Summary
תפקידו של מבחר (הפרדה מרחבית) בתרחישים האבולוציונית ניתן לבדוק באמצעות מערכות חיידקים פשוטה במעבדה המאפשרים נשלט התאמת הפריסה המרחבית. על ידי שינוי צפיפות התאים המייסדים, רמות מבחר שונות ניתן מדמיינות באמצעות זני חיידקים שכותרתו fluorescently ב biofilms המושבה של Bacillus subtilis.
Introduction
בעשורים האחרונים, חיידקים הוכרו קהילות חברתיות הקשורות מערכות אקולוגיות שונות על פני כדור הארץ 1,2. בניגוד לתרבויות planktonic בשימוש בפועל במעבדה בכלל, חיידקים בסביבה להראות מגוון רחב של מבני קהילה מרחבית בהתאם להגדרה האקולוגית. מערכות חיידקים פשוטות יכולות להיות מנוצלות כדי להבין את כל ההשלכות של מבנים מרחביים על האבולוציה של אינטראקציות חברתיות 3,4. פרסומים ב 2-3 השנים האחרונות תוך שימוש במערכות מודל האיקריוטים פרוקריוטים הדגישו את ההשפעה של מבנים מרחביים על היציבות של שיתוף פעולה בתוך אוכלוסיות חיידקים 5-8. בנוסף, לחייב אינטראקציות בין חיידקים, למשל מטבולית צולבות האכלה, אולי גם לשנות את הפריסה המרחבית של השותפים באינטראקציה 9-11. השפעת המבנה המרחבי במחקרים אלה נבחנת בעיקר באמצעות תאים נייחים מצורף משטח המאכלסים את כל כךbiofilms -called או במושבות גוברים על פני השטח של מדיום אגר. סחיפה גנטית וכתוצאה מכך מגוון מרחבית גבוה ניתן לצפות במושבות חיידקים שבו דלדול מזין בקצה של תוצאות רחבות בתיווך חלוקת תא בסדרה של צווארי בקבוק גנטיים גורם הסתברות קיבעון מקומי גבוהה עבור linages המשובט מסוים 12. ניתן סחיפה גנטית ולכן מועסק על מנת לבחון את התפקיד של הפרדה מרחבית במושבות חיידקים.
בסביבה, biofilms קהילות multispecies מוקף 13 מטריקס פולימריים בהפקה עצמית. מבנה biofilm, פונקציה ויציבות תלויה רשת מורכבת של אינטראקציות חברתיות שבם אותות חליפי חיידקים, רכיבי מטריקס ומשאבים, או מתחרים ביניהם על מקום וחומרים מזינים באמצעות רעלים ואנטיביוטיקה. Subtilis Bacillus הוא אדמה שוכני חיידק מיישב-שורש מפתח מאורגן קהילות ביופילם 14. באנלוגיה כדי חברתיחרקים, B. תאי subtilis להעסיק חלוקת אסטרטגית עבודה, פיתוח תת-אוכלוסיות של מפיקי מטריקס ו קניבלים, תאי ניע, נבגים רדומים סוגי תאים אחרים 15,16. תהליך הבידול הוא דינמי ניתן לשנות על ידי תנאים סביבתיים 17,18.
אסטרטגיות של קולוניזציה שטח על ידי חיידקים ניתן להשפיע בקלות בתנאי מעבדה על ידי שינוי הריכוז אגר בתקשורת הצמיחה. ברמות נמוכות אגרו (0.2-0.3%), חיידקים מחסה שוטונים פעילים מסוגלים לשחות, תוך אגר חצי מוצק (0.7-1% אגרו) הופך לפשוט קהילה מונעת השוטון מתפשטת, שנקרא רוחשות 19-21. בהעדר השוטון, זני חיידקים מסוימים מסוגלים לנוע על פני בינוני חצי מוצק באמצעות הזזה, התרחבות האוכלוסייה התלויה צמיחה כלומר בהנחייתם מטריקס exopolysaccharide ותרכובות hydrophobin המופרשים אחרים 22-24. לבסוף, חיידקים אשר capablדואר של יוצרי מושבות פיתוח biofilm מורכבים מבחינה ארכיטקטונית על מדיום אגר קשה (1.2-2%) 14,17,25. בעוד תכונות אלה נבחנות במעבדה על ידי התאמת התנאים בדיוק, בבתי גידול טבעי אלה אסטרטגיות משטח-הפצה אולי המעבר בהדרגה מאחד לשני בהתאם לתנאי הסביבה 26. בעוד תנועתיות תא מבוססים הם קריטיים במהלך לתחילת עבודות הפיתוח ביופילם על הממשק הנוזל אוויר בשני חיידקים גראם-חיוביים -שלילית 27, biofilms מושבה המורכב של B. subtilis אינם מושפעים המחיקה של תנועתיות flagellar 28. עם זאת, הארגון המרחבי במהלך הפיתוח של B. biofilms מושבת subtilis תלוי בצפיפות של בידוד החיידקים בשימוש ליזום את ביופילם 8.
כאן, אנו משתמשים ב subtilis להראות שהפרדה מרחבית במהלך הקולוניזציה משטח תלוי במנגנון של motili האוכלוסייה ברמהty (כלומר רוחשות או זזה), ופיתוח ביופילם המושבה תלוי צפיפות התאים המייסדים. אנו מציגים כלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי שניתן ליישם כדי לפקח הצמיחה ביופילם מיקרוביאלי ברציפות, קולוניזציה משטח ומיון בקנה מידה מקרו. יתר על כן, שיטת כימות מוצגת לקבוע את שפע הזן היחסי באוכלוסייה.
Protocol
1. הכנה של התקשורת בתרבות, חצי מוצק אגר ו Biofilm צלחות, טרום תרבויות
- הכנה בינונית נוהרות ו זזים
- ממיסים 2 גרם של לנוקס מרק (LB) ו -0.7 גרם של אגר אגר ב 100 מ"ל מים החליפו יון החיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. השתמש בנפחים קטנים (50-200 מ"ל) כדי לשפר שחזור בין הניסויים.
- מיד לאחר עיקור, לסגור את הפקק של הבקבוק בינוני עד להפחית את אידוי ומניחים חממה 55 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2.
- לאחר לחום בינוני יש מזג ל -55 ° C, לשפוך בינוני 20 מ"ל אגר LB לתוך צלחת 90 מ"מ קוטר קלקר פטרי מתחת למכסה המנוע מעבדה סטרילית. בניסויים זמן לשגות, לשפוך בינוני 5 מ"ל אגר LB לכל 35 מ"מ צלחת בקוטר פוליסטירן פטרי.
- סגור את צלחת פטרי מיד לאחר לשפוך, מחסנית לא יותר מ -4 צלחות על גבי אחד את השני ולתת המדיום אגר לחזק לפחות שעה 1.
- 2xSG הבינוני Pפיצוי על Biofilms קולוני
- ממיסים 1.6 גרם של מרק מזין, 0.2 גרם של KCl, 0.05 גרם של MgSO 4 7H 2 O, ו -1.5 גרם של אגר אגר ב 100 מ"ל מים החליפו יון החיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. השתמש בנפחים קטנים (50-200 מ"ל) כדי לשפר שחזור בין הניסויים.
- מיד לאחר עיקור, לסגור את הפקק של הבקבוק בינוני עד להפחית את אידוי ומניחים את הבקבוק בתוך חממה 55 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2.
- לאחר לחום בינוני יש עונתיות עצמית ל -55 מעלות צלזיוס, להוסיף 0.1 מ"ל מסנן עיקור 1M Ca (NO 3) 2 פתרון, 0.1 מ"ל מסנן לעקר 100 מ"מ MnCl 2 פתרון, 0.1 מ"ל מסנן מעוקר 1 מ"מ FeSO 4 פתרון, ו -0.5 מ"ל פתרון 20% גלוקוז סטרילי.
- במנדף מעבדה סטריליים, לשפוך בינוני SG 2x אגר 20 מ"ל לכל צלחת קלקר 90 מ"מ קוטר פטרי. בניסויים זמן לשגות, לשפוך בינוני 5 מ"ל אגר LB לכל 35 מ"מ צלחת בקוטר פוליסטירן פטרי.
- קלודואר צלחת פטרי מיד לאחר המזיגה, לערום את הצלחת על גבי אחד את השני, אך לא יותר מ -4 צלחות, ולתת המדיום אגר לגבש במשך שעה 1 לפחות.
- הכנת תרבויות Starter
הערה: ב subtilis 168, זנים נגזרים NCIB 3610 משמש השיטות המתוארות להלן constitutively לייצר חלבונים בירוק או באדום-הקרינה ותוארו לפני 8,27. זנים מאוחסנים באופן שגרתי במקפיא -80 ° C.- לחסן תרבויות המתנע ממניות -80 מעלות צלזיוס ב 3 מ"ל מדיום LB דגירה לילה (16-18 שעות) בשעה 37 ° C עם רעד אופקי (225 סל"ד). אין דגירה התרבות כבר מ -18 שעות כמו פרא מבודד של B. subtilis נוטה בעיקר כדי לצבור ויוצרים ביופילם במבחנה.
2. Co-חיסון של זני חיידקים Labelled fluorescently עבור Surface הפצת
- ייבוש צלחות אגרו חצי מוצק נחילהזזה של B. subtilis.
- צלחות אגרו יבשות רוחשות ומחליק במשך 20 דקות לפני החיסון. צלחות יבשות חשפו במנדף זרימה למינרית (ראו איור 1).
הערה: רוחש חיידקים זזים תלויה היובש של המדיום אגר חצי המוצק. ייבוש מספיק מאפשר הצטברות מים על המדיום אגר וכתוצאה מכך שחייה בתיווך השוטון. תוצאות זמן ייבוש מתמשכות חוסר הרעש.
- צלחות אגרו יבשות רוחשות ומחליק במשך 20 דקות לפני החיסון. צלחות יבשות חשפו במנדף זרימה למינרית (ראו איור 1).
איור 1:.. עבודה ניסויית ההליך הנפוץ מתואר באיור, כולל הכנה של המדיום culturing, לייבש את הצלחת, חיסון וזיהוי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (משמאל לימין) לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- Co-חיסוןשל תרבויות חיידקים עבור נוהרות ו הזזה
- לקבוע את הצפיפות האופטית של תרבויות המתנע הלילה ב 600 ננומטר ומערבבים זנים בייצור בירוקים ואדום-ניאון מנורמל צפיפות חלבון של B. subtilis NCIB 3610 או נגזרים המכשפה Δ שלה בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר תגובה. לדוגמה, לערבב 100 μl של זן 1 עם (100 [OD 600 של תרבות הלילה של זן 1] * / [OD 600 של תרבות הלילה של זן 2]) μl של זן 2. במתינות מערבולת (3 שניות במהירות מקסימלית) עבור חלוקה הומוגנית.
הערה: ב זני subtilis NCIB 3610 הם מחוסן להתבונן רוחשת, בעוד נגזר המכשפה Δ שלהם משמשים זזה. - ספוט 2 μl של תרבות מעורבת על אמצע צלחת מראש יבשים (ראה איור 1) ובהמשך לייבש את הצלחת במשך 10 דקות לאחר חיסון.
- דגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס זקופה כדי לאפשר לחות עודפת להתעבות על המכסה ולא על פני השטח אגר. <br /> הערה: זמן דגירה של B. רוחשת subtilis היא בדרך כלל בין 8-16 שעות. באופן כללי, שפת הנחיל מגיע הצד של המנה 90 מ"מ פטרי ב 8 שעות. זזה היא תהליך איטי ודורשת לפחות 16 כדי 42 שעות של דגירה. לאחר 36 שעות, בחזית הזזה מגיע הצד של המנה 90 מ"מ פטרי.
- בניסויי זמן לשגות, למקם את כלי 35 מ"מ קוטר פטרי בתא דגירה בשלב שחומם מראש נקבע על 37 מעלות צלזיוס. ודא כי המכסה של צלחת פטרי נשאר סיר לאורך כל תקופת הניסוי. הגדר את השער של חממת הבמה כדי 40 מעלות צלזיוס לעקוף היווצרות לחות על החלק העליון של החממה.
- לקבוע את הצפיפות האופטית של תרבויות המתנע הלילה ב 600 ננומטר ומערבבים זנים בייצור בירוקים ואדום-ניאון מנורמל צפיפות חלבון של B. subtilis NCIB 3610 או נגזרים המכשפה Δ שלה בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר תגובה. לדוגמה, לערבב 100 μl של זן 1 עם (100 [OD 600 של תרבות הלילה של זן 1] * / [OD 600 של תרבות הלילה של זן 2]) μl של זן 2. במתינות מערבולת (3 שניות במהירות מקסימלית) עבור חלוקה הומוגנית.
3. Co-חיסון של זני חיידקי Labelled fluorescently עם צפיפות תא ראשונית שונה
- ייבוש צלחות אגר עבור גיבוש המושבה Biofilm של B. subtilis.
- ייבש את הצלחות לפיתוח biofilm המושבה ללא כיסוי בזרימה למינריתמכסה מנוע במשך 15 דקות לפני החיסון.
הערה: תוצאות ייבוש אין מספיק לחות מוגברת ושחייה או רוחש ייתכן שניתן 29. ייבוש תוצאות ארוכות מדי במושבות ביופילם קטנות.
- ייבש את הצלחות לפיתוח biofilm המושבה ללא כיסוי בזרימה למינריתמכסה מנוע במשך 15 דקות לפני החיסון.
- הכנת תרבויות Starter מדולל פי 10 עבור Biofilms קולוני
- מערבבים 100 μl של חלבון בירוק ואדום-ניאון ייצור של Starter Culture לילה של B. subtilis 168 בתוך שפופרת 1.5 תגובה מ"ל ו במתינות מערבולת עבור חלוקה הומוגנית. כן סדרת דילול של פי 10 במדיום LB.
- ספוט 2 μl של הלא מדולל או 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 תרבויות מעורבות מדולל על הצלחת המכיל בינוני וישכנע ביופילם.
הערה: 6 עד 9 מושבות ביופילם יכולות להיות יזם על אף מנה 90 מ"מ פטרי תוך לקיחה בחשבון כי המושבות מופרדות במרחק שווה זה מזה. - דגירת צלחות על 30 מעלות צלזיוס זקופה כדי לאפשר לחות עודפת להתעבות על המכסהלא על פני השטח אגר.
הערה: זמן הדגירה של B. ביופילם subtilis הוא בין 1 עד 3 ימים. באופן כללי, ביופילם מושבה של B. subtilis מגיע לגודל הממוצע שלה מבנה מורכב ב 2 ימים. - בניסויי זמן לשגות, להציב בידוד יחיד באמצע צלחת 35 מ"מ קוטר פטרי במקום צלחת בתא דגירה בשלב שחומם מראש נקבע על 30 מעלות צלזיוס. ודא כי החלק העליון של צלחת פטרי נשאר סיר לאורך כל תקופת הניסוי. הגדר את השער של חממת הבמה כדי 35 מעלות צלזיוס לעקוף היווצרות לחות על החלק העליון של החממה.
4. איתור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של זני Labelled
- תיאור מכשור הדמיה.
- כדי לזהות קולוניזציה שטח אותות קרינה, השתמש במיקרוסקופ זום סטריאו קרינה הממונע (ראה רשימה מפורטת בטבלת חומרים) מצויד מטרת 0.5x PlanApo, שני LEDמקורות קרים-אור (אחד עבור גילוי קרינה ואחד עבור האור הנראה), מערכות סינון עבור GFP (עירור ב 470/40 ננומטר פליטה ב ננומטר 525/50) ו mRFP (עירור ב 572/25 ננומטר פליטה ב 629 / 62 ננומטר), ומצלמה מונוכרום ברזולוציה גבוהה.
- בצע רכישת תמונה ועיבוד עם תוכנה מתאימה זמינה עבור מיקרוסקופ זום סטריאו כולל רבים ומודולים הזמן לשגות. לצורך ניסוי זמן לשגות, להשתמש חממה בשלב החימום תקן רכוב על מיקרוסקופ זום סטריאו עם מתאם.
- הדמיה של רוחשות ורחבה זזות
- השתמש ההגדלה הנמוכה ביותר כדי ללכוד את האזור הגדול ביותר האפשרי של צלחת 90 מ"מ. הגדר את מקור החיסון (באמצע צלחת 90 מ"מ פטרי) אל פינת השדה הגלוי לניטור הרחבה רדיאלי חיידקי קרינה.
- התאם זמן חשיפה אופטימלית תלוי בכוחו של אותות הקרינה.
הערה: לקבלת expre constitutivelyגני קרינת ssed ב B. subtilis, ירוק ו-קרינה אדומה עם זמני חשיפה שני 1.5 ו -3 ניתן להשתמש, בהתאמה. בנוסף, 10 זמן חשיפה msec מתאים האור הנראה.
- השתמש הגדלה המאפשר זיהוי של המושבה ביופילם כולו ולהתאים את המושבה באמצע שדה הראייה.
הערה: באשר שורצים ומחליקים הרחבות, פעמים חשיפה אופטימלית כדי לזהות את אותות הקרינה במושבות ביופילם תלוי ברמת הביטוי של הגנים המקודדים חלבונים ניאון. לקבלת תוצאות הנציג להלן, קרינה אדומה בירוקה ו זוהתה באמצעות מרווחי חשיפת שניות 1 ו -3, בהתאמה. - עבור הדמיה זמן לשגות, להשיג תמונות במרווחי זמן מסוימים באמצעות פעמים חשיפה מתמדת.
- שמור את התמונות המוקלטות הקרינה סטראו בתבנית קובץ כי הוא מוכר על ידי תוכנת ImageJ לניתוח נתונים כמותיים.
5. Datניתוח
- כדי לנתח את השטח הכבוש על ידי כל זן ניאון שכותרתו שונה, פתח את הקובץ של העניין ImageJ תוכנה מורחב עם תוסף BioVoxxel.
- כאשר חלון בשם "ביו-פורמטי אפשרויות יבוא" מופיע שם רק את האפשרויות "פותחים את כל הסדרה" ו "Autoscale" נבחרות, לפתוח את הקובץ על-ידי לחיצה על "אישור".
הערה: הקבצים מוצגים ערימה של שלוש תמונות, אחת עבור כל ערוץ נהג להקליט תמונת המיקרוסקופ (בירוק, אדום-קרינה ותמונות שדה בהיר). - הפרד את המחסנית לתוך תמונות ערוץ בודדות על ידי בחירה "תמונה" - "סטאקס" - "סטאק תמונות" בלוח בקרת ImageJ.
הערה: תמונות מופיעות ממוספרות כמו 1/3 (מסלול ירוק), 2/3 (מסלול אדום) ו 3/3 (בהיר שדה). כאן, בתמונת השדה הבהיר היא נכללת בניתוח.
- כאשר חלון בשם "ביו-פורמטי אפשרויות יבוא" מופיע שם רק את האפשרויות "פותחים את כל הסדרה" ו "Autoscale" נבחרות, לפתוח את הקובץ על-ידי לחיצה על "אישור".
- כדי לנתח את התמונות, לשנות כל לתמונה 8 סיביות על ידי בחירת"תמונה" - "סוג" - "8-bit".
- כדי לקבוע את האזור הכבוש פיקסל 2, לאפס את קנה המידה של תמונות באמצעות "ניתוח" - "קנה מידה 'מוגדר". כאשר יופיע חלון עם אפשרויות בקנה מידה אחרות, לאפס את קנה המידה על ידי בחירה "לחץ כדי להסיר סולם". סמן את האפשרות "גלובל" כדי להסיר את קנה המידה עבור כל התמונות הפתוחות.
- כדי להסיר את הרקע, לצייר שטח סגלגל (אזור של עניין, החזר על השקעה) מחוץ לאזור פלורסנט שימוש באפשרות "הסגלגל" בלוח בקרת ImageJ.
- כדי להבטיח שגודל הסגלגל רקע זהה עבור כל התמונות ניתחו, להוסיף אותו מנהל ROI באמצעות [t] אופי של המקלדת. חלון מנהל ROI עולה שבו ROI הרקע הסגלגל ניתן לשמור באמצעות "יותר" - "שמורות" אפשרויות.
- אם ההחזר על ההשקעה רקע סגלגל גלוי על התמונה, למדוד את העוצמה של האזור על ידי בחירת "נתח" - "מדוד".
הערה: תוצאותיופיע חלון שבו בין היתר את עוצמת הקרינה הממוצעת מוצגת בעמודה שכותרתה "Mean". - הפחת את הערך של עוצמת קרינת רקע הממוצעת מהתמונה ידי ביטול בחירת ההחזר על השקעת הרקע הסגלגלה, לחיצה על "תהליך" - "מתמטיקה" - "פחת" והחדרת הערך הנמדד.
- החלת סף לדימוי באמצעות "התמונה" - "התאם" - אפשרות "סף". בחר את שיטת Otsu ושחור-לבן (B & W). סמן את האפשרות "הרקע האפל" ולהעסיק את הסף על ידי לחיצה על "החל".
הערה: שינויי תמונת תמונה בינארית שבו האזור שמעל הסף מוצג בלבן וכי מתחת לסף מוצג שחור. - בחר הכל מעל הסף דרך "נתח" - האפשרות "נתח חלקיקים". בחלון עם ההגדרות, לשמור את אפשרויות ברירת המחדל ולשמור על "הצג תוצאות" ו "Summarize "אפשרויות מסומנות. לחץ על" אישור "כדי להציג את הסיכום בחלון התוצאות והתצוגה באזור הכבוש בעמודה שכותרתה" סה"כ שטח ".
Representative Results
מערכות מעבדה של אוכלוסיות חיידקים לספק גישה מושכת לחקור שאלות אקולוגיות או אבולוציונית. כאן, שלושה מצבי קולוניזציה השטח של B. subtilis שמש כדי לבדוק את המראה של מגוון אוכלוסייה, כלומר הפרדה בין זהה מבחינה גנטית, אבל fluorescently שונה שכותרתו זנים. נוהרות, שהיא תנועת משטח קולקטיבי תלויה השוטון של B. subtilis, תוצאות באוכלוסייה מעורבת מאוד. במושבות השורצות אלה, חיידקים בירוקים ואדום-ניאון באזורים נשבו היו חופפים (ראו איור 2 א). הקולוניזציה המשטח המהיר ניתן בעקבות בזמן (וידאו איור 1). במהלך רוחשת של subtilis B, שכבה דקה של תאים מתרחב ממרכז חיסון אחרי כמה שעות של דגירה (ראה תרשים 2B).
4752 / 54752fig2.jpg "/>
איור 2: נוהרות הרחבת B. . subtilis המושבה הרוחשות מכיל זנים בירוק ואדום-ניאון כי היו מעורבים 1: 1 לפני חיסון. (א) לאחר 15 שעות, הקפסולה הירוקה-שחורה האדום פלואורסצנטי (GFP ו RFP, בהתאמה) התגלה עם מסנני קרינה מתאימים. (ב) תמונות של שכבה דקה של B. רוחשת subtilis מוצגים בנקודות נבחרות זמן מופק וידאו באיור 1. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עם זאת, כאשר ב זני subtilis, כי חסרי שוטונים פונקציונליים אך הם מסוגלים להתפשט בעזרת מיוצר exopolysaccharide, hydrophobin ו surfactin, נראו על מדיום אגר חצי מוצק, זני שכותרתו השונה הופרדו def מסויםמגזרים שאינם עומדים (ראה איור 3 א). התפתחות המושבה הזזה ניתן להקליט בזמן (ראה איור 3B או וידאו איור 2).
איור 3: זזת מושבה של B. . subtilis המושבה מכיל זנים בירוק ואדום-ניאון כי היו מעורבים 1: 1 לפני חיסון. (א) לאחר 24 שעות, הקפסולה הירוקה-שחורה האדום פלואורסצנטי (GFP ו RFP, בהתאמה) התגלה עם מסנני קרינה מתאימים. (ב) תמונות של B. subtilis זזה דיסק מוצגת בנקודות זמן שנבחרו המופקות בר סולם וידאו איור 2. = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בעוד רמות מבחר נחיל SLIמושבות דינג הרחבה לא ניתן לשנות אותם, ההפרדה המרחבית של זני ניאון שכותרתו השונה במהלך biofilm המושבה יכולה להיות מושפעת צפיפות תא מוצא. כאשר ביופילם מושבה של B. subtilis יזמה עם צפיפות תא הגבוה של האוכלוסייה המעורבת, הזנים הירוקים-ואדום-ניאון הראו קטין או לא מבחר מרחביים (ראה איור 4). נהפוך הוא, כאשר צפיפות התאים ליזום את biolfilm היה נמוך, מגזרים בירוק ואדום הקרינה ברור ניתן היה לזהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. רמת מבחר הייתה תלויה בבירור במישור דילול אוכלוסיית הייזום ביופילם. וידאו איור 3 ו -4 מציגים את הרחבת המושבה עבור הדילול הנמוך ביותר והגבוה ביותר של הזנים המחוסנים.
איור 4: רמת מבחר ב biofilms מושבה של B. subtilis ב. צפיפות תא ראשונית שונה biofilms המושבה של זנים בירוק ואדום קרינה מוצגת לאחר 2 ימים כי היו מחוסנים עם צפיפות תא ראשונית שונה (מלמעלה עד למטה: הלא מדוללים ל 10 5 פעמים בדילול ייזום תרבויות, בהתאמה). סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יחס זנים בירוק ואדום-ניאון ניתן לכמת נוספת באמצעות תוכנת ImageJ המאפשר אפיון כמותי של מבנה האוכלוסייה competiveness של זנים המשמשים בניסויים.
וידאו איור 1: מתאר לעצמי זמן לשגותes של B. הרוחשת subtilis יזם עם 1:. 1 תערובת של זנים בירוקים ואדום-ניאון (קליק ימני להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 10 שעות. סרגל קנה מידה = 7 מ"מ.
וידאו איור 2: תמונות זמן לשגות של זזה ב subtilis יזם עם 1:. 1 תערובת של זנים בירוקים ואדום-ניאון (קליק ימני להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 24 שעות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.
וידאו איור 3: תמונות של מעבר זמן של B. biofilms המושבה subtilis יזם עם 1: 1 תערובת של ירוק-. זנים אדומים-ניאון בצפיפויות תא גבוהות (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 48 שעות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.
וידאו איור 4: תמונות של מעבר זמן של B. המושבה subtilis biofilms יזם עם 1: 1 תערובת של זנים בירוק ואדום-ניאון בצפיפויות התא נמוכה. (קליק ימני להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 48 שעות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.
Discussion
הזמינות של ארגז כלים פלורסנט לחיידקים מקלה לא רק המחקר של ביטוי גנים הטרוגנית 30,31 וחלבון לוקליזציה 32, אבל גם ניתוח ההתפלגות המרחבית של זנים בתוך אוכלוסיה 8. סמנים פלורסנט עם אורכי גל עירור ופליטה שונים מספיק לאפשר למקם בבירור שני זנים כי אחרת הם נבדלים זה מזה כאשר מעורבב. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מועסק על התבוננות הדינמיקה באוכלוסייה בתרבויות מעורבות, ניסויי תחרות למשל או סינרגיזם בין זנים או מינים. היכולת לקבוע את שכיחותם היחסית של שכותרתו fluorescently זנים באוכלוסייה מעורבת אינה מוגבלת על פני שטח רוחש מצורף, זזה, או מושבות ביופילם, אבל יכולה לשמש גם עבור מערכות biofilm תאיים אחרות, כוללת מתחת למים, לזרום ממשק תא או אוויר-בינוני biofilms 27,33-35.
_content "> בעוד טכניקת המוצג הינו כלי רב עוצמה כדי לזהות הפריסה המרחבית של זנים וניסויים תחרות עיצוב, הוא גם מאפשר הבאים ההטרוגניות ביטוי גנים במושבות מתרחבת. תנאי culturing המתואר כאן לבקש 'subtilis ואת הפרמטרים המדויקים להרחבת על אגרתי תקשורת עשויה לדרוש אופטימיזציה עבור מינים אחרים או זני 20. הצבת הדגימות בתא דגירה בעוד הדמיה מאפשרת הנסיין אחרי דינמיקת האוכלוסייה בזמן, אם כי יש לשים לב לרמת הלחות בתוך החדר במהלך הדגירה.הטכניקות המתוארות כאן גם דורשות השינוי הגנטי של זני חיידקים שנבדקו כך הזנים להביע סמני ניאון אשר ניתן להבחין בין זה לזה. יתר על כן, חוץ מזה שיש עירור ברור ספקטרום פליטה, מומלץ כי שני סמנים הניאון נבחרו יש קוואנט דומהתשואות אממ (יחס כלומר של פוטונים נספגים נפלטים) ובאים לידי ביטוי ברמה דומה. בנוסף, שינויי עצמה יחסיים בזמן ניתן למדוד מנורמל ל-נקודת זמן מוקדמת של ניסוי. הגידול או הקיטון ביחס ניתן להשוות אז בין fluorophores השונה עם יעילות קוונטית שונה. עבור המערכת הניסיונית שהוצגה, חלבונים בירוקים ואדום-ניאון שונים נבדקו 36,37 בעבר כדי לבחור עבור זוגות פלורסנט האופטימליים ביותר שיכול להתגלות B. subtilis. שעת החשיפה האופטימלית צריכה להיקבע עבור כל חלבון פלואורסצנטי מדגם. צפיפות תא מסוימת או מספר שכבות של תאים עשוי להידרש לזהות את האות ביעילות בתוך האוכלוסייה. חלבוני ניאון מסוימים שאולי יש עוצמות נמוכות תאי חיידקיים בשל ביטוי יעיל ו / או תרגום של החלבון ולכן תשואת קוונטים נמוכה. כזה סמני ניאון יעילים יכול rלְהַסִיק הרגישות של המערכת ולהרחיב את הזמן הדרוש כדי לזהות את זני חיידקים ואולי וכתוצאה מכך רעילה על ידי אור העירור. עוצמות ניאון יכול להיות שונה בהתאם על ידי שינוי האמרגן להשתמש בהם כדי להביע את הגן קידוד כתב ניאון. רמת ביטוי גבוהה מדי עלולה לגרום עודף מיותר של החלבון פלואורסצנטי המוביל לעלויות כושר מזיק החיידק. בעת ביצוע ניסויי תחרות, אחד צריך לשקול את העלות של ייצור חלבון פלואורסצנטי מסוים בתאים. בקרת ניסויים, שבהם סמני הניאון הם החליפו בין זנים התחרו או שם שני זני isogenic נבדלים רק סמני הניאון שלהם התחרו אחד נגד שני, נדרשים תמיד לקבוע הטיות כלפי סמן אחד. עוד בימי חייהם של חלבוני ניאון בתוך התאים עשויים גם להשפיע על עוצמת נמדד. בנוסף, autofluorescence של מצלצלים מסוימים חיידקיםהים עשוי לדרוש את שימוש סמני ניאון אחרים מלבד מתואר כאן.
כדי לקבוע את ההפצות המרחבי במדויק שכיחותם של זני חיידקים השונים, אות הרקע שמקורם חלבון פלואורסצנטי הראשון תוך שימוש במסנן הקרינה עבור השני סמן ניאון ולהיפך צריכה להיבדק בנפרד על דגימות monoculture (המכילה חיידקים בייצור סמן יחיד ). זה מאפשר הפחתת חופפים עוצמות אות ניאון. חשוב לציין, כמו סטראו מתעדת את אותות הקרינה מלמעלה המושבה מתרחבת, פרוטוקול המוצג הינו נוח לקבוע את הסידור המרחבי בשני ממדים. הארכיטקטורה של אוכלוסיית חיידקי ההרחבה עלולה לגרום רמות קרינה משתנות (כלומר מבנים דמויי קמט עשויים להכיל תאים יותר מוצגי עוצמות קרינה מקומיות גבוהות). לכן, הניתוח שתואר של D תמונותetermines החלוקה המרחבית, אך לא בשפע של זנים הנמצאים במיקום מסוים. פרוטוקולים קודמים תארו את הכנת המדגם עבור רוחשות הדמית 20 או קרינה של דינמיקות אוכלוסייה באזורי מושבות חיידקי 38, אבל הפרוטוקול שלנו משלב טכניקות אלה. שיטות מיקרוסקופיה אחרות המאפשרות התצפית של רזולוציה תלת ממדים של מבנה האוכלוסייה (מיקרוסקופיית ליזר confocal למשל 39,40 או מיקרוסקופיה תאורה מובנית 41) יכולות להיות מיושמות על דגימות עם מורכבות מבנית מוגברת. טכניקות נוספות אלו תומכים גם זיהוי מבוסס תא בודד של הזנים 31 שאינו זמין באמצעות stereomicroscopes.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק KO4741 / 3-1 מן (DFG). יתר על כן, במעבדה של Á.TK נתמכה על ידי מענק אינטגרציה הקריירה מארי קירי Skłodowska (PheHetBacBiofilm) ולהעניק KO4741 / 2-1 מ DFG. TH, AD, RG-M., וא"מ נתמכו על ידי בית הספר הבינלאומי לחקר מקס פלאנק, קרן אלכסנדר פון הומבולדט, שירות המרת האקדמית Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-גרמנית (CONACyT-DAAD), ומלגות JSMC, בהתאמה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
