både triacylglycerider (TAG) och glykogen, funktioner som är analoga med de som utförs i däggdjurslever och vitt adiposvävnad ^6. Med hjälp av Drosophila som en modell för mänsklig fetma har betydligt förbättrat vår förståelse av lipidmetabolism och genetik fetma ^7. Larvstadiet i utvecklingen är särskilt användbar för att studera segregeringen av näringsämnen till lagring eller användning som den är tillägnad matning och lagring av energi som skall användas under pupariation.

För närvarande finns det många olika kvantitativa metoder för att bestämma fettlagringsnivåer i Drosophila. Den mest använda metoden är den kopplade kolorimetrisk analys (CCA) ^8,9. CCA var utvecklad för bestämning TAG-nivåer i humant serum och verkar på premissen att glycerol frigjord från ryggraden av triglycerider kommer att genomgå flera reaktioner, vilket slutligen resulterar i en redox-kopplad reaktion alstra en färgad produkt. Absorbans av specifika ljusvåglängder mäts sedan för att bestämma den initiala mängden av glycerol närvarande. Däremot kan glycerol även befrias från mono- och diacylglycerides förutom TAG och kan därför inte vara ett exakt mått på svakas kroppsfett ^9. Dessutom kan ögat pigment krossade vuxna flugor störa vissa absorbansmätningar och komplicera resultat ^9,10. Därför måste CCA åtföljas och validerats av tunnskiktskromatografi (TLC), som gör det möjligt att separera de flesta lipid familjer som kan kvantifieras genom densitometri ^10,11. Dock kan vissa lipidklasser som steroler inte analyseras och måste kvantifieras på ett annat sätt ^12. Masspektrometri (MS) är ett korrekt sätt att kvantifiera alla klasser av större cellulära lipider ^12,13. Men lipidextraktion förfaranden som är nödvändiga för att analysera med MS är både tidskrävande (de flesta ta nästan en hel dag) och kostsamt. Här presenterar vi en alternativ metod för att snabbt och billigt bestämma organismfettnivåer i L3 larver av Drosophila melanogaster.

Den metod som presenteras nedan utnyttjar skillnaden i densitet mellan fettvävnad och mager vävnad. däggdjurs fat vävnad har en densitet av ca 0,9 g / ml ¹⁴ medan skelettmuskulaturen som en densitet av 1,06 g / ml ^15. Denna skillnad betyder att djur med högre butiker av fett kommer att ha lägre densitet än djur med lägre förråd av fett, vilket ger dem möjlighet att flyta bättre i en lösning av den fasta densiteten. Den här egenskapen möjliggör extremt snabb screening av ett stort antal djur och samtidigt vara både billig och icke-invasiv. Flytkraft baserad analys har använts både för att bekräfta fenotyper av att förändra kända regulatorer för fettnivåer samt att identifiera nya genetiska och neurologiska regulatorer av fetma ^16,17.

Protocol

1. Samla Ägg från Flugor med genotyper av intresse

OBS: Perfekt korsningar består av 150 jungfru flugor och minst 75 hanar. Lagersamlingar bör bestå av minst 200 flugor.

1. Förbereda druv plattor.
   1. Lägga 37,5 g agar till 1,5 L destillerat vatten i en 4 liters kolv.
   2. Autoklav vatten / agar mix för 50 minuter vid 121 ° C (250 F).
   3. Medan vatten / agar mix är autoklavering, tillsätt 50 g sackaros till 500 ml druvsaft och rör om med en omrörare på en upphettad rör plattan tills sackaros är upplöst.
   4. Stäng av värmen och fortsätt att röra för att kyla druvsaft / sackaros blandningen till under 70 ° C. Testa den inre temperaturen med en alkohol termometer.
   5. Tillsätt 3 g Drosophila antisvampmedel (t.ex. Tegosept) att värma druvsaft / sackaros blandningen och rör om för att lösa upp.
   6. När vatten / agar blandningen ur autoklaven, tillåter kolven svalna vid beröring genom att snurra då och då.
   7. Använda en serologisk pipett för att lägga till 8 - 10 ml av druvblandningen till locket på en liten petriskål (35 x 10 mm stil). Låt blandningen till kronan högre än höjden av lockets väggar för att bilda en konvex form.
   8. Låt druvplattor svalna i 2 timmar vid rumstemperatur och sedan lagra i en lufttät behållare vid 4 ° C.
2. Förbered jäst pasta.
   1. Tillsätt 6 ml fosfatbuffertlösning (PBS) till 4 g levande aktiv torrjäst i en 50 ml koniska rör och blanda med en spatel tills den är slät.
   2. Store jäst klistra på 4 ° C.
3. Tillsätt en liten klick (cirka 1/8 tsk) av jäst pasta till mitten av en druva platta. Smooth ner eventuella ojämna kanter med en spatel.
4. Placera druv plattorna i en inkubator tills de har nått omgivningstemperatur.
5. Överföra flugor av intresse i ett ägg uppsamlingskammare och plats druva platta wte jäst pasta inåt ovanpå. Tejp druva plattan äggplockningen kammaren för att undvika att låta plattan faller ut. Se till att skriva viktig genotyp och datum på undersidan av druvplattan.
6. Upend ägget uppsamlingskammaren för att tillåta flugorna att lägga ägg på druvplattan.
7. Placera en låda eller täcka över insamling av ägg kamrarna och placera dem i en inkubator vid 25 ° C.
8. Låt flugor för att lägga ägg för 4-6 timmar.
9. Avsluta samlingen genom att druvplattan ur ägget samlingskammaren och överföra flugorna tillbaka till sin flaska mat. Använd en spatel för att torka bort överflödigt jäst pasta från druvplattan. Store druv plattan i en större petriskål i en fuktad inkubator vid 25 ° C i ~ 24 timmar.

2. Transfer Larver till Experimental Food

1. Förbereda experimentell mat.
   OBS: Denna mat recept bygger på Bloomington lager center recept ^18. viktiga förändringarbland annat ökad mängd jäst för att optimera näringsvärdet i maten enligt bedömning av tidpunkten för vandrande scenen (mellan 112-120 timmar efter insamling av ägg vid 25 ° C). Även om vi har funnit detta recept perfekt för hälsa och utveckling av vår experimentella larver, är alla recept mat acceptabelt med tanke på kalibrering med positiva och negativa kontroller, av vilka exempel anges i steg 3,10.
   1. Mät 1600 ml destillerat vatten.
   2. Blanda 134 g majsmjöl, 10,6 g Drosophila Agar typ II, och en del av vattnet (~ 500 ml) i en 1 liter bägare. Blanda i två minuter med en motoriserad handmixer.
   3. Blanda 70 g levande aktiv torrjäst, 18,4 g sojamjöl, 84,8 g maltextrakt, och en del av vattnet (~ 500 ml) i en annan 1 L bägare. Blanda i två minuter med en motoriserad handmixer.
   4. Snurra varje bägare och häll i en 4-liters kolv. Använd återstående vatten för att skölja ut bägarna och lägg i kolven.
   5. Mät 140 ml ljus majssirap och lägg till kolven, blanda genom att snurra. </ Li>
   6. Autoklav under 50 minuter vid 121 ° C (250 F) i den flytande miljö.
   7. Efter autoklavering, häll mat in i en 4 liter bägare och låt det svalna. Hjälp kylningsprocessen genom att blanda med en motordriven handmixer.
   8. När kolven har svalnat tillräckligt för att röra, tillsätt 8,8 ml propionsyra och 16,8 ml Drosophila anti-svamp medel / etanollösning. Blanda väl. (Gör Drosophila antisvampmedel lösning genom att tillsätta 380 g Drosophila antisvampmedel till ett L 200 proof etanol och omröring på en varm platta tills det är upplöst, och se till att lösningen inte överstiger 70 ° C.)
   9. Pour mat i ampuller tills maten är ungefär en tum djup och låt svalna vid RT i 2-3 h. Plug flaskor och förvara i en inkubator vid 25 ° C. Använd inom en vecka.
2. Störta en spatel flera gånger i det översta lagret av flaskan med mat att göra mål den. Detta kommer att bidra till larverna att gräva och foder.
3. 22 - 24 timmar efter insamling av ägg harended, använda en liten pensel för att samla 50 första stadiet (L1) larver av den ungefärliga samma storlek. Placera larver i den experimentella mat. Rengör pensel på ett laboratorium torka och se till att det inte finns några kvarvarande larver på penseln innan du fortsätter till en annan genotyp.
4. Placera flaskan med larver i en inkubator vid 25 ° C och låt utvecklas.

3. Bestäm fettnivåer i Larver

1. Förbered lösningar.
   1. Förbered en L 10x PBS lager.
      1. Lägg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na ₂ HPO _4, och 2,4 g KH ₂ PO ₄ till 800 ml vatten i en 2 L bägare innehållande en omrörarstav. Rör utan värme tills alla salter införlivas. Bringa pH till 7,4. Öka volymen till 1 L med vatten.
   2. Förbered två L 1x PBS. Tillsätt 200 ml 10x PBS stamlösning till 1800 ml vatten.
   3. Använd detta bestånd av 1x PBS för att göra 20% vikt / volym sackaros.
2. Ta flaskan med larver fråninkubator när det finns 20-40 larver vandra upp sidorna av flaskan (i allmänhet den femte dagen efter ägg samlingar). Registrera datum och tidpunkt för analysen liksom antalet vandrande larver.
3. Bered experimentell lösning genom att tillsätta 11,5 ml PBS och 9 ml 20% sackaros till en 50 ml koniska rör.
4. Tillsätt 20% sackaros till flaskan tills det är 0,5-1 tum från toppen av flaskan.
5. Använd en spatel för att försiktigt röra upp det översta lagret av mat till fri larver som fortfarande grävande i maten. Alla larver kommer att stiga till ytan av sackaroslösningen.
6. Använd pincett för att försiktigt överföra larver i den initiala sackaroskoncentrationen från steg 3,3.
7. Använd en spatel för att försiktigt röra om larverna i denna lösning.
8. Cap den koniska röret och upend flera gånger för att blanda lösningen.
9. Ta bort skyddet det koniska röret och virvla för att skapa en mild virvel.
10. Tillåta larverna att reglera, antingen flytande till toppen av lösningen eller sinking till botten. Vänta 2-5 minuter för larverna att lösa.
    OBS: Om det fortfarande finns larver som inte definitivt antingen flytande eller sjunkande, välj en linje för att använda som en brytpunkten för att märka larver som antingen en flottör eller en sänke. Tillämpa samma kriterium för alla genotyper. Vi använder den vinkel vid botten av det koniska röret som vår gräns. ADP eller SIR2 ¹⁷ mutant larver kan användas som en positiv kontroll och lsd2 ¹⁹ mutanter kan användas som en negativ kontroll för kalibrering av analysen.
11. Registrera antalet flytande larver och den specifika testade koncentrationen.
12. Tillsätt 1 ml 20% sackaros till den experimentella lösningen för att öka dess densitet.
13. Upprepa steg från 3,7 till 3,10. Registrera antalet flytande larver och denna nya koncentration.
14. Upprepa steg 3,12 och 3,13 till åtminstone 95% av larverna är flytande.
15. Använd pincett för att samla alla larver i en dissektion skål fylld med PBS.
16. obsErve larver under ett mikroskop och notera om det finns några små larver, pre-puppor, puppor, eller några andra skillnader mellan genotyper.
    OBS: Helst ska alla larver visas homogen och på samma utvecklingsstadium. Vi har endast observerats konsekventa mätningar fett under dessa förhållanden.
17. Spela in det totala antalet larver.
18. Använd pincett, överföra 10 larver till ett laboratorium torka torka. Märk ett mikrocentrifugrör och placera 10 larver i röret.
19. Flash frysa larver i flytande kväve. Lagra röret vid -20 ° C.

Representative Results

Figur 1 visar ett exempel på hur flytbaserad analys kan detektera både högre och lägre fettdepåer i genetiskt manipulerade larver. Figur 1A visar att excitation eller tysta en viss delmängd av nervceller (E347) i larv hjärnan framkallar lägre och högre fett butiker respektive. Samma genetiska bakgrund kontroll användes i båda fallen. Figur 1B ger ett exempel på hur denna fenotyp som erhållits genom analysen tätheten bekräftas av neutral lipid extraktion och kvantifiering av GCMS.

Figur 1. neuronal funktion i specifika regioner i Larv Brain är nödvändig och tillräcklig för kroppsfett förordning. Nervaktivitet i den angivna E347-GAL4 linje tystades genom överuttryck av Shi ^DNEller aktiveras genom överuttryck av NB, som anges i panelerna, och effekter på kroppsfett bedömdes. (A) Procent av flytande larver vid jämvikt i olika densitet lösningar. Femtio larver undersöktes per biologisk replikera, n = 7 - 9 biologiska replikat per genotyp (B) Procent kroppsfett (totalt neutrala lipider inklusive triacylglycerider och fosfolipider dividerat med kroppsvikten) mätt med GCMS ^17,20 (n = 8).. GAL4 enbart blå linjer eller staplar representerar (ingen UAS) djur korsade till w ¹¹¹⁸ för att kontrollera för effekter av genetisk bakgrund. P-värden representerar resultat från två-svansade t test. **** P <0,0001, *** P = 0,0001 till 0,001, ** P = 0,001 till 0,01, * P = 0,01 till 0,05. Felstaplar visar SEM. Denna siffra har ändrats ^16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det finns en mängd olika tekniker som har utvecklats för att mäta lipidnivåer ^8-10. Emellertid kommer var och en av dessa metoder med några stora nackdelar som tas upp av flytkraften baserad analys som beskrivs ovan. För det första är denna analys extremt snabbt. Testa en full koncentration gradient tar inte mer än 30-60 minuter. Detta är en enorm förbättring jämfört med de flesta av de tekniker som för närvarande används. Till exempel, lipid kvantifiering av MS tar 7-9 timmar för att isolera lipider och en annan flera timmar att analysera dem. Detta är ett starkt avskräckande när man utför en skärm på ett stort antal djur. Genom att mäta en snabb flyt fenotyp, kan man snabbt fokusera på de genotyper som har fenotypen av intresse. För det andra kräver analysen densiteten endast vanliga reagens, såsom salter (till PBS) och sackaros. Detta gör det mycket enklare och billigare att screena ett stort antal larver eller snabbt testa en intressant genotyp. Slutligen, detta protokoll iär icke-invasiv och larver är fortfarande lever i slutet. Detta gör det möjligt för ytterligare experiment som ska utföras på de djur som specifik lipid kvantifiering eller transkript eller proteinanalys. Dessutom kan återvinnas larver tillåtas att fortsätta tillväxten till vuxen ålder.

En ytterligare fördel med denna teknik framför andra är ökad känslighet för små förändringar i fettnivåer i en population. Genom att utföra en hel koncentrationsgradient på en befolkning på 50 larver, kommer små förändringar i befolkningsfettnivåer identifieras genom en förändring i de mellanliggande koncentrationer, men koncentrationen vid vilken larverna börjar flytande och är helt flöt kan inte vara annorlunda än kontrollerna . Denna lilla förändring i populationen kan inte alltid identifieras av andra fett kvantifiering metoder eftersom de kräver en stor grupp av larver att analysera. Analystätheten däremot frågar individer inom befolkningen och kan följaktligen identifiera these små förändringar eller förändringar i den totala fördelningen populationen.

Eftersom denna teknik bygger på densiteten av lösningen för att producera tillförlitliga resultat är det extremt viktigt att den PBS och sackaroslösningar är genomgående gjort. Vi har funnit att olika PBS recept producerar skillnader i lösningens densitet, vilket leder till varierande resultat. Vi använder receptet som beskrivs ovan för konsekventa resultat. Vidare är det viktigt att göra den 20% sukros från samma sats av 1x PBS som det resulterar i samma bakgrunds lösningens densitet. Om de två lösningarna gjordes separat, kan små variationer i PBS densitet ta in ytterligare densitet variabel utöver tillsats av socker till den experimentella koniska flaskan. Slutligen kan avdunstning vara ett problem, eftersom tiden lösningarna blir mer koncentrerat med avdunstning av vatten. Det är därför viktigt att begränsa flaskorna tätt och att återskapa lösningen varje vecka så att den experimentellalösningar förblir konsekvent.

Bland stegen ovan, finns det flera viktiga steg som om ändras, kan leda till felaktiga resultat vid flyt analysen. För det första är det viktigt att larverna överförs till den experimentella mat flaskan vara samma ålder. Överföra larver som varierar i storlek kommer att resultera i larver vid olika utvecklingsstadier vid tiden flyt analysen utförs. Detta protokoll har utvecklats för att bestämma förändringar i fettnivåer i vandrande L3 larver och kommer inte att fungera korrekt för tidig L3 eller pre-puppor eller senare. Början av tredje stadiet larver har en tendens att flyta oberoende av fettnivåer medan pre-puppor och puppor sjunka även vid de högsta koncentrationerna som används. Av denna anledning är kritisk ålder L1 larver överförs. På liknande sätt är viktig den punkt vid vilken flaskan tas för att utföra flytkraft-analysen. Av samma utvecklingstids skäl som anges ovan, bör flaskorna tas endast när 20 -40 larver vandrar för att säkerställa noggranna mätningar densitet. Dessutom har antalet L1 överförs kan påverka resultaten också. De breda flaskorna som används i detta protokoll tillåta 50 larver att äta utan konkurrens under utveckling. Ett mycket större antal larver överförs än detta kommer att leda till konkurrens om mat och kan påverka mängden fett som lagras oberoende av genotyp.

Det kan finnas genotyper med sådana extremt höga fettnivåer som de flesta eller alla av larverna kommer flyta vid den första koncentrationen. I detta fall kan protokollet modifieras genom minskning av koncentrationen av utgångslösningen för att erhålla ett fullt spektrum av fördelningen befolkningstäthet. Å andra sidan, kan en specifik genotyp vara så magert att ingen larv flyter i den initiala sackaros. I detta fall kan de första stegen utelämnas och en högre koncentration start används. Denna analys är mycket flexibel och kan modifieras för att bättre passa ett brett spektrum av fettnivåer.Vi rekommenderar användning av kontroller som lämpliga vild typ djur (kontrollerade för genetiska bakgrunden), positiva kontroller (etablerade fett mutanter, såsom ADP eller Sir2 ^17), och negativa kontroller (publicerade magra mutanter såsom lsd2 ^19). Lämplig användning av detta protokoll kommer att möjliggöra framtida screening av samlingar för att fastställa nya regulatorer av ämnesomsättning och fetma anlag. Dessutom ger detta protokoll ett enkelt sätt för forskare inom alla områden för att testa om deras genetiska manipulering av intresse orsakar en förändring i fettnivåer, utan behov av komplexa protokoll eller dyr utrustning. Detta protokoll kommer att bidra till att belysa det komplexa förhållandet mellan genetik och fetma.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50 ml Conical	Fisher	50-869-569