Summary
Il ruolo di assortimento (segregazione spaziale) in scenari evolutivi può essere esaminato utilizzando semplici sistemi microbici in laboratorio che permettono la regolazione della distribuzione spaziale controllato. Modificando la densità cellulare fondatore, vari livelli di assortimento possono essere visualizzati utilizzando ceppi batterici fluorescente nei biofilm colonie di Bacillus subtilis.
Introduction
Negli ultimi decenni, i microbi sono stati riconosciuti come comunità sociali connessi con i vari ecosistemi sulla terra 1,2. In contrasto con le culture planctoniche utilizzati in medicina generale di laboratorio, microbi nell'ambiente mostrano una vasta gamma di strutture comunitarie spaziali in base all'impostazione ecologica. Sistemi microbici semplici possono essere utilizzate per comprendere la conseguenza di strutture spaziali sull'evoluzione delle interazioni sociali 3,4. Pubblicazioni negli ultimi 2-3 anni, utilizzando entrambi i sistemi modello eucariotiche e procariotiche hanno evidenziato l'impatto delle strutture spaziali sulla stabilità della cooperazione all'interno delle popolazioni microbiche 5-8. Inoltre, obbligare le interazioni tra i microbi, ad esempio metabolica cross-alimentazione, potrebbe anche alterare la distribuzione spaziale dei partner che interagiscono 9-11. L'influenza della struttura spaziale in questi studi è in gran parte esaminata usando superficiali allegato cellule sessili che abitano il modobiofilm -definito o in colonie che cresce sulla superficie di un terreno agar. La deriva genetica con conseguente alta assortimento spaziale può essere osservato in colonie microbiche dove esaurimento degli elementi nutritivi al bordo di un risultato di espansione divisione cellulare mediata in serie di colli di bottiglia genetico che causa l'alta probabilità fissazione locale per alcuni linages clonali 12. deriva genetica può quindi essere utilizzato per esaminare il ruolo di segregazione spaziale nelle colonie microbiche.
Nell'ambiente, biofilm sono comunità multispecie circondati da autoprodotto matrice polimerica 13. Struttura biofilm, la funzione e la stabilità dipendono da una complessa rete di interazioni sociali in cui i segnali di scambio batteri, componenti e risorse matrice o competere per lo spazio e sostanze nutritive utilizzando le tossine e gli antibiotici. Bacillus subtilis è un terreno dimora e batterio root-colonizzazione che sviluppa altamente organizzato comunità biofilm 14. In analogia socialeinsetti, B. cellule subtilis impiegano una divisione di strategia di lavoro, lo sviluppo di sottopopolazioni di produttori della matrice extracellulare e cannibali, cellule mobili, spore dormienti e di altri tipi di cellule 15,16. Il processo di differenziazione è dinamico e può essere modificata da condizioni ambientali 17,18.
Le strategie di colonizzazione superficie di batteri possono essere facilmente manipolati in laboratorio modificando la concentrazione agar nel terreno di crescita. A livelli bassi di agar (0,2-0,3%), i batteri che ospitano flagelli attivi sono in grado di nuotare, mentre il semi-solido agar (0,7-1% agar) facilita la diffusione della comunità guidata flagello, chiamato brulicante 19-21. In assenza di flagellum, alcuni ceppi batterici sono in grado di muoversi su terreno semisolido mediante lo scorrimento, cioè la crescita espansione della popolazione dipendente facilitata dalla matrice esopolisaccaride e altri composti idrofobina secreti 22-24. Infine, i batteri che sono capable di forma di sviluppo del biofilm colonie architettonicamente complessi su agar duro (1.2-2%) 14,17,25. Mentre questi tratti sono esaminati in laboratorio regolando con precisione le condizioni, in habitat naturali queste strategie di superficie diffusione potrebbe transito gradualmente da una all'altra a seconda delle condizioni ambientali 26. Mentre singola motilità basato cellule è critico durante l'inizio dello sviluppo biofilm all'interfaccia aria-liquido in batteri sia Gram-positivi e quelli negativi 27, complessi biofilm colonie di B. subtilis non sono influenzati dalla cancellazione di flagellare motilità 28. Tuttavia, organizzazione spaziale durante lo sviluppo di B. subtilis biofilm colonia dipende dalla densità dell'inoculo batterico utilizzato per avviare il biofilm 8.
Qui, usiamo B. subtilis per mostrare che la segregazione spaziale durante la colonizzazione superficiale dipende dal meccanismo di livello di popolazione motility (cioè brulicante o scorrevoli), e lo sviluppo delle colonie biofilm dipende dalla densità cellulare fondatore. Presentiamo uno strumento microscopia a fluorescenza che può essere applicato per controllare continuamente la crescita microbica biofilm, colonizzazione superficiale e assortimento alla scala macro. Inoltre, un metodo di quantificazione è presentato per determinare la relativa abbondanza ceppo nella popolazione.
Protocol
1. Preparazione della Cultura Media, solidi semi-piastre di agar e biofilm Pre-culture
- Preparazione media per Swarming e scorrevole
- Sciogliere 2 g di Lenox Broth (LB) e 0,7 g di agar-agar in acqua scambio ionico 100 ml e autoclave per 20 min a 120 ° C. Usare piccoli volumi (50-200 ml) per migliorare la riproducibilità tra esperimenti.
- Subito dopo la sterilizzazione, chiudere il tappo della bottiglia mezzo per ridurre l'evaporazione e posto in un incubatore a 55 ° per almeno 2 ore.
- Dopo che la temperatura del fluido è temprato a 55 ° C, versare 20 ml di agar terreno LB in 90 mm di diametro polistirene Petri in un laboratorio cappa sterile. Per gli esperimenti time-lapse, versare 5 ml di agar LB medio per 35 millimetri di diametro polistirolo Petri.
- Chiudere la capsula di Petri Appena versato, non impilare più di 4 piatti uno sopra l'altro e lasciare il mezzo agar solidificare per almeno 1 ora.
- 2xSG Media Priparazione per Colony biofilm
- Sciogliere 1.6 g di Nutrient Broth, 0,2 g di KCl, 0,05 g di MgSO 4 7H 2 O e 1,5 g di agar-agar in acqua scambio ionico 100 ml e autoclave per 20 min a 120 ° C. Usare piccoli volumi (50-200 ml) per migliorare la riproducibilità tra esperimenti.
- Subito dopo la sterilizzazione, chiudere il tappo della bottiglia mezzo per ridurre l'evaporazione e posizionare la bottiglia in un incubatore a 55 ° per almeno 2 ore.
- Dopo che la temperatura media è auto-regolato a 55 ° C, aggiungere 0,1 ml sterilizzato per filtrazione 1M Ca (NO 3) 2 soluzione, 0,1 ml filtro sterilizzato 100 mM MnCl soluzione 2, 0,1 ml filtro sterilizzato 1 mM FeSO 4 soluzione e 0,5 ml soluzione di glucosio al 20% sterile.
- In un laboratorio cappa sterile, versare 20 ml di agar 2x SG media per 90 millimetri di diametro polistirolo Petri. Per gli esperimenti time-lapse, versare 5 ml di agar LB medio per 35 millimetri di diametro polistirolo Petri.
- Closè La capsula di Petri Appena versato, impilare il piatto sopra l'altro, ma non superiore a 4 piastre, e lasciare che il mezzo agar solidificare per almeno 1 ora.
- Preparazione di colture starter
NOTA: Il B. subtilis 168, NCIB 3610 ceppi derivati utilizzati nei metodi descritti di seguito costitutivamente produrre proteine a effetto serra o rosso-fluorescenza e sono stati descritti prima 8,27. I ceppi sono memorizzati routine nel -80 ° C freezer.- Seminare colture starter provenienti dalle scorte -80 ° C in 3 ml terreno LB e incubare una notte (16-18 ore) a 37 ° C con agitazione orizzontale (225 rpm). Non incubare la cultura più di 18 ore come selvaggia isola di B. subtilis sono per lo più inclini a aggregare e formare un biofilm in provetta.
2. Co-inoculo di fluorescenti Labelled batterica ceppi per Surface Spreading
- Essiccazione di piastre di agar semi-solidi per sciamatura eScorrevole di B. subtilis.
- piastre di agar a secco per brulicante e scorrevole per 20 minuti prima di inoculazione. Lastre secche scoperto in una cappa a flusso laminare (vedi Figura 1).
NOTA: swarming batterica e scorrevole dipende dalla secchezza del mezzo agar semisolido. essiccamento insufficiente consente accumulo di acqua sul mezzo agar conseguente nuoto flagellum-mediata. Risultati in tempo di essiccazione prolungati in mancanza di swarming.
- piastre di agar a secco per brulicante e scorrevole per 20 minuti prima di inoculazione. Lastre secche scoperto in una cappa a flusso laminare (vedi Figura 1).
Figura 1:.. Flusso di lavoro sperimentale La procedura comune è raffigurato nella figura, compresa la preparazione del mezzo di coltura, essiccazione del rilevamento piatto, l'inoculazione e microscopia a fluorescenza (da sinistra a destra) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Co-inoculodi colture batteriche per Swarming e scorrevole
- Determinare le densità ottiche delle colture starter durante la notte a 600 nm e mescolare densità normalizzati proteine ceppi produttori di serra e rosso-fluorescenti di B. subtilis NCIB 3610 o del suo derivato Δ HAG in una provetta da 1,5 ml di reazione. Ad esempio, mescolare 100 ml di ceppo 1 con (100 * [OD 600 di cultura durante la notte di tensione 1] / [OD 600 di cultura durante la notte di tensione 2]) pl di ceppo 2. Moderatamente vortice (3 sec alla massima velocità) per distribuzione omogenea.
NOTA: B. subtilis NCIB 3610 ceppi vengono inoculate ad osservare sciamare, mentre i loro derivati Δ HAG sono utilizzati per lo scorrimento. - Spot 2 ml di coltura mista al centro di una piastra pre-essiccato (vedi Figura 1) e asciugare ulteriormente la piastra per 10 minuti dopo l'inoculazione.
- Incubare le piastre a 37 ° C in posizione verticale per consentire l'umidità in eccesso condensare sul coperchio e non sulla superficie agar. <br /> Nota: il tempo di incubazione per B. subtilis sciamatura è in genere tra 8-16 ore. Generalmente, il bordo dello sciame raggiunge il lato del piatto 90 millimetri Petri in 8 ore. Scorrevole è un processo lento e richiede almeno il 16 al 42 ore di incubazione. Dopo 36 ore, il frontale scorrevole raggiunge il lato del piatto 90 millimetri Petri.
- Per gli esperimenti time-lapse, posizionare i 35 mm Diametro piastre di Petri in una camera di preriscaldato fase di incubazione a 37 ° C. Assicurarsi che il coperchio della scatola di Petri rimane rimossa per tutta la durata dell'esperimento. Impostare il coperchio dell'incubatore fase a 40 ° C per aggirare la formazione di vapore sulla parte superiore del termostato.
- Determinare le densità ottiche delle colture starter durante la notte a 600 nm e mescolare densità normalizzati proteine ceppi produttori di serra e rosso-fluorescenti di B. subtilis NCIB 3610 o del suo derivato Δ HAG in una provetta da 1,5 ml di reazione. Ad esempio, mescolare 100 ml di ceppo 1 con (100 * [OD 600 di cultura durante la notte di tensione 1] / [OD 600 di cultura durante la notte di tensione 2]) pl di ceppo 2. Moderatamente vortice (3 sec alla massima velocità) per distribuzione omogenea.
3. Co-inoculo di fluorescenza con etichette batteriche ceppi con differenti densità cellula iniziale
- Essiccazione di piastre di agar per Colony formazione di biofilm di B. subtilis.
- Asciugare le piastre per lo sviluppo delle colonie biofilm senza copertura in un flusso laminareCappuccio per 15 minuti prima di inoculazione.
NOTA: i risultati di asciugatura insufficiente in aumento di umidità e il nuoto o sciamare può essere possibile 29. Asciugatura troppo a lungo risultati in colonie biofilm piccoli.
- Asciugare le piastre per lo sviluppo delle colonie biofilm senza copertura in un flusso laminareCappuccio per 15 minuti prima di inoculazione.
- Preparazione di 10-fold colture starter diluita per Colony biofilm
- Mescolare 100 ml di proteine serra e rosso fluorescente che producono colture starter durante la notte di B. subtilis 168 in un tubo di reazione da 1,5 ml e leggermente vortex per la distribuzione omogenea. Preparare serie di 10 volte la diluizione in terreno LB.
- Spot 2 ml di non diluito o 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 colture miste diluito sulla piastra contenente medio biofilm che inducono.
NOTA: 6 a 9 colonie biofilm possono essere avviate una singola 90 millimetri Petri tenendo conto che le colonie sono separati ad uguale distanza l'uno dall'altro. - Incubare le piastre a 30 ° C in posizione verticale per consentire l'umidità in eccesso condensare sul coperchio enon sulla superficie agar.
NOTA: Il tempo di incubazione per B. subtilis biofilm è tra 1 a 3 giorni. Generalmente, la colonia biofilm di B. subtilis raggiunge la dimensione media e struttura complessa in 2 giorni. - Per gli esperimenti time-lapse, posizionare un singolo inoculo nel mezzo di un diametro di Petri 35 millimetri e mettere il piatto in una camera di preriscaldato fase di incubazione impostato a 30 ° C. Assicurarsi che la parte superiore del piatto Petri rimane rimossa per tutta la durata dell'esperimento. Impostare il coperchio dell'incubatore fase a 35 ° C per aggirare la formazione di vapore sulla parte superiore del termostato.
4. fluorescente Microscopia Individuazione di ceppi con etichette
- Descrizione delle attrezzature per l'imaging.
- Per rilevare la colonizzazione della superficie e segnale di fluorescenza, utilizzare un microscopio zoom motorizzato stereo a fluorescenza (vedi elenco dettagliato dei Materiali tabella) dotata di un obiettivo 0.5X Planapo, due LEDsorgenti a luce fredda (uno per il rilevamento della fluorescenza e uno per la luce visibile), set di filtri per la GFP (eccitazione a 470/40 nm ed emissione a 525/50 nm) e MRFP (eccitazione a 572/25 nm ed emissione a 629 / 62 nm), e una telecamera monocromatica alta risoluzione.
- Eseguire l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini con software appropriato a disposizione per il stereo microscopio con zoom compreso multicanale e moduli time-lapse. Per esperimento lasso di tempo, utilizzare un incubatore standard di fase di riscaldamento montato il microscopio zoom stereo con un adattatore.
- Imaging di sciamatura e di espansione scorrevole
- Utilizzare l'ingrandimento più basso per catturare la più grande area possibile del piatto 90 mm. Impostare l'origine di inoculazione (centro del piatto 90 millimetri Petri) all'angolo del campo visibile per il monitoraggio radiale espansione batterica e fluorescenza.
- Regolare il tempo di esposizione ottimale a seconda della forza del segnale di fluorescenza.
NOTA: Per espres costitutivamentegeni fluorescenza ssed in B. subtilis, verde-rosso e fluorescenza con tempi di esposizione 1,5 e 3 sec possono essere utilizzati rispettivamente. Inoltre, il tempo di esposizione 10 msec è appropriato per la luce visibile.
- Utilizzare l'ingrandimento che permette la rilevazione di tutta la colonia biofilm e regolare la colonia nel centro del campo di vista.
NOTA: Per quanto riguarda la brulicante ed espansioni di scorrimento, i tempi di esposizione ottimali per rilevare i segnali di fluorescenza delle colonie biofilm dipende dal livello di espressione dei geni codificanti proteine fluorescenti. Per i risultati rappresentativi qui sotto, verde-rosso-e la fluorescenza è stato rilevato utilizzando intervalli di 1 e 3 di esposizione sec, rispettivamente. - Per l'imaging time-lapse, ottenere immagini a determinati intervalli utilizzando tempi di esposizione costante.
- Salvare le fluorescenza stereomicroscopio immagini registrate in un formato di file che è riconosciuto dal software ImageJ per l'analisi dei dati quantitativi.
5. Datun'analisi
- Per analizzare l'area occupata da ogni ceppo fluorescente diversamente etichettato, aprire il file di interesse per il software ImageJ ampliato con un plugin BioVoxxel.
- Quando una finestra chiamata "Bio-Formati opzioni di importazione" appare in cui solo le opzioni "Apri tutte le serie" e "Autoscale" sono selezionati, aprire il file facendo clic su "OK".
NOTA: I file vengono visualizzati come una pila di tre immagini, una per ciascun canale utilizzato per registrare un'immagine al microscopio (verde-rosso-fluorescenza e campo chiaro immagini). - Separare la pila in immagini dei singoli canali selezionando "Immagine" - "Stack" - "Stack di immagini" nel pannello di controllo ImageJ.
NOTA: Le immagini appaiono e sono numerati come 1/3 (canale verde), 2/3 (canale rosso) e 3/3 (campo chiaro). Qui, l'immagine in campo chiaro viene escluso dall'analisi.
- Quando una finestra chiamata "Bio-Formati opzioni di importazione" appare in cui solo le opzioni "Apri tutte le serie" e "Autoscale" sono selezionati, aprire il file facendo clic su "OK".
- Per analizzare le immagini, trasformare ogni in un'immagine a 8 bit selezionando"Immagine" - "Tipo" - "8-bit".
- Per determinare l'area occupata in pixel 2, ripristinare la scala delle immagini usando "Analizza" - "Imposta Scale". Quando si apre una finestra con le opzioni di scala differenti, resettare la scala selezionando "Clicca per rimuovere le incrostazioni". Selezionare l'opzione "Global" per rimuovere la scala per tutte le immagini aperte.
- Per rimuovere lo sfondo, disegnare un'area ovale (regione di interesse, ROI) al di fuori della zona a fluorescenza tramite funzione "ovale" nel pannello di controllo ImageJ.
- Per assicurare che la dimensione dello sfondo ovale è la stessa per tutte le immagini analizzate, aggiungerlo al gestore ROI tramite [t] carattere della tastiera. Una finestra ROI Manager viene fornito da dove il ROI ovale sfondo può essere salvato tramite "More" - opzioni "Salva".
- Se lo sfondo ROI ovale è visibile sull'immagine, misurare l'intensità della zona scegliendo "Analisi" - "misura".
Nota: i risultati Afinestra dove tra gli altri è visualizzata l'intensità di fluorescenza media nella colonna denominata "Media". - Sottrarre il valore dell'intensità media fluorescenza di fondo dall'immagine deselezionando sfondo ROI ovale, cliccando su "Processo" - "Math" - "Sottrarre" e inserendo il valore misurato.
- Applicare una soglia per l'immagine tramite il "Immagine" - "Regolare" - opzione "Threshold". Selezionare il metodo di Otsu e in bianco e nero (B & W). Selezionare l'opzione "sfondo scuro" e impiegare la soglia facendo clic su "Applica".
NOTA: L'immagine modifiche a un'immagine binaria dove l'area al di sopra della soglia è mostrato in bianco e che al di sotto della soglia appare in bianco. - Seleziona tutto sopra della soglia tramite il "Analizza" - l'opzione "Analizza Particelle". Nella finestra delle impostazioni, mantenere le opzioni predefinite e mantenere i "Risultati" e "Summarize "opzioni selezionate. Fai clic su" OK "per visualizzare il riepilogo nella finestra dei risultati e sul display l'area occupata nella colonna denominata" Superficie Totale ".
Representative Results
sistemi di laboratorio di popolazioni batteriche forniscono un approccio interessante per esplorare questioni ecologiche o evolutive. Qui, tre modalità superficie di colonizzazione di B. subtilis sono stati usati per osservare l'aspetto di assortimento popolazione, cioè la separazione delle geneticamente identici, ma fluorescenza diversa ceppi etichettati. Brulicante, che è un flagello dipendente movimento di superficie collettiva di B. subtilis, i risultati in una popolazione altamente mista. In queste colonie brulicanti, i batteri serra e rosso-fluorescenti aree colonizzate sono stati di sovrapposizione (vedi Figura 2A). La colonizzazione della superficie rapida può essere seguito in tempo (Video Figura 1). Durante brulicante subtilis B, un sottile strato di cellule espande dal centro inoculo dopo poche ore di incubazione (Figura 2B).
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Figura 2: Swarming espansione B. . subtilis La colonia brulicante contiene ceppi serra e rosso fluorescente che sono stati mescolati 1: 1 prima dell'inoculazione. (A) Dopo 15 ore, la serra e il rosso-fluorescenza (GFP e RFP, rispettivamente) sono stati rilevati con opportuni filtri fluorescenza. (B) di strato sottile di swarming B. subtilis sono mostrati in momenti selezionati estratti dal video Figura 1. Barra di scala = 5 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tuttavia, quando B. ceppi subtilis, che mancano flagelli funzionale, ma sono in grado di diffondere con l'aiuto di prodotti esopolisaccaride, idrofobina e surfattina, sono stati visti in semi-solido agar, i ceppi diverso marcati sono stati separati in taluni defsettori INED (vedi Figura 3A). Lo sviluppo della colonia scorrevole può essere registrata nel tempo (vedere Figura 3B o video Figura 2).
Figura 3: colonia scorrevole di B. . subtilis La colonia contiene ceppi serra e rosso fluorescente che sono stati mescolati 1: 1 prima dell'inoculazione. (A) Dopo 24 ore, la serra e il rosso-fluorescenza (GFP e RFP, rispettivamente) sono stati rilevati con opportuni filtri fluorescenza. (B) Immagini della B. subtilis disco di scorrimento sono mostrati in momenti selezionati estratti dal video Figura 2. Barra di scala = 5 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Mentre i livelli assortimento di brulicante e SLIcolonie in espansione ding non potevano essere modificati, la segregazione spaziale di ceppi fluorescenti diversamente etichettate nel biofilm colonia potrebbe essere influenzato dalle densità di cellule di partenza. Quando un biofilm colonia di B. subtilis è stato avviato con alta densità cellulare delle popolazioni miste, i ceppi serra e rosso fluorescente mostrato minore o nessuna assortimento spaziale (vedi Figura 4). Al contrario, quando la densità cellulare di avviare il biolfilm era basso, chiare settori serra e rosso-fluorescenza potrebbe essere rilevato mediante microscopia a fluorescenza. Il livello assortimento era chiaramente dipende dal livello di diluizione della popolazione avvio biofilm. Video Figure 3 e 4 presentano l'espansione colonia per il più basso e più alta diluizione dei ceppi inoculati.
Figura 4: livello di assortimento in biofilm colonie di B. subtilis a. varie densità iniziali di cellule I biofilm colonie di ceppi serra e rosso-fluorescenza sono mostrati dopo 2 giorni che sono stati inoculati con diverse densità di cellule iniziali (dall'alto verso il basso: non diluito a 10 5 volte diluiti avviando culture, rispettivamente). Barra di scala = 5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il rapporto di ceppi serra e rosso-fluorescenti può essere ulteriormente quantificato utilizzando il software ImageJ che permette la caratterizzazione quantitativa della struttura della popolazione e la competitività dei ceppi utilizzati per gli esperimenti.
Video Figura 1: Lasso di tempo images di sciamare B. subtilis iniziata con 1: 1. mix di ceppi serra e rosso fluorescente (Tasto destro del mouse per scaricare.) Il video mostra un andamento temporale di 10 ore. Barra di scala = 7 mm.
Video Figura 2: Time lapse immagini di scorrimento B. subtilis iniziata con 1: 1. mix di ceppi serra e rosso fluorescente (Tasto destro del mouse per scaricare.) Il video mostra un andamento temporale di 24 ore. Barra di scala = 5 mm.
Video Figura 3: Tempo immagini lasso di B. biofilm subtilis colonia avviate con 1: 1 mix di verde-. E ceppi rossi fluorescenti a densità cellula di alta (clic destro per scaricare.) Il video mostra un andamento temporale di 48 ore. Barra di scala = 5 mm.
Video Figura 4: Tempo immagini lasso di B. biofilm subtilis colonia avviate con 1: 1 mix di ceppi serra e rosso-fluorescenti a densità di cellule bassi. (Clic destro per scaricare.) Il video mostra un andamento temporale di 48 ore. Barra di scala = 5 mm.
Discussion
La disponibilità di una serie di strumenti fluorescente per batteri non solo facilita lo studio dell'espressione genica eterogeneo 30,31 e proteine localizzazione 32, ma anche l'analisi della distribuzione spaziale dei ceppi all'interno di una popolazione 8. marcatori fluorescenti con sufficientemente differenti eccitazione e di emissione permettono di localizzare distintamente due ceppi che altrimenti sono indistinguibili tra loro quando miscelato. Il protocollo descritto può essere impiegato per osservare le dinamiche di popolazione in colture miste, ad esempio esperimenti di competizione o di sinergia tra ceppi o specie. La capacità di determinare l'abbondanza relativa di fluorescente ceppi in una popolazione mista non è limitato alla superficie sciamare divisoria, scorrevoli o colonie biofilm, ma può essere utilizzato anche per altri sistemi biofilm multicellulari, compresi sommerso, flusso Interfaccia cella o aria medio biofilm 27,33-35.
_content "> Mentre la tecnica presentata è un potente strumento per rilevare la distribuzione spaziale dei ceppi e esperimenti di competizione disegno, ma consente anche seguente espressione genica eterogeneità colonie espansione. Le condizioni di coltura qui descritte sono valide per B. subtilis ei parametri esatti per espansione agar mezzi potrebbero richiedere ottimizzazione per altre specie o ceppi 20. ponendo i campioni in una camera di incubazione mentre l'imaging permette lo sperimentatore di seguire la dinamica di popolazione nel tempo, anche se attenzione dovrebbe essere dato il livello di umidità all'interno della camera durante l'incubazione.Le tecniche qui descritte richiedono anche la modificazione genetica dei ceppi batterici esaminati in modo che i ceppi esprimono marcatori fluorescenti che possono essere distinti l'uno dall'altro. Inoltre, oltre ad avere eccitazione distinte e spettri di emissione, si raccomanda che i due marcatori fluorescenti scelte devono quant similerendimenti um (ovvero rapporto fotoni assorbiti che vengono emessi) e sono espressi in un livello comparabile. Inoltre, variazioni di intensità relative in volta possono essere misurati e normalizzati per un tempo punto iniziale di un esperimento. L'aumento o la diminuzione relativa possono essere poi confrontati tra i diversi fluorofori con diverse efficienze quantiche. Per il sistema sperimentale presentato, proteine serra e rosso-fluorescenti diverse sono stati testati in precedenza 36,37 per selezionare le coppie fluorescenti più ottimali che possono essere rilevati in B. subtilis. Il tempo di esposizione ottimale dovrebbe essere determinata per ciascuna proteina fluorescente e campione. Alcuni densità cellulari o più strati di cellule potrebbero essere necessarie per rilevare il segnale in modo efficiente all'interno della popolazione. Alcune proteine fluorescenti possono avere basse intensità nelle cellule batteriche dovute alla espressione inefficiente e / o la traduzione della proteina e quindi bassa resa quantica. Tali marcatori fluorescenti inefficienti potrebbe restrarre la sensibilità del sistema e prolungare il tempo necessario per rilevare ceppi batterici con conseguente probabile citotossicità dalla luce di eccitazione. Le intensità fluorescenti possono essere di conseguenza modificate alterando il promotore utilizzato per esprimere il gene reporter codifica fluorescente. Un livello di espressione che è troppo alto può provocare sovrapproduzione inutile della proteina fluorescente che porta a costi di fitness pregiudizievoli per il batterio. Quando si esegue esperimenti di competizione, si dovrebbe considerare il costo di produzione particolare proteina fluorescente nelle cellule. esperimenti di controllo, dove i marcatori fluorescenti vengono scambiati tra i ceppi gareggiato o in cui due ceppi isogeni differiscono solo nei loro marcatori fluorescenti sono in competizione l'uno contro l'altro, sono sempre necessari per determinare qualsiasi tendenza verso un marcatore. Le vite delle proteine fluorescenti all'interno delle cellule potrebbero anche influenzare l'intensità misurata. Inoltre, l'autofluorescenza di alcune specie battericas potrebbe richiedere l'uso di marcatori fluorescenti differenti diverso da quello descritto qui.
Per determinare con precisione le distribuzioni spaziali e abbondanza dei ceppi batterici diversi, il segnale di fondo proveniente dalla prima proteina fluorescente mentre utilizzando il filtro a fluorescenza per il secondo marcatore fluorescente e viceversa dovrebbe essere testato singolarmente su campioni monocoltura (contenente batteri che producono solo segnalino ). Questo permette la sottrazione di sovrapposizione intensità di segnale fluorescente. È importante sottolineare che, come lo stereomicroscopio registra il segnale di fluorescenza da sopra colonia espansione, il protocollo presentato è conveniente per determinare la disposizione spaziale in due dimensioni. L'architettura della popolazione batterica espansione può provocare diversi livelli di fluorescenza (strutture cioè rughe simili possono contenere più celle visualizzazione superiori intensità di fluorescenza locali). Pertanto, l'analisi delle immagini descritto determines la distribuzione spaziale, ma non l'abbondanza dei ceppi in un determinato luogo. Precedenti protocolli descritto la preparazione del campione per sciamare 20 o imaging di fluorescenza della dinamica di popolazione nelle colonie batteriche 38, ma il nostro protocollo combina queste tecniche. Altre tecniche di microscopia che permettono l'osservazione di tre risoluzione dimensionale della struttura della popolazione (ad esempio confocale a scansione laser microscopia a 39,40 o strutturato illuminazione microscopia 41) possono essere applicati per i campioni con un aumento complessità strutturali. Queste tecniche aggiuntive supportano anche il rilevamento singola cellula base dei ceppi 31 che non è disponibile utilizzando stereomicroscopi.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla concessione KO4741 / 3-1 dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Inoltre, il laboratorio di Á.TK è stato sostenuto da un Marie Skłodowska Curie integrazione Career Grant (PheHetBacBiofilm) e concedere KO4741 / 2-1 dalla DFG. TH, AD, RG-M., E EM sono stati sostenuti da Max Planck Scuola Internazionale di Ricerca, Fondazione Alexander von Humboldt, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-tedesco Academic Exchange Service (CONACYT-DAAD), e borse di studio JSMC, rispettivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
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