Summary
Rolle sortiment (rumlig adskillelse) i evolutionære scenarier kan undersøges ved hjælp af simple mikrobielle systemer i laboratoriet, der tillader kontrolleret justering af rumlige fordeling. Ved at modificere grundlægger celletæthed kan forskellige sortiment niveauer visualiseres under anvendelse fluorescensmærkede bakteriestammer i kolonien biofilm af Bacillus subtilis.
Introduction
I de sidste årtier har mikrober blevet anerkendt som sociale fællesskaber forbundet med forskellige økosystemer på jorden 1,2. I modsætning til planktoniske kulturer anvendes generelt laboratoriepraksis, mikrober i miljøet viser en bred vifte af rumlige samfundsstrukturer afhængigt af økologiske indstilling. Simple mikrobielle systemer kan anvendes til at forstå konsekvensen af rumlige strukturer af udviklingen af sociale interaktioner 3,4. Publikationer i de sidste 2-3 år ved hjælp både eukaryote og prokaryote modelsystemer fremhævet virkningen af rumlige strukturer på stabiliteten af samarbejde inden mikrobielle populationer 5-8. Derudover obligat interaktioner blandt mikrober, f.eks metaboliske cross-fodring, kan også ændre den rumlige fordeling af interagerende partnere 9-11. Indflydelsen af rumlig struktur i disse undersøgelser er for det meste undersøgt ved hjælp af overflade vedhæftet fastsiddende celler lever i så-kaldet biofilm eller i kolonier vokser på overfladen af et agarmedium. Genetisk drift resulterer i høj rumlig sortiment kan observeres i mikrobielle kolonier hvor næringsstof udtynding ved kanten af en celledeling medierede ekspansion resulterer i serie af genetiske flaskehalse, der forårsager høj lokal fiksering sandsynlighed for visse klonede linages 12. Genetisk drift kan derfor anvendes til at undersøge, hvilken rolle rumlig segregering i mikrobielle kolonier.
I miljøet, biofilm er flere arter samfund omgivet af egenproduceret polymermatrix 13. Biofilm struktur, funktion og stabilitet afhænger af et komplekst netværk af sociale interaktioner, hvor bakterier udveksle signaler, matrix komponenter og ressourcer, eller konkurrere om plads og næringsstoffer ved hjælp af toksiner og antibiotika. Bacillus subtilis er en jord bolig og rod-koloniserer bakterie, der udvikler meget organiseret biofilm samfund 14. Analogt til socialinsekter, B. subtilis celler ansætte en arbejdsdeling strategi, udvikling subpopulationer af ekstracellulære matrix producenter og kannibaler, motile celler, hvilende sporer og andre celletyper 15,16. Differentieringen proces er dynamisk og kan ændres ved miljøforhold 17,18.
Strategier overflade kolonisering af bakterier let kan manipuleres under laboratorieforhold ved modifikation af agar koncentration i vækstmediet. Ved lave agar niveauer (0,2-0,3%), bakterier huser aktive flageller er i stand til at svømme, mens halvfast agar (0,7-1% agar) letter flagel drevet samfund breder, kaldet sværmer 19-21. I fravær af flagel, visse bakteriestammer er i stand at bevæge sig over halvfast medium via glidende, dvs. vækst afhængig befolkning ekspansion lettes af exopolysaccharid matrix og andre udskilte hydrofobin forbindelserne 22-24. Endelig bakterier, som er capable af biofilm udvikling danner arkitektonisk komplekse kolonier på hårdt agarmedium (1,2-2%) 14,17,25. Mens disse træk undersøges i laboratoriet ved at justere betingelserne, i naturlige habitater disse overfladeaktive sprede strategier kan transit gradvist fra den ene til den anden, afhængigt af de miljømæssige forhold 26. Mens enkelt celle baseret motilitet er kritisk under initiering af biofilm udvikling ved luft-væske-grænsefladen i både Gram-positive og -negative bakterier 27, komplekse koloni biofilm af B. subtilis påvirkes ikke af sletning af flagellært motilitet 28. Men rumlige organisation under udviklingen af B. subtilis-kolonier biofilm afhænger af densiteten af det bakterielle inokulum anvendes til at initiere biofilmen 8.
Her bruger vi B. subtilis at vise, at rumlig adskillelse under overfladen kolonisering afhænger af mekanismen for populationsniveau motility (dvs. myldrende eller glidende), og koloni biofilm udvikling afhænger af grundlæggeren celletæthed. Vi præsenterer et fluorescerende mikroskopi værktøj, der kan anvendes til løbende at overvåge mikrobiel biofilm vækst, overflade kolonisering og sortiment på makro skala. Endvidere er en kvantificering metode præsenteret at bestemme den relative stamme overflod i befolkningen.
Protocol
1. Udarbejdelse af Kultur Media, halvfast agar og Biofilm plader, Pre-kulturer
- Medium Forberedelse til sværmer og Sliding
- Opløs 2 g Lenox Broth (LB) og 0,7 g agar-agar i 100 ml ionbyttet vand og autoklave i 20 minutter ved 120 ° C. Brug små volumener (50-200 ml) for at forbedre reproducerbarheden mellem eksperimenter.
- Umiddelbart efter sterilisering, lukke låget af mediet flasken for at reducere fordampning og sted i en 55 ° C inkubator i mindst 2 timer.
- Efter medietemperaturen er hærdet til 55 ° C, hæld 20 ml agar LB-medium i en 90 mm polystyren diameter petriskål under et laboratorium steril hætte. For time-lapse eksperimenter, hæld 5 ml agar LB medium pr 35 mm polystyren diameter petriskål.
- Luk petriskål umiddelbart efter hælde, stable højst 4 plader oven på hinanden og lade agarmedium størkne i mindst 1 time.
- 2xSG Medium Perstatning for Colony Biofilm
- Opløs 1,6 g Nutrient Broth, 0,2 g KCI, 0,05 g MgSO4 7H 2 O, og 1,5 g Agar-agar i 100 ml ionbyttet vand og autoklave i 20 minutter ved 120 ° C. Brug små volumener (50-200 ml) for at forbedre reproducerbarheden mellem eksperimenter.
- Umiddelbart efter sterilisering, lukke låget af mediet flasken for at reducere fordampning og placere flasken i en 55 ° C inkubator i mindst 2 timer.
- Efter medietemperaturen med egne justeret til 55 ° C, tilsættes 0,1 ml filtersteriliseret 1 M Ca (NO3) 2-opløsning, 0,1 ml filtersteriliseret 100 mM MnCI2 opløsning, 0,1 ml filtersteriliseret 1 mM FeSO4-opløsning, og 0,5 ml steril 20% glucose-opløsning.
- I et laboratorium steril hætte, hæld 20 ml agar 2x SG medium pr 90 mm polystyren diameter petriskål. For time-lapse eksperimenter, hæld 5 ml agar LB medium pr 35 mm polystyren diameter petriskål.
- Close petriskålen umiddelbart efter hælde, stable pladen oven på hinanden, men ikke mere end 4 plader, og lad agarmedium at størkne i mindst 1 time.
- Udarbejdelse af starterkulturer
BEMÆRK: B. subtilis 168, NCIB 3610 afledte stammer anvendt i de nedenfor beskrevne metoder konstitutivt producerer drivhuse eller rød-fluorescens proteiner og blev beskrevet før 8,27. Stammer lagres rutinemæssigt i -80 ° C fryser.- Inokulering starterkulturer fra -80 ° C lagre i 3 ml LB-medium og inkuberes natten over (16-18 timer) ved 37 ° C med vandret omrystning (225 rpm). Må ikke inkubere kulturen længere end 18 timer som vilde isolater af B. subtilis er for det meste tilbøjelige til at aggregere og danne en biofilm i reagensglasset.
2. Co-podning af Fluorescerende Labelled Bakteriel Stammer for Surface Spredning
- Tørring af Halvfaste agarplader til sværmer ogGlidning af B. subtilis.
- Tørre agarplader til swarming og glidende i 20 minutter før inokulering. Tørre plader afsløret i en laminær strømning (se figur 1).
BEMÆRK: Bakteriel sværmende og glidende afhænger af tørhed i halvfast agar-medium. Utilstrækkelig tørring giver vand ophobning på agar medium resulterer i flagel-medieret svømning. Forlænget tørring tid resulterer i manglende sværmer.
- Tørre agarplader til swarming og glidende i 20 minutter før inokulering. Tørre plader afsløret i en laminær strømning (se figur 1).
Figur 1:.. Eksperimentel workflow Den fælles procedure er afbildet i figuren, herunder udarbejdelse af dyrkningsmediet, tørring af pladen, podning og fluorescens mikroskopi detektion (fra venstre til højre) Klik her for at se en større version af dette tal.
- Co-podningaf bakteriekulturer til swarming og Sliding
- Bestem de optiske tætheder af de overnattende starterkulturer ved 600 nm og bland density normaliserede drivhuse og rød-fluorescerende protein producerende stammer af B. subtilis NCIB 3610 eller dens Δ hag-derivat i et 1,5 ml reaktionsrør. For eksempel blande 100 pi stamme 1 med (100 * [OD600 på overnatskultur af stammen 1] / [OD 600 af overnatskultur af stammen 2]) pi stamme 2. Mildt vortex (3 sek ved maksimal hastighed) for homogen fordeling.
BEMÆRK: B. subtilis NCIB 3610 stammer podes at observere sværmer, mens der bruges deres Δ HAG derivater til glidende. - Spot 2 pi blandet kultur på midten af en fortørret plade (se figur 1) og yderligere tørre pladen i 10 minutter efter inokulering.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C oprejst for at tillade overskydende fugt til at kondensere på låget og ikke på agaroverfladen. <br /> BEMÆRK: Inkubationstid for B. subtilis sværmer er typisk mellem 8-16 timer. Generelt kanten af sværmen når den side af 90 mm petriskål i 8 timer. Sliding er en langsommere proces, og kræver mindst 16-42 timers inkubation. Efter 36 timer, den glidende fronten når den side af 90 mm petriskål.
- For time-lapse eksperimenter placere mm diameter 35 petriskåle i en forvarmet fase inkubation kammer indstillet til 37 ° C. Sørg for, at låget af petriskålen forbliver fjernet under hele forsøget. Sæt låg af scenen inkubator til 40 ° C for at omgå dugdannelse på toppen af inkubatoren.
- Bestem de optiske tætheder af de overnattende starterkulturer ved 600 nm og bland density normaliserede drivhuse og rød-fluorescerende protein producerende stammer af B. subtilis NCIB 3610 eller dens Δ hag-derivat i et 1,5 ml reaktionsrør. For eksempel blande 100 pi stamme 1 med (100 * [OD600 på overnatskultur af stammen 1] / [OD 600 af overnatskultur af stammen 2]) pi stamme 2. Mildt vortex (3 sek ved maksimal hastighed) for homogen fordeling.
3. Co-podning af Fluorescerende Labelled Bakteriestammer med forskellige initiale celledensiteter
- Tørring af agarplader for Colony biofilmdannelse af B. subtilis.
- Tør pladerne til koloni biofilm udvikling uden dækning i en laminar strømningstinkskab i 15 min forud for inokulering.
BEMÆRK: Utilstrækkelig tørring resulterer i øget fugtighed og svømning eller sværmer kan være muligt 29. Tørring for lange resulterer i små biofilm kolonier.
- Tør pladerne til koloni biofilm udvikling uden dækning i en laminar strømningstinkskab i 15 min forud for inokulering.
- Fremstilling af 10-gange fortyndet starterkulturer til Colony Biofilm
- Bland 100 ul grøn- og rød-fluorescerende protein producerer natten starterkulturer af B. subtilis 168 i et 1,5 ml reaktionsrør og mildt vortex i homogen fordeling. Forbered 10-fold fortyndingsrække i LB-medium.
- Spot 2 pi af ikke-fortyndet eller 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 fortyndede blandede kulturer på pladen indeholdende biofilm-inducerende medium.
BEMÆRK: 6 til 9 biofilm kolonier kan igangsættes på en enkelt 90 mm petriskål under hensyntagen til at kolonierne adskilles med lige stor afstand fra hinanden. - Pladerne inkuberes ved 30 ° C oprejst for at tillade overskydende fugt til at kondensere på låget ogikke på agaroverfladen.
BEMÆRK: Inkubationstiden for B. subtilis biofilm er mellem 1 til 3 dage. Generelt kolonien biofilm af B. subtilis når sin gennemsnitlige størrelse og komplekse struktur i 2 dage. - For time-lapse eksperimenter, placere en enkelt inokulum i midten af en 35 mm diameter petriskål og placer fadet i en forvarmet fase inkubation kammer indstillet til 30 ° C. Sørg for, at toppen af petriskålen forbliver fjernet under hele forsøget. Sæt låg af scenen inkubator til 35 ° C for at omgå dugdannelse på toppen af inkubatoren.
4. Fluorescerende mikroskopi Påvisning af Labelled Stammer
- Udstyr Beskrivelse for Imaging.
- For at detektere overflade kolonisering og fluorescens signal, bruge en motoriseret fluorescens stereo zoom mikroskop (se detaljeret liste i Materials tabel) udstyret med en 0,5X PlanApo Mål, to LEDKoldt lys kilder (en for fluorescens detektion og en for det synlige lys), filtersæt til GFP (excitation ved 470/40 nm og emission ved 525/50 nm) og mRFP (excitation ved 572/25 nm og emission ved 629 / 62 nm), og en høj opløsning monokrom kamera.
- Udfør erhvervelse og behandling billede med passende software til stereo zoom mikroskop herunder multikanal og time-lapse-moduler. For tid bortfalder eksperiment, bruge en standard opvarmning fase inkubator monteret på stereo zoom mikroskop med en adapter.
- Imaging af myldrer og Sliding Expansion
- Brug den laveste forstørrelse til at fange den størst mulige område af 90 mm plade. Indstil oprindelse inokulering (midten af 90 mm petriskål) til hjørnet af den synlige felt til overvågning radial bakteriel ekspansion og fluorescens.
- Juster optimal eksponering tid, afhængigt af styrken af fluorescenssignalet.
BEMÆRK: konstitutivt EXPREssed fluorescens gener i B. subtilis, grøn- og rød-fluorescens med 1,5 og 3 sek eksponering gange kan bruges hhv. Derudover 10 msek eksponeringstid er passende for synligt lys.
- Brug forstørrelsen, der muliggør påvisning af hele biofilm koloni- og justere koloni i midten af synsfeltet.
BEMÆRK: Som for swarming og glidende udvidelser, at de optimale eksponeringstider detektere fluorescenssignaler i biofilm kolonier afhænger af ekspressionsniveauet af det fluorescerende protein-kodende gener. For de repræsentative nedenstående resultater, var grøn- og rød-fluorescens påvises ved anvendelse 1 og 3 intervaller sek eksponering hhv. - For time-lapse imaging, få billeder på bestemte intervaller ved hjælp af konstante eksponeringstider.
- Gem fluorescens stereomikroskop optagede billeder i et filformat, der er anerkendt af ImageJ software til kvantitativ dataanalyse.
5. Daten analyse
- For at analysere området besat af hver forskelligt mærket fluorescerende belastning, åbne filen af interesse i ImageJ software udvidet med en BioVoxxel plugin.
- Når et vindue kaldet "Bio-formater importindstillinger" vises, hvor kun de indstillinger "Åben hele serien" og "Autoscale" er valgt, skal du åbne filen ved at klikke på "OK".
BEMÆRK: Filerne vises som en stak af tre billeder, en for hver kanal bruges til at optage et billede i mikroskopet (grøn-, rød-fluorescens og lyse-field billeder). - Adskil stakken i individuelle kanal billeder ved at vælge "Image" - "Stacks" - "Stack til billeder" i ImageJ kontrolpanelet.
BEMÆRK: Billeder vises og er nummereret som 1/3 (grøn kanal), 2/3 (rød kanal) og 3/3 (lys-felt). Her er lysfeltsbillede udelukket fra analysen.
- Når et vindue kaldet "Bio-formater importindstillinger" vises, hvor kun de indstillinger "Åben hele serien" og "Autoscale" er valgt, skal du åbne filen ved at klikke på "OK".
- For at analysere billederne, omdanne hver til en 8-bit billede ved at vælge"Image" - "Type" - "8-bit".
- For at bestemme det besatte område i pixel 2, nulstille omfanget af de billeder med "Analyser" - "Sæt Scale". Når et vindue popper op med forskellige muligheder skala, nulstille skalaen ved at vælge "Klik for at fjerne Scale". Kontroller indstillingen "Global" for at fjerne skalaen for alle åbne billeder.
- For at fjerne baggrund, trækker en oval område (område af interesse, ROI) uden for det fluorescerende område ved hjælp af "Oval" værktøj i ImageJ kontrolpanelet.
- For at sikre, at størrelsen af baggrunden ovale er den samme for alle analyserede billeder, tilføje det til ROI Manager via [t] karakter af tastaturet. En ROI Manager-vinduet kommer op, hvor baggrunden ovale ROI kan gemmes via "Flere" - "Gem" muligheder.
- Hvis den ovale ROI baggrunden er synlig på billedet, måle intensiteten af området ved at vælge "Analyser" - "Mål".
BEMÆRK: A resultatervises, hvor blandt andet den gennemsnitlige fluorescensintensiteten vises i kolonnen "Mean". - Fratræk værdien af den gennemsnitlige baggrund fluorescensintensiteten fra billedet ved at fravælge baggrunden ovale ROI, klikke "Process" - "Math" - "Træk" og indsætte den målte værdi.
- Påfør en tærskel til billedet via "Image" - "Adjust" - "Threshold" valgmulighed. Vælg den metode Otsu og sort-hvid (B & W). Check "Mørk baggrund", og ansætte tærsklen ved at klikke på "Anvend".
BEMÆRK: Billedet skifter til en binært billede, hvor området over tærsklen er vist i hvidt, og at under tærsklen er vist i sort. - Vælg alt over tærsklen via "Analyser" - "Analyser Partikler" valgmulighed. I vinduet med indstillingerne, holde standardindstillingerne og holde de "Vis resultaterne" og "Summarize "indstillinger kontrolleret. Klik på" OK "for at vise resumé i vinduet resultater og displayet den besatte område i kolonnen" Samlet areal ".
Representative Results
Laboratorie systemer af bakterielle populationer giver en tiltalende tilgang til at udforske økologiske eller evolutionære spørgsmål. Her, tre overflade kolonisering former for B. subtilis blev brugt til at undersøge forekomsten af befolkningen sortiment, dvs. adskillelse af genetisk identiske, men fluorescens anderledes mærkede stammer. Swarming, som er en flagel afhængig kollektiv trafik på B. subtilis, resulterer i en stærkt blandet population. I disse sværmende kolonier, de drivhuse og rød-fluorescerende bakterier koloniserede områder blev overlappende (se figur 2A). Den hurtige overflade kolonisering kan følges i tid (Video Figur 1). Under swarming af B subtilis, et tyndt lag af celler udvider fra inokulation center efter få timers inkubation (se Figur 2B).
4752 / 54752fig2.jpg "/>
Figur 2: mylder udvidelse af B. . subtilis Det sværmer koloni indeholder drivhuse og rød-fluorescerende stammer, blev blandet 1: 1 før podning. (A) Efter 15 timer, den grøn- og rød-fluorescens (GFP og RFP, henholdsvis) blev påvist med passende fluorescens filtre. (B) Billeder af tyndt lag sværmer B. subtilis vises på udvalgte tidspunkter udvundet Video Figur 1. Skala bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Men når B. subtilis-stammer, der mangler funktionelle flageller men er i stand til at sprede ved hjælp af produceret exopolysaccharid, hydrofobin og surfactin, blev spottet på halvfast agarmedium blev de forskelligt mærkede stammer adskilt i visse defined sektorer (se figur 3A). Udviklingen af den glidende koloni kan optages i tid (se figur 3B eller Video figur 2).
Figur 3: Glidende koloni af B. . subtilis Kolonien indeholder drivhuse og rød-fluorescerende stammer, blev blandet 1: 1 før podning. (A) Efter 24 timer, den grøn- og rød-fluorescens (GFP og RFP, henholdsvis) blev påvist med passende fluorescens filtre. (B) Images of the B. subtilis glidende disk vises på udvalgte tidspunkter udvundet Video Figur 2. Scale bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Mens sortiment niveauer af sværmer og SLIding ekspanderende kolonier kunne ikke ændres, kan den rumlige adskillelse af forskelligt mærkede fluorescerende stammer i kolonien biofilm være påvirket af start celledensiteter. Når en koloni biofilm af B. subtilis blev initieret med høj celledensitet af de blandede populationer, viste mindre driv- og rød-fluorescerende stammer eller ingen rumlig sortiment (se figur 4). Tværtimod når celledensiteten at indlede biolfilm var lav, kunne klare grøn- og rød-fluorescens sektorer detekteres ved fluorescensmikroskopi. Sortimentet niveau var klart afhængig af fortynding niveau af biofilmen indlede befolkning. Video Figur 3 og 4 den koloni ekspansion for den laveste og højeste fortynding af de podede stammer.
Figur 4: Sortiment niveau i koloni biofilm af B. subtilis på. diverse indledende celledensiteter kolonien biofilm af grøn- og rød-fluorescens stammer er vist efter 2 dage, der blev podet med forskellige initiale celledensiteter (fra over til under: ikke-fortyndet til 10 5 gange fortyndet indlede kulturer, henholdsvis). Scale bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Forholdet mellem driv- og rød-fluorescerende stammer kan yderligere kvantificeres ved hjælp ImageJ software, der giver den kvantitative karakterisering af befolkningens struktur og konkurrenceevne af stammerne anvendt til forsøgene.
Video Figur 1: Time bortfalder images af sværmer B. subtilis indledt med 1:. 1 blanding af driv- og røde fluorescerende stammer (Højreklik for at downloade.) Videoen viser et tidsforløb på 10 timer. Scale bar = 7 mm.
Video Figur 2: Time Lapse billeder af glidende B. subtilis indledt med 1:. 1 blanding af driv- og røde fluorescerende stammer (Højreklik for at downloade.) Videoen viser et tidsforløb på 24 timer. Scale bar = 5 mm.
Video Figur 3: Time Lapse billeder af B. subtilis koloni biofilm initieret med 1: 1 blanding af grøn-. Og rød-fluorescerende stammer ved høje celledensiteter (Højreklik for at downloade.) Videoen viser et tidsforløb på 48 timer. Scale bar = 5 mm.
Video Figur 4: Time Lapse billeder af B. subtilis koloni biofilm initieret med 1: 1 blanding af driv- og rød-fluorescerende stammer ved lave celledensiteter. (Højreklik for at downloade.) Videoen viser et tidsforløb på 48 timer. Scale bar = 5 mm.
Discussion
Tilgængeligheden af en fluorescerende værktøjskasse for bakterier letter ikke blot studiet af heterogene genekspression 30,31 og proteinlokalisering 32, men også analysen af rumlige fordeling af stammer inden for en population 8. Fluorescerende markører med tilstrækkelig forskellige excitations- og emissionsbølgelængder muligt at tydeligt lokalisere to stammer, som ellers ikke kan skelnes fra hinanden, når de blandes. Den beskrevne protokol kan anvendes til at observere populationsdynamik i blandede kulturer, fx konkurrence- eksperimenter eller synergi mellem stammer eller arter. Evnen til at bestemme de relative mængder af fluorescens-mærkede stammer i en blandet population er ikke begrænset til overfladen bundet sværmning, skydedøre, eller biofilm kolonier, men kan også anvendes til andre multicellulære biofilm, herunder neddykket, flow celle eller luft-medium-grænsefladen biofilm 27,33-35.
_content "> Mens præsenterede teknik er et kraftfuldt værktøj til at detektere rumlige fordeling af stammer og design konkurrence- eksperimenter, det giver også mulighed følgende genekspression heterogenitet i ekspanderende kolonier. De dyrkningsbetingelser beskrevet her gælder for B. subtilis og de nøjagtige parametre for ekspansion på agar medier kan kræve optimering for andre arter eller stammer 20. Placering af prøverne i en inkubation kammer mens imaging tillader forsøgslederen at følge bestandsudviklingen i tid, selv om der bør lægges vægt på luftfugtighed i kammeret under inkubationen.De her beskrevne teknikker kræver også den genetiske modifikation af de undersøgte bakteriestammer, så stammerne udtrykker fluorescerende markører, som kan skelnes fra hinanden. Desuden udover at have særskilte excitations- og emissionsspektre, anbefales det, at de to valgte fluorescerende markører har lignende kvantum udbytter (dvs. forholdet mellem absorberede fotoner, der udsendes) og kommer til udtryk i et sammenligneligt niveau. Desuden kan relative ændringer intensitet i tid måles og normaliseres til et tidligt tidspunkt-punkt i et eksperiment. Den relative stigning eller fald kan derefter sammenlignet mellem forskellige fluoroforer med forskellige kvante effektivitet. For det præsenterede eksperimentelle system blev forskellige grøn- og rød-fluorescerende proteiner tidligere testet 36,37 for at vælge de mest optimale fluorescerende par, der kan påvises i B. subtilis. bør bestemmes optimale eksponeringstid for hver fluorescerende protein og prøve. Visse celledensiteter eller multiple lag af celler kan være nødvendigt at registrere signalet effektivt i befolkningen. Visse fluorescerende proteiner kan have lave intensiteter i de bakterielle celler som følge ineffektiv ekspression og / eller translation af proteinet og dermed lave udbytte kvante. Sådanne ineffektive fluorescerende markører kunne reduce følsomheden af systemet og forlænge den nødvendige tid til at detektere bakteriestammerne eventuelt resulterer i cytotoksicitet ved excitationslyset. De fluorescerende intensiteter kan derfor ændres ved at ændre promotoren bruges til at udtrykke den fluorescerende reporter kodning gen. Et udtryk, der er for høj kan resultere i unødvendig overproduktion af det fluorescerende protein, der fører til skadelige fitness omkostninger for bakterien. Ved udførelse konkurrenceeksperimenter, bør man overveje omkostningerne ved særlig fluorescerende protein produktion i cellerne. Kontrol eksperimenter, hvor de fluorescerende markører byttes mellem konkurrerede stammer eller hvor to isogene stammer kun afviger i deres fluorescerende markører konkurrerede mod hinanden, er altid forpligtet til at bestemme nogen bias i retning af en markør. Levetider af de fluorescerende proteiner i cellerne kan også påvirke den målte intensitet. Derudover autofluorescens af visse bakterielle species kan kræve anvendelsen af forskellige andre end beskrevet her fluorescerende markører.
Præcist at afgøre de rumlige fordelinger og mængderne af de forskellige bakteriestammer, bør baggrunden signalet hidrørende fra det første fluorescerende protein under brug af fluorescens filter til den anden fluorescerende markør og omvendt individuelt testet på monokultur prøver (indeholdende bakterier producerer kun én markør ). Dette tillader subtraktion af overlappende fluorescerende signalintensiteter. Vigtigere er det, som stereomikroskop registrerer fluorescenssignalet fra oven den ekspanderende koloni, det præsenterede protokol er bekvemt at bestemme den rumlige arrangement i to dimensioner. Arkitekturen i den ekspanderende bakterielle population kan resultere i varierende fluorescens niveauer (dvs. rynke-lignende strukturer kan indeholde flere celler, som viser højere lokale fluorescensintensiteter). Derfor er den beskrevne analyse af billederne determines den rumlige fordeling, men ikke den overflod af stammerne inden for en bestemt placering. Tidligere protokoller beskrev prøveforberedelse for myldrer 20 eller fluorescens billeddannelse af populationsdynamik i bakteriekolonier 38, men vores protokol kombinerer disse teknikker. Andre mikroskopi teknikker, der tillader observation af tredimensionelle opløsning af befolkningen struktur (f.eks konfokal laserscanning mikroskopi 39,40 eller struktureret belysning mikroskopi 41) kan anvendes til prøver med øgede strukturelle kompleksiteter. Disse yderligere teknikker understøtter også enkelt celle baseret detektion af stammerne 31, der ikke er tilgængelige ved hjælp stereomikroskoper.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af tilskud KO4741 / 3-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Endvidere blev laboratorium Á.TK støttes af en Marie Skłodowska Curie karriere integration tilskud (PheHetBacBiofilm) og tilskud KO4741 / 2-1 fra DFG. TH, AD, RG-M., Og EM blev støttet af International Max Planck Research School, Alexander von Humboldt fundament, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-tyske Academic Exchange Service (CONACYT-DAAD), og JSMC stipendier, hhv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
