Abstract
Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik membranların içindeki moleküllerin difüzyon çalışmak için güçlü bir tekniktir. FCS hücre zarındaki floresan etiketli moleküllerin moleküler konsantrasyon ve difüzyon katsayısının ölçmek olabilir. Bu teknik, (gerçek ölçüm süresi boyunca sonucu etkileyen işlemleri olmadan IE) sürekli halde bağışıklık hücrelerinin plazma membranında moleküllerin moleküler difüzyon karakteristiklerini yeteneğine sahiptir. FCS çok endojen proteinler için tipik bir seviyede ifade edilen proteinleri difüzyonunu çalışmak için uygundur. Burada, birincil lenfositleri üzerinde hücre zarı proteinlerinin difüzyon oranını belirlemek için basit ve sağlam bir yöntem olduğunu göstermiştir. antikor lekeli canlı hücreler ve kazanılmasından sonra sık görülen gözlemlere ölçümleri gerçekleştirmek için etkili bir yoldur açıklanmıştır. son gelişmelerverilmedi-kararlı floresan boyalar geliştirilmesinde ölçümler sırasında yoğun ağartıcı olmayan boyalar, uygun ilgi antikorlar eşleştirilmesiyle kullanılabilir. Buna ek olarak, bu hücre zarlarında ifade edilen proteinlerin genel bir özelliğidir yavaş difüzyon kişiler tespiti için verir. Oluşturulan otokorelasyon eğrileri moleküler konsantrasyon ve difüzyon parametreleri ayıklamak için analiz prosedürü vurgulanır. Özet olarak, FCS ölçümleri için temel protokol sağlanmıştır; o konfokal mikroskopi anlayışı ile ancak böyle moleküler difüzyon oranları gibi dinamik parametrelerini, ölçme teknikleri başka hiçbir önceki deneyimi ile immünolojistler tarafından takip edilebilir.
Introduction
Birçok bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını moleküler difüzyon ve zarlar içinde etkileşimler güveniyor. Biyolojik zarlar karmaşıktır ve hücre membranları 1 içindeki proteinlerin geçiş yayılma hızını etkileyebilir immün hücrelerin fonksiyonu için önemli olabilir birçok faktör. Son zamanlarda, doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait, doğal öldürücü (NK) hücreler, lenfosit, NK hücreleri 2 durumuna bağlı olarak, hücre zarı iki çalışılan protein ayırıcı difüzyon sergilediklerini göstermiştir.
Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), biyolojik zarlar içinde moleküler difüzyon oranları miktarının kapasitesine sahip bir tekniktir. Bu floresan sabit hacimde molekülleri etiketli ortalama difüzyon oranı, bir konfokal mikroskop tipik odak bildirir. Bu moleküler hareketi üzerine ortaya floresan dalgalanmaların ölçülmesine dayanırkararlı halde bir sistem. FCS yaygın çözelti içinde ve lipid zarlar içinde hem de floresan boyalar ve proteinlerin difüzyon incelemek için kullanılmıştır. Difüzyon hızını etkileyen diğer çıkış parametreleri de dolaylı olarak, bu şekilde incelenebilir (örneğin, protein ya da hücre membranları üzerinde moleküllerinin etkileşimleri konformasyonel değişiklikler) 3, 4. FCS tek-molekül tespiti için olasılığını sağlayan yüksek duyarlılığı nedeniyle diğer tekniklerle karşılaştırıldığında göze çarpıyor. Bu, çoğu proteinin 5 'nın endojen ekspresyonunun seviyeleri tipik milimolar aralığına nanomolar, moleküler konsantrasyonları için çalışır. çoğu diğer teknikler sadece protein ekspresyon düzeyleri hakkında nispi bilgi verirken Ayrıca, FCS, çalışılan hacmi içindeki proteinlerin mutlak sayısının bir yaklaşım verebilir. membranlar fluo dahil olan diğer yöntemler moleküler difüzyon oranlarını ölçmek için(Sıkı bağlamak) photobleaching sonra rescence kurtarma, tek parçacık izleme (SPT), çoklu iğne deliği FCS ve görüntü korelasyon yöntemleri. Sıkı bağlamak ve görüntü korelasyon yöntemleri genellikle moleküllerin 10 mutlak sayısı hakkında bilgi vermeyin topluluk teknikleri vardır. SPT ile karşılaştırıldığında, FCS verimi nüfusun ortalama karakterize açısından yüksektir. lazer odak içinde mevcut moleküllerin ortalama difüzyon oranı oldukça tek moleküllerin oranından daha ölçülür çünkü analizi de daha az talep ediyor. Özel mikroskoplar 11 mevcut değilse, standart SPT etiketleme tek moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlamak için çok düşük olması gerektiğinden Ayrıca, SPT, konsantrasyonları hakkında herhangi bir bilgi veremem. Öte yandan, FCS çalışılan moleküller mobil olmasını gerektirir. Bu sadece çok yavaş hareket eden herhangi bir farazi hareketsiz kesirleri veya molekülleri tespit olmayacaktır. moleküllerin difüzyon oranı ouzun edinimi süresi yaklaşık onda biri doğru FCS ölçümlerinin 3, 12 temsil olmayacak daha odak içinde bulunur. Bu nedenle, FCS tarafından kaydedilen difüzyon katsayıları to-hareketsiz-yakın ve çok yavaş fraksiyonlar yanı sıra dikkate alınır FRAP ve SPT gibi tekniklerden rapor difüzyon oranlarından daha hızlı olma eğilimindedir. SPT da olacak FCS daha moleküler nüfus içerisindeki difüzyon oranlarının değişkenliği daha ayrıntılı bir açıklama verecektir.
FCS heyecanlı hacmi içinde zamanla floresan dalgalanma rakamlarla. Membran ölçümleri durumunda, bu zarın aydınlatılmış bölgeye çevirir. Bu yazıda, bu tür dalgalanmalar Brown difüzyon sergileyen molekülleri tarafından uyarılan ve böylece ve uyarma hacminin dışında hareket gerçeğini kullanmaktadır. fluctua için birkaç olası kaynak vardırBu tür bağlayıcı unbinding tüm hücre zarı ligandı ya da hareket, yanıp sönen veya flüoroforlar, çevresel etkiler bir triplet halinin varlığı olarak floresans sinyalinde yonlar. Bu farazi hata kaynakları sonuçları doğru 12, 13 yorumlamak amacıyla bir FCS deney tasarımı dikkate alınması gerekir. Tipik olarak, biyolojik zarların yanal difüzyon oranları zar proteinleri arasında proteinler ve hücre iskeletinin arasında hem kalabalık ve etkileşimleri nedeniyle düşüktür. Tarihsel, zarlarında FCS kullanımı dolayısıyla uyarma odak 14 boyunca uzatılmış geçiş zamanlarında ağartma önlemek için gerekli olan foto stabil fluorophores, eksikliği engel olmuştur. Ancak, bugün, uygun foto stabil boyalar için pek çok seçenek vardır. detektör ve diğer donanım önemli gelişmeler de floresan prote algılanmasına izinins ve alt parlaklık boyalar. Burada, antikor etiketli ilgili protein flüoresan ile etiketlenmiş olan fare primer lenfositleri kullanılarak FCS uygulama için temel protokol, tarif edilmektedir. difüzyon katsayısı ve moleküler yoğunluğu elde etmek için otokorelasyon eğrileri uygun bir yaklaşım da gösterilmiştir. protokol kolayca moleküllerin difüzyon çalışması için teknikler daha önce hiç deneyimi olan immünolojistler tarafından takip ediliyor amaçlamaktadır. Ancak, konfokal mikroskopi temel bir anlayış beklenmektedir (referans 15'e bakın, bu temel anlayış kazanmak için). Bu protokol, nispeten kolay bir şekilde, diğer süspansiyon hücreleri hücre hatları ve primer hücreler hem de adapte edilebilir. Daha tecrübeli FCS kullanıcılar için, daha rafine analiz yöntemleri olan bazı tartışmalar anlatılmıştır, mevcuttur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FCS 1. Boyama
- Üreticinin protokolü 16 uyarınca, manyetik boncuk etiketleme kullanarak dalak lenfositlerden fare NK hücreleri izole. Aşağıdaki adımları için numune başına 2-3 x 10 5 hücre kullanın.
NOT: Hücreler tek başına birincil antikorlar kullanılarak etiketli böylece, el değmemiş bırakarak, hedef hücre popülasyonunu zenginleştirmek için negatif seçim kullanın. Fareler 2 hücre izolasyonu hakkında daha ayrıntılı bilgi için referans 2'ye bakın. - Fc reseptörleri eksprese eden mürin hücreleri için, fosfat tamponlu salin (PBS) ve örnek başına% 1 fetal inek serumu (FBS) 25 ul 5 mg / ml antikor klonu 2.4G2 ile Fc reseptörleri bloke eder. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Antikor karışımı hazırlanması.
- Kullanım antikorlar doğrudan bir foto stabil fluorofora birleşmiş. Eğer iki farklı proteinlere karşı iki antikor(örneğin, 488 ve 633 lazerler 2 heyecan, daha sonra protokol sırasıyla, "yeşil" ve "kırmızı" lazerler ve fluorophores olarak adlandırılan çapraz konuşma minimize etmek iyi ayrılmış emisyon spektrumları sahip kullanılan, kullanım fluorophores vardır ).
NOT: foto stabil fluorophores etiketli ticari antikorlar seçilir biyomarkerların için mevcut değilse, fluorophores için eşlenik etiketsiz antikorlar üreticinin talimatlarına göre. Bu çalışmada kullanılan antikorlar için malzemeler tabloya bakınız. - protein ya da PBS +% 1 FBS içinde ilgi proteinlerine karşı flüoresan etiketli antikorlar seyreltilmesiyle bir antikor karışım hazırlayın. Örnek başına 50 ul son hacim olması için her bir örnek, antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
NOT: antikor, bir doyurucu bir konsantrasyonda kullanılır sağlamak için önceden antikor konsantrasyonunun optimize, tipik haliyle1-10 ug / ml olmuştur.
- Kullanım antikorlar doğrudan bir foto stabil fluorofora birleşmiş. Eğer iki farklı proteinlere karşı iki antikor(örneğin, 488 ve 633 lazerler 2 heyecan, daha sonra protokol sırasıyla, "yeşil" ve "kırmızı" lazerler ve fluorophores olarak adlandırılan çapraz konuşma minimize etmek iyi ayrılmış emisyon spektrumları sahip kullanılan, kullanım fluorophores vardır ).
- Kuluçkadan sonra, 250 ml PBS ilave edilerek hücrelerin yıkanması, 3 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj. süpernatant atın.
- Adımı tekrarlayın 1.4.
- PBS +% 1 FBS, 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. buz üzerinde ve edinimi kadar karanlıkta saklayın.
Not: Murin NK hücreleri kadar 10 saat boyunca buz üzerinde tutulmalıdır.
Mikroskop odacıklı coverglass Slaytlar 2. Hazırlık
NOT: mikroskop için optimize edildiğini kapak cam kalınlığı, # 1 veya # 1.5 ya Kullan odacıklı coverglass slaytlar veya yemekler. Mikroskop, belirli bir kalınlık için hizalanmış değilse bu bedel bilinmiyorsa, ya da, mikroskop yaka halka geçerli coverglass kalınlığı 17 için optimize edilmesi gerekmektedir.
- 1:10 oranında damıtılmış su ile poli-L-lisin ile seyreltilir. bölmelere seyreltildi poli-L-Lizin 200 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
- KaldırAspirasyon ile poli-lizin, L-ve en az 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında kapaksız bırakarak odası hava kurumaya bırakın.
3. FCS Sistemi Başlangıç
NOT: Diğer mikroskopi kurulumları ve yazılım paketleri de kullanılabilir, ancak bu protokol, (/ Reaktifler Tablo Malzemeler bakınız) Belirli bir mikroskop sistemi ve yazılım anlamına gelir.
- FCS korelatör ile konfokal lazer tarama mikroskobu açın. "Uzman" modunda yazılımı açın. 40X suya daldırma merceği seçin.
- "Acquire" sekmesi altında, basın "Yapılandırma" ve "Tarama" düğmeleri "Yapılandırma Kontrolü" ve "Tarama Kontrolü" pencere (Şekil 1 pencereler A ve B, sırasıyla) açın. "Confocor" sekmesi altında, basın "Tedbir" "Ölçme" penceresi (Şekil 1'de pencere C) açmak için.
- FCS kaydetmek için bir klasör oluşturunölçümleri. "Dosya" sekmesi altında "Yeni" tıklayarak yeni bir resim veritabanı başlatın.
- "Lazer" düğmesini kullanarak, halojen lamba ve heyecan verici fluorophores hakkında lazerler açmak (örneğin, "kırmızı" uyarma lazer için "yeşil" uyarma lazer ve 633 nm uyarma için 488 nm).
- Uygun uyarma ve emisyon filtreleri seçin ve ilgili dedektörleri etkinleştirin.
- "Yapılandırma Denetimi" penceresinde, kullanılacak uyarma lazer, uyarma ve emisyon filtreleri, ışık yolu ve dedektörler de dahil olmak üzere, görüntü yakalamak için ayarları belirtin.
- Benzer şekilde, "Sistem Yapılandırması" sekmesi altında, "Ölçme" penceresinde FCS ölçümleri için gelen ayarları belirtin. görüntüleme ve FCS için mümkün olduğunca benzer ayarları kullanın.
- Yeşil channe için "Ch1" kutusunu işaretleyerek FCS kayıtları için algılama kanalları etkinleştirmekl ve "Ölçme" penceresinde kırmızı kanal için "Kn2".
NOT: Ayarlar standart konfokal görüntüleme deneyde olduğu gibi, kullanılan fluorofor (ler) için optimize edilmelidir. sonraki deneylerde, aynı FCS ayarları, eski FCS dosyasını açarken kullanıcı arayüzü üstündeki "Confocor" açılır menüsünü kullanarak ve seçerek yeniden kullanılabilir "Açık dosya." Gelişmekte olan satın alma penceresinde Basın "Yeniden". Benzer şekilde, görüntü alma ayarları kaydedilmiş görüntü açarak basarak yüklenebilir "Yeniden kullanım."
- Lazer FCS ölçümleri yapmadan önce sabit olana kadar bekleyin. diyot lazerler daha hızlı stabilize iken bu gaz lazerler için 30 dakika kadar sürebilir. beklerken iğne deliği ayarlayın.
4. İğne Deliği Ayarı
- Antikorlar üzerindeki etiket eksitasyon ve emisyon spektrumlarına tekabül fluorophores veya floresan boyaların 0.2-0.5 uM çözelti hazırlayın.fluorophores, 19 difüzyon katsayıları 18 bilinen gerekir.
- Bir bölmeli coverglass slayt iyi olarak merkezinde yeşil lazeri tarafından uyarılır florofor ile bir çözelti 50 ul damla koyun. 40X su objektif distile su bir damla koyun ve slayt yerleştirin. görünür ışık başlatmak ve bulmak ve fluorofor damla odaklanmak için oküler kullanmak için "Vis" düğmesine basın.
NOT: slaytlar mikroskop hizalama etkileyebilir arasındaki cam kalınlığı varsayılan küçük farklılıklar beri, daha sonra hücre ölçümleri için aynı slayt kullanın. - odak içinde de sıvı damla (alttan 10-100 mikron) yerleştirin.
- "Ölçme" penceresinde, "Toplama" sekmesini seçin. Basın "Pozisyonlar" altında "Geçerli konum" (Şekil 1 pencere C).
- Aynı pencerede "Sistem Yapılandırma" sekmesine dönün. yüksek s ayarlayınYeşil lazer ower.
NOT: Bir yüksek lazer güç doygunluk gücü (lazer güç daha da arttırılırsa, yani floresan sinyal doğrusal artmaz) anlamına gelir. 1 mW sisteminin ayarları güç veya maksimum lazer gücünün% 5-10 civarında, genellikle yeterlidir. - tuşuna basarak sinyal kararlılığını test "Başlat". Bu akım ölçümü için zaman iz ve otokorelasyon eğrisi görüntüleyen ayrı bir pencere açılacaktır. floresan sinyal zamanla yüksek kararlı olup olmadığını kontrol edin ve kHz ziyade Hz aralığında gösteren dalgalanmalar.
- "Ölçme" penceresinde "Ey ayarlayın" düğmesini seçin. Doğru algılama kanalı (Ch1 veya Ch2) seçilebilir olup olmadığını kontrol edin. Basın "AutoAdjust X" Elde edilen eğri net bir maksimum görünmüyor, veya maksimum kenarında ise, yine "kaba" seçeneğini seçip "AutoAdjust X" işareti. x-yönünde sonuçlanan ekran bittiğinde, sa yapmak"AutoAdjust Y." tuşuna basarak Y me
- Her iki net maxima var ve değerler ölçümler arasında değişen değildir kadar "AutoAdjust" tuşuna basarak ayar X ve Y arasında "kaba" ve alternatif De-seçin.
- Hücreler, iki farklı flüorofor ile etiketlenir ise kırmızı flüorofor çözeltisi ilave edilmiş bir bölmeye hareket eder. kırmızı lazer için yüksek lazer gücü seçin ve tekrar kırmızı uyarma ve algılama kanalı için 4.6-4.8 adımları tekrarlayın.
NOT: X ve Y değerleri tek bir iğne deliği hem algılama kanalları için kullanılan sistemlerde kanallar arasında saparsanız, ara değerleri seçin ve değişiklikleri kabul etmek için OK tuşuna basın. Burada, X = 79 ve y = 189 de maksimumlar ile 488 nm lazer ve X = 80 ve y = 188, değerleri X = 80 ve y = 189 de maksimumlar ile 633-nm lazer için seçildi. 488 nm veya 633 nm heyecan fluorophores etiketli iki antikorun uyarılması için 488 nm ve 633 nm lazerler kombinasyonu beri, iyi bir seçimdiremisyon spektrumları 2 üst üste yoksa çapraz konuşmak için riski en aza indirilmiştir.
5. Ücretsiz fluorofor Transit Zaman ölçün
Not: Bilinen bir difüzyon katsayısı ile birlikte, bir fluorofor odaklama (TauD) içinden geçiş süresi; belirlenerek, algılama hacminin büyüklüğü ve odak içinde hücre zarının nedenle bölge, hesaplanabilir. TauD hesaplanması adımı 7,2 açıklanmaktadır.
- Iğne deliği ayarı için kullanılan aynı çözümlerini kullanarak, "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Toplama" sekmesi altında 30 sn x 2 tekrarlar için satın alma süresini ayarlayın.
- "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere B) "Başlat" tıklayarak bir ölçüm başlayın.
- ya da yakın başlayan her uyarma lazer ve çözüm karşılık gelen fluorofor, bir lazer güç dizi gerçekleştirmekgüç doyurarak ve her ölçüm için yarı yarıya azalır. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Sistem Yapılandırması" sekmesinde lazer gücünü değiştirin. Bir ölçüm başlatmak için "Başlat" düğmesine basın.
NOT: Alt aralığında yaklaşan hücre ölçümleri için lazer gücünü ekleyin 20 (örneğin, objektif önce, 16, 8, 4, ve 2 uW gücü ölçün). Sistem lazer ayarları çıktı uyarma daha genel yüksek ve mikroskop ve uyum kalitesine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Bu sistemde, yukarıdaki güç aralığı yaklaşık 60-500 uW sistem ayarları gücüne tekabül eder. Amaca önce yeni bir mikroskop kullanılır ilk kez güç çıkışını ölçmek için bir güç metre kullanılması tavsiye edilir. Lazerin mevcut maksimum güç "Ölçme" penceresinin "Bilgi" butonu altında bulunur. - mol başına sayıları bir yere yazınmajuscule: Her bir lazer güç ölçümü (CPM, birim kHZ).
- İki algılama kanalı kullanılıyorsa, çapraz konuşmak için otokorelasyon eğrisi görüntüleyen penceresini kontrol edin. tespit FCS kırmızı algılama kanalı olarak otokorelasyon ve yeşil algılama kanalı olarak algılama değerlendirmek için sadece kırmızı fluorophores bir çözüm ölçmek için sadece yeşil fluorophores içeren bir solüsyon kullanın. Genel bir kural olarak, uygun fluorofor belirli sinyalin% 5'in altında "yanlış" florofor algılanır CPM tutun.
- değerleri kullanılan lazer gücü ile doğrusal ölçek olmadığını kontrol edin. En yüksek lazer gücünde CPM Doygunluk (yani doğrusal bir ilişki beklenen biraz daha düşük değerler) kabul edilebilir.
NOT: CPM hemen hemen tüm mikroskop sistemleri ve ortak fluorophores için en yüksek lazer gücü için de 10'un üzerinde olmalı ve hassas sistemler için önemli ölçüde daha yüksek olabilir. Yeni konjuge floresan antikor kullanıldığı ilk kez bir performansantikor FCS ölçümü serbestçe beklenen CPM ölçmek için çözüm olarak difüzyon. Ölçümden önce, kaplama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca (0.5 mg / ml PBS içinde seyreltilmiş) polietilen glikol ile aşılanmış poli-L-lisin 200 ul ölçüm odası. bir pipet ile sıvı çıkarın ve havayla kurumaya odacığı sağlar. dondurucuda (en fazla 2 hafta) buzdolabında stok solüsyonu ve toz stok kaydedin. mikroskopta, PBS içinde 1-10 ug / ml antikor seyreltin. Takip 4,2-4,4 ve bu protokolde 6.7 adımları tekrarlayın. yüzey yapışkan olmayan çözelti ile kaplanmış ise, antikorlar, cam yüzeyi ile etkileşime ve süratli bir şekilde boşaltılabilir.
- ya da yakın başlayan her uyarma lazer ve çözüm karşılık gelen fluorofor, bir lazer güç dizi gerçekleştirmekgüç doyurarak ve her ölçüm için yarı yarıya azalır. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Sistem Yapılandırması" sekmesinde lazer gücünü değiştirin. Bir ölçüm başlatmak için "Başlat" düğmesine basın.
6. Hücre Ölçümleri
- Antikor-etiketlenmiş hücre süspansiyonu (adım 1.5) ve 8 oyuklu odacıklı coverglass sürgünün bir kuyuya saydam Roswell Park Memorial Institute ortamı 1640 (RPMI), 150 ul PBS +% 1 FCS hücre 125 ul ekle. LeFCS ölçümleri başlamadan önce en az 20 dakika süreyle ölçüm sıcaklığında karanlıkta hücreleri ave.
NOT: Bu yerleşmek ve kuyuların dibine takmak ve ölçüm sıcaklığına hücreleri ve çözüm dengelenmesi hücreleri sağlamaktır. - "Tarama Kontrol" penceresinden (Şekil 1, pencere B), zoom 1 set ve "Hızlı XY" düğmesine basarak hızlı bir XY tarama başlatın. hücreler hala açıkça görülebilir iken mümkün olduğunca düşük olması, böylece lazer gücünü değiştirin. membran açıkça tanımlanmış ve sitoplazmasında hiçbir floresan sinyali yoksa ortalama parlaklık, bir yuvarlak hücre görüntüsünü ortalamak. Hücre görüntünün en kapsar kadar yakınlaştırmak.
- Geçerli hücre, ekstrüzyon veya aşırı parlak noktalar hareketli veya görüntüler dalları ise yeni bir hücre seçin. Aynı deney sırasında çekilen tüm hücreler için aynı zoom ve lazer gücünü tutun.
NOT: Bir karıştırdı zar aynı zamanda gelecek apo belirtisi olabilirpitozis. - hücre zarının üzerine odaklanır. "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Toplama" sekmesinde, aktive ederek FCS ölçümü için bir konum seçmek "Crosshair." Alternatif olarak, "LSM Image" sekmesini seçin lsm görüntüde aranan ölçüm nokta işareti ve basın "konumunu ekleyin."
Not: Hücre membran üst spesifik olmayan poli-L-lisin bağlı flüoresan antikor ya da florofor etkisinde edilmez. Ancak, hücre (sonuçları görmek) Ölçüm sırasında hareket olmadığını tespit etmek önemlidir. - "Ölçme" penceresinden (Şekil 1, pencere C) "Toplama" sekmesinde, tekrar başına 10 sn olarak belirlenmiştir "Tedbir Time" ile, 6-10 kadar tekrar sayısını ayarlayın.
- "Ölçme" penceresinin "Sistem Yapılandırma" sekmesine dönün. "L altında FCS ölçümü için lazer gücünü ayarlamaaser "düğmesine basın. objektif önce, 1 ve 10 uW 20 aralığında, hücre ölçümleri için düşük güç kullanırlar.
NOT: Tavsiye edilen değerler hücrelere sinyal algılama ve fotohasar arasında bir trade-off vardır. adım 5.2.1 Not Ekle bu değerler karşılık gelen lazer gücünün yüzdesini görmek. - "Ölçüm" penceresi (pencere C) "Başlat" düğmesine basarak bir FCS ölçümü başlatın. (Örnek, Şekil 3A'da alt panel gösterilmiştir), ilk 10 saniye sırasında birden fazla% 30 oranında yoğunluğu iz bir düşüş ile tespit edildiği üzere önemli hücre ağartıcılar ölçüm başında, başka bir hücre ve daha düşük taşıma gelecekteki ölçümler için lazer güç.
- sinyalinin kaybolması durumunda, Z-yönünde odağı ayarlamak. Ölçüm tamamlandıktan sonra, hücre hala merkezli olduğunu ve hücre zarı ölçüldü olduğunu kontrol etmek için "Tarama Denetim" penceresi (Şekil 1, pencere B) kullanın. inci eğerE hücre ölçümü atmak, taşındı.
- Ölçüm görüntülenen otomatik korelasyon penceresinde, elle yakınlaştırma manevraları, ağartma, büyük kümeler veya diğer eserler (Şekil 3 örneklere bakınız) ihtiva bireysel tekrarlar silin. Onları işaretleme sağ tıklayarak ve seçerek bunu yapın "Sil." .fcs biçiminde son dosyayı kaydedin. Hücre başına en az dört tekrarlar kaydedin.
- İsteğe bağlı olarak, "Tarama Kontrol" penceresini kullanarak (görünen zarın tüm çevresi ile birlikte), orta bölümünde bir hücrenin bir görüntü elde. ağartma önlemek için FCS ölçümden sonra görüntüyü yakalamak. görüntü yakalama başlatmak için "Tek" düğmesine basın.
- FCS odak konumlandırma için "pozisyon ekle" kullanıyorsanız, tıklayın sonraki hücreye geçmeden önce "konumunu Kaldır".
- hücreler canlı throughou tutmak için ölçüm 2 saat, en fazla sonra hücre süspansiyonu yeni kana değiştirmeDenemeyi t.
7. FCS Analizi
- (Bu protokolde kullanılan yazılımlar için Malzemeler / Reaktifler Tablo bakınız) eğri uydurma yeteneğine sahip bir yazılımı .fcs dosyaları açmak.
NOT: mikroskop ile geliyor FCS yazılımı temel montaj aşina olmak için iyi bir yerdir, ancak ek yazılım, iki boyutlu membran difüzyon sığdırmak için gereklidir. - İlk olarak, ücretsiz fluorofor ölçümleri analiz ederek uyarma birimin boyutunu belirler. Otokorelasyon eğrileri 21 3 boyutlu serbest difüzyon eğriye uyacak.
(Denk. 1)
Not: parametrelerinin tanımlanması: N: korelasyon zaman, τ D (TauD): odak hacmi, τ (Tau) floresan birimlerinin ortalama sayısı odak hacmi ortalama kalış süresi, T 1: florofor olasılığı olmak üçlü devlet, τ <sub> T: tekli-üçlü devlet geçişler için gevşeme zamanı, S: yükseklik oranı odak hacmi çapı genişliği için.- TauD, moleküller odağı aktarmak için transit zamanı ayıklayın.
- Iğne deliği yarıçapı (ω) hesaplamak için kalibrasyon 18, 19 için kullanılan fluorophores TauD gözlenen ve yayınlanan difüzyon katsayıları (D) kullanın.
(Denk. 2)
- Hücre membranları üzerinde otomatik korelasyon eğrisi analizi.
- Moleküler difüzyon temsil eğrisinin bir kısmını görselleştirmek için bir zaman dilimi otokorelasyon eğrisinin dik yamaç önce başlayan ve 1 de eğri yakınlaşmaları sonra sona eren seçin (örneğin, 0.001 fare yüzey reseptörleri için 5 sn; Şekil 4).
- i kaydedildi bireysel tekrarlar ortalama otokorelasyon eğrisi oluşturmakn adımı 6.7.2.
- Her Denklem 3 3 kullanılarak otokorelasyon eğrisi ortalama bir 2-boyutlu membran difüzyon eğriye uyacak.
(Denk. 3)
NOT: N heyecanlı zar alanı içinde ikamet eden moleküllerin ortalama sayısı aşağıdaki gibidir: Önemli çıkış parametreleri. Yoğunluk (N / um 2) için Yeniden. τ D (TauD) fokal alanı ortalama kalış süresi, zar (lar) ın, iki boyutluluğu ile sınırlıdır. Belirlenen iğne deliği yarıçapı (ω) ve Denklem 2. T1 üzerinden difüzyon katsayısı (mikron 2 / sn) ortalama kalış süresini yeniden hesapla fluorophores üçüz durumda olması için olasılığıdır. parlaklık (CPM) N. tarafından ölçüm ortalama genel yoğunluğunu bölünmesiyle hesaplanır - iyi bir uyum ilk denemede elde değilse, thi kadar değişkenler için başlangıç değerleri ve / veya üst ve alt sınırları değiştirmeks elde edilir.
NOT: Birincil hücre zarlarında protein difüzyon oranları için tipik alt-üst sınırları TauD için 10-500 msn T1 için% 0-100 ve TauT1 için 0,1-5 msn bulunmaktadır. Bu aralıklarla ortasında montaj için başlangıç değerleri seçin. Tipik olarak 1 ms 1 saniye arasında bulunur difüzyon elde edilen flüoresan iniş-çıkışları temsil eden eğrinin parçası (bakınız Şekil 4). florofor bağlı olarak, bazen difüzyon parametresi daha kısa zaman ölçeklerinde otokorelasyon sebebiyet veren ikinci bir süreç mevcut olabilir. Bu (genellikle floresan proteinleri oluşabilir gibi) geçici karanlık devlet (üçlü) veya yanıp neden olur. Bir üçlü devlet Denklem 3'te muhasebeleştirilir ve sunulan model bu nedenle de bu gibi durumlarda iyi bir uyum sağlamalıdır.
(Denk. 1) 
(Denk. 2) 
(Denk. 3) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tipik bir sonuç membran proteinleri için 400 msn 10 milisaniye aralığındaki bir geçiş süresi olan bir otokorelasyon eğrisi oluşturur. Molekül sayısı, endojen olarak ifade edilen proteinleri yaklaşık 200 mikron 2 başına 0.5 arasında değişebilir. CPM beklenenden daha düşük değildir olduğunu dikkatlice kontrol ediniz. Bu arka plan sinyalinin bir etkisi olduğu anlamına gelebilir. Genel bir kural olarak, analiz için kabul edilir hücreler üzerinde CPM sinyali serbestçe aynı lazer güçte antikorlar difüzyon için CPM daha düşük% 33 olmamalı. CPM lazer gücü ile doğrusal ölçeklendirme gerekir. primer immün hücre yüzeyi reseptörleri için otokorelasyon eğrisi 0.001, 1 saniye arasında dik kısmı düzgün olması beklenmektedir. Temsili bir otokorelasyon eğrisi ve zaman iz için Şekil 2'ye bakınız.
Giriş bölümünde kısaca bahsedildiği gibi,Re FCS bağlı sinyal karıştırıcı katkı flüoresan iniş-çıkışları, diğer kaynaklardan, etkisi moleküler difüzyon ölçmek için uygun değildir birçok durumlardır. Şekil 3, özel bir hücre veya ölçüm tekrar atılmalıdır olduğu durumların örnekleri gösterilmektedir. Zaten son derece düşük sinyal (çok düşük CPM) hücre atılması için neden olduğu dile getirilmiştir. Tek bir hücre atılması için bir başka neden hücresi (Şekil 3A) hareket olmasıdır. Etkisinin tüm ölçüm boyunca kayda değer ya da mevcutsa ağartma durumunda (Şekil 3B) veya büyük kümeler varsa (Şekil 3C) ölçümler atılmalıdır. Bu özellik, bir ya da iki tekrarı sadece mevcut ise, bu tek tek tekrarlar atılabilir, ancak geri kalan tekrarlar de kullanılabilir.
her ikisi de doğru kullanımı önemlidirModel veri sığdırmak için ve ayrıca uygun yakından otokorelasyon eğrisi ile örtüşür dikkatlice kontrol edin. Şekil 4'te, iyi ve kötü eğri uyan örnekler gösterilmektedir. eğri temsil eden difüzyon (en dik eğimli kısım) bir parçası çok dikkat edin. Başlangıç ve eğrinin eğimli bölümünün son iki model tarafından iyi donatılmış olduğunu tespit etmek de önemlidir. uyum gibi hücre atmak için nihai bir karar vermeden önce başlangıç değerleri ve / veya (makul bir aralık içinde) üst ve alt sınırları değiştirmek, hareketli, ağartma, ya da kümeler olarak belirgin sorunsuz, kötü ise.
Şekil 1: FCS yazılım arayüzü. protokol açıklandığı gibi burada gösterilen FCS edinimi ve görüntüleme için yazılım aracı çalıştırmak için gerekli ana pencere vardır. Pencere A, "Yapılandırma Control "pencere görüntüleme için ışın yolu, lazer kanalları ve filtreler için kontrol penceredir. Pencere B" Tarama Kontrolü "Tarama ayarları görüntüleme için pencere ve gösterir. Pencere C" Ölçme "penceresi, pencere FCS ölçüm ayarlarının kurulum. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: H-2B d major histokompatibilite sınıf difüzyon Temsilcisi iz ve otokorelasyon eğrileri ben taze izole fare NK hücreleri moleküllerin yüzey. Şekilde üst panel 7x 10 sn ölçümlerinin bütün zaman izi boyunca zamanın bir fonksiyonu olarak flüoresan iniş-çıkışlarını gösterir. alt panel temsilBu yedi tekrarlar ortalama otokorelasyon eğrisi s. Otokorelasyon eğrisinin yüksekliği fokal hacmi içinde, H-2D D kişiler işaretlenmiş mobil floresan konsantrasyonu ile ters orantılıdır. Eğrinin eğimi dik kısmında X-ekseni değeri genlik yarısı, floresan fokal hacmi içinde, H-2d D molekülleri etiketli ortalama bekleme süresi gösterir. Sunulan ölçüm referans 2 olarak yayınlanan veri setinin bir parçasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: sorunlu hücre izleri örnekleri. (A) hareketli hücre, iz le bazal istikrarlı olmaması örneklediği gibivel. Üst panel, bu zaman noktasından sonra çok düşük bir sinyal ile temsil edilen tüm hücre, yaklaşık olarak 35 saniye sonra odak dışına olan bir örnek gösterilmektedir. Alt panelde, etki birkaç saniyelik bir aralıkta ortaya oluklar ile, daha ince olan. (B) Hücre beyazlatma, zamanla azalan iz yüksekliğini görüntüleniyor. ölçüm sonunda buna ölçüm başlangıcında izi yüksekliğini karşılaştırın. (C) izleme sivri tarafından temsil büyük kümeler, varlığı. Üst panelde, 20-25 sn bir büyük küme mevcuttur. alt panelde, çeşitli kümeler ölçüm boyunca mevcuttur. Sunulan ölçüm referans 2 olarak yayınlanan veri setinin bir parçasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: eğri-uydurma ve artıklar ile Temsilcisi otokorelasyon eğrileri. kırmızı ve mavi dikey çizgiler montaj için kullanılan zaman penceresinin sınırlarını temsil etmektedir. Örnek otokorelasyon eğrisine bir 2-boyutlu difüzyon modeli temsil eden bir uyum (A) Örnek. Üst panelde, yeşil eğri (model) iyi bir uyum gösteren, mavi eğri (kazanılmış otokorelasyon) bindirmeleri. Alt panel eğri bakiye gösterir. iyi donatılmış değil 1 sn civarında dalgalanmalar, hücre ölümleri için tipik olan ve tolere edilebilir. Aynı otokorelasyon eğrisine 2 boyutlu difüzyon kötü uyum (B) '. monte modeli otokorelasyon eğrisi paylaşımı yapmayan ve 1. alt paneller (A ve B) eğri uydurma kalıntı göstermek yakınsama etmez. artıklarÖzellikle eğrinin difüzyon bölümü için, kötü oturması için önemli ölçüde daha büyüktür. Sunulan ölçüm referans 2 olarak yayınlanan veri setinin bir parçasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FCS Bu protokol bağışıklık hücrelerinin (murin, insan ya da diğer türlerin) her türlü yüzey moleküllerinin moleküler dinamiklerini değerlendirilmesi için de kullanılabilir. aşağı canlı hücrelerde tek-molekül çözünürlüğü FCS önlemler uzay-zamansal moleküler dinamik. Moleküler yoğunluğu, hem de ilgi konusu olan proteinlerin difüzyon hızı ve kümelenme dinamiği, otomatik korelasyon eğrisi elde edilebilir.
floresan etiketleme başarılı FCS deneyler için önemli hususlardan biridir. Hücre zarı üzerinde ilgi konusu proteinleri geleneksel antikorlar kullanılarak etiketlendi ve antikorlar genellikle saf bağışıklık hücrelerinde yüzey proteinleri üzerinde kullanım için en uygun olan. İşaretlenmemiş antikorlar doğrudan yüksek molekül parlaklık ile foto stabil floresan boyalar konjuge edilebilir olmalıdır. Antikor bağlanması için florofor seçimi ölçümleri kalitesi için çok önemlidir. Akış sitometrisi için standart etiketler,Bu floresan ve fikoeritrin bazlı boyalar gibi, bağlı olarak hızlı bir ağartma tavsiye edilmez. antikorlar doğrudan konjugasyon için foto stabil boyalar şu anda birkaç firma tarafından sağlanmaktadır. üreticileri genellikle, konjugasyon ve elde edilen konjüge edilmiş antikor saflaştırılması için tatmin edici bir protokolleri sağlar ve bu bir kaç saat içinde yapılabilir. Floresan proteinleri kullanarak FCS gerçekleştirmek de mümkündür, ancak floresan proteinleri çoğu foto stabil kimyasal fluorophores daha beyazlatma genel daha eğilimli olan beri özel bakım, lazer gücü en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Önceki deneyimine göre, aşırı ifadesi proteinin genellikle floresan proteinleri kullanımı uygun hale bağlı sıkışıklığı difüzyon oranında önemli bir azalmaya yol açar.
ölçümlere önce iğne deliği kalibrasyon da kritik bir adımdır. fokal hacminin büyüklüğünü belirlemek için kullanılan fluorophores difüzyon katsayısı bilinen olmalıS (Denklem 2). odak hacmi boyutunu belirlemek için antikor etiket emisyon spektrumları yakından tekabül eden serbest fluorophores kullanın. Bu optimal sinyal verimliliği ve renk kanalları arasındaki potansiyel çapraz korelasyon doğru algılanmasını sağlamak için yapılmalıdır. Sistem güçlerin aralığında beklenen çıkış sinyali verir emin olmak için serbestçe difüzyon fluorophores bir FCS lazer güç dizi gerçekleştirmek. deneyler arasında tutarlılığı sağlamak için deneyler arasında aynı lazer gücünde CPM karşılaştırın.
Analiz aşamasında, modellerin montaj sırasında değişkenler için makul aralıkları ve başlangıç değerlerini koymak esastır. iyi bir başlangıç noktalarını bulmak için benzer hücre sistemlerinden daha önce yayınlanmış bilgiyi kullanın. Teorik olarak, FCS bir nicel tekniktir, ancak optimum koşullar nadiren meydana beri, dikkatli belirli bir ölçüde sonuçlarını yorumlarken alınmalıdır. dalgalanmalar her türlü kaydedilecektir,ne olursa olsun bu tür dalgalanmalar kökenli. Nedenle, olası hata kaynaklarını dışlamak amacıyla deneysel sistemi ile ilgili mümkün olduğunca çok bilgi sahibi olmak yararlıdır. Çözelti içinde serbest fluorophores olası kirletici en az on kat daha kısa TauD diffüz oysa Örneğin, tüm hücre zarı hareketi, artık TauD (Şekil 3A) dalgalanmalara sebep olur.
Bu basit protokol çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. iki protein farklı fluorophores etiketli ise, eş-difüzyon (etkileşim dolaylı bir ölçütüdür) çapraz korelasyon tespit metodoloji genişleterek değerlendirilebilir. Bu proteinler, hücre zarındaki birbirine bağlanan ne ölçüde tek tek renk kanallarının otomatik korelasyon eğrisi yüksekliğine çapraz-korelasyon eğrisi yüksekliğinden ile temsil edilmektedir. Çapraz korelasyon ölçüm yazılımı Ch1-Ch2 olarak gösterilir. öncedenÇapraz korelasyon verirlerse analizi çapraz konuşmak için kontroller gerektirir ve böylece biraz daha karmaşık Burada sunulan protokolü daha fazladır. Bu temel protokol bir uzantısı olarak, devam etmek için nasıl ayrıntılı bir tarifi, Strömqvist ve ark bulunabilir. 13. Z-yönünde konumlandırma optimize etmek için, Z-tarama FCS 22 kullanılabilir. Bir önceki deneyimlerine göre, elle bunu yapmak için yeterli olmuştur. Bir FCS otokorelasyon eğrisi 23 için birden fazla difüzyon katsayıları uygun şekilde de mümkündür. Bu, farklı difüzyon oranları ve alt popülasyonlarının en az birinin yaklaşık difüzyon oranlarının alt popülasyonlarının sayısının önceki bilgi gerektirmektedir. Aksi takdirde, uydurma güvenilmez hale getirecek pek çok serbest değişkenler olacaktır. Tipik bir örnek, difüzyon hızı, önemli ölçüde bir ligandın bağlanma yavaşlatılır bir yüzey proteini olacaktır. Son olarak, arıtma btamamen çıkarmadan tekrarlar olmadan aykırı izini ng 24 mümkündür.
Bir floresan sinyal eksikliği gidermek için ortak bir sorundur. serbestçe fluorophores difüzyon için açılan floresan olup olmadığını kontrol etmek için halojen lamba kullanın. damla floresan değilse, (nM aralığında) hafif bir artış konsantrasyon ile fluorophores yeni bir toplu karıştırmak ve yeniden deneyin. Odak floresan damla içinde, lazerler yazılımda açık olduğundan emin olunuz, lazer gücü yeterlidir, (adıma bakın, doğru emisyon filtreleri ve dedektörler seçilir ve "FCS Ölçme" penceresinde sağ kanallar aktive edilir 3.6). lazer başlatın ve görsel lazer ışık örneği ulaştığı teyit tarafa bakmak. düz lazer kaynağına bakarak kaçının. Seçilen emisyon filtresi lazer dalga boyu kapsar ise, deklanşör otomatik olarak dedektöre zarar vermemek için ışık yolunu bloke eder. benf tüm ayarlar gayet iyi ama hiçbir ışık, geldiğinde lazerler, FCS sistemi ve bilgisayarı yeniden başlatın. Bir floresan sinyal eksikliği devam ederse bir uzmana danışın. etiketli hücreleri floresan görüntüler yoksa basitleştirilmiş prosedür uygulanır. halojen lamba ile floresan varlığını doğrulamak; , Lazerler açmak lazer kanalları seçmek ve lazer gücünü ayarlamak. ya "Crosshair" ya da "pozisyonunu Ekle" seçeneği (adım 6.4) kullanılarak, hücre zarı üzerinde bir pozisyon seçin. Sinyal hala çok düşükse sonraki numune geçin.
tekniğin dalgalanma bazında önemli özelliklerinden biri molekülleri tespit edilmesi oldukça hareketli olmak zorunda olmasıdır. Çok yavaş moleküller veya tüm ölçüm süresi boyunca odak daha küçük alanlarda sıkışıp moleküllerin kesirler hareketli nedenle ölçülen olamaz. Bu yüzey yoğunlukları olası bir küçümsenmesi ve difüzyon oranının fazla tahmin edilmesine yol açar. ağartmamoleküller, lazer ışıklı odak hacmi harcama daha uzun ağartılan bir ihtimali daha yüksek olacağından, aynı zamanda, yoğunluk ve TauD her ikisinin bir varsayımsal düşük tahmin katkıda bulunabilir. arka plan (odak düzlemi dışında floresan gibi) etkisi, diğer taraftan, yapay tespit moleküllerinin sayısını artırmak ve ölçülen CPM azalacaktır. Daha önce, mutlak yoğunluk tayini toplam maksimum hata% 40 civarında 20 olarak tahmin edilmiştir. hata kaynakları, çoğu durumda, deneyler boyunca eşit Bununla birlikte, birbirine farklı biyolojik numune karşılaştırma genellikle mümkündür. Bir başka potansiyel hata kaynağı antikorları her bir antikorun potansiyel iki hedef moleküllere bağlanabilir, yani iki değerli olmasıdır. Yazarlar, bu olgu gözlenmemiştir, fakat bu, diğer antikorlar için genel bir özellik olduğunu garanti edilemez. iki değerlikli potansiyel etkisi gerekirBu nedenle, her bir antikor için tek tek test edilmesi. Belirli birincil ve ikincil etiketli antikorların kombinasyonu nedeniyle iki ardışık iki değerlikli etiketlerden yapay kümelerin uyaran riskinin yüksek kesinlikle kullanılmamalıdır. Hücreler bunun yerine ilgili proteinin floresan protein etiketli versiyonları ile transfekte edilmiş ise, her bir protein, sadece bir etiket olacaktır. Bununla birlikte, bu durum her zaman arzu edilmez ve hatta mümkün olmayabilecek, transfeksiyon gerektirir (ör doğrudan insan kanından izole immün hücreleri kullanılıyorsa). Son olarak, tek-nokta FCS görüntüleri yazmaz. görüntüleri yayın veya başka amaçlar için gerekli ise, bu yazılımın görüntüleme bölümünü kullanarak ayrı ayrı ele alınmalıdır. Her zaman hücre yüzeyinde gereksiz ağartma önlemek için FCS ölçümler sonrası görüntüleri yakalayabilir.
FCS, örneğin FRAP gibi geleneksel konfokal tabanlı mikroskopi, ve görüntü korelasyon metodolojileri aksine floresan dalgalanmaları ölçmek olamaztek-molekül düzeyinde 6'da. Görüntü korelasyon metodolojileri dolaylı ve daha düşük çözünürlüğe sahip moleküllerin sayısını ölçmek, ama onlar tüm görüntülenen alanda 25'in üzerinde moleküler difüzyon ve kümelenme değişkenliği değerlendirmek. Konfokal mikroskopi ile ölçülen standart SPT, FCS 7 daha düşük büyüklük sıralaması etiketleme ideal seviyesine sahiptir. Bu nedenle, etiketlenmiş protein yoğunluğu, standart SPE tarafından ölçülemez. Diğer mikroskopi teknikleri ile SPT kombinasyonu (örneğin, stokastik optik yeniden mikroskopi veya fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskopisi) yoğunluk ve hareket değerlendirilecektir sağlar, ancak çok özel boyalar veya proteinler 11 gerektirir. Böyle, aydınlatma mikroskopi yapılandırılmış ve emisyon mikroskobu tükenmiş uyarılmış sık sık gerektirir sabit örnekler ve birincil bir kombinasyonu ve labelin için ikincil antikorlar gibi süper çözünürlüklü teknikleri,g 26. Sistemin dinamikleri genellikle değerlendirilemez ise yerelleştirme, bu nedenle çok hassas. SPT ve süper çözünürlük teknikleri ile karşılaştırıldığında, FCS, aynı zamanda analiz ve sonuçlar çıkarılması için önemli ölçüde daha az bir bilgisayar gücü ve zaman gerektirir. Flow sitometri immünoloji beygir ve olumlu FCS ile kombine edilebilir. verilmedi-kararlı boyalar sıralama önce kullanılmış olsaydı hücre sıralama, örneğin, seçilen hücre popülasyonları üzerinde müteakip bir ölçüm ile takip edilebilir. FCS ve böylece diğer yerleşik yöntemler tek başına ya da kombinasyon halinde kullanılabilecek bir yöntemdir.
Bu protokol tek-molekül düzeyinde hücre zarı içinde bağışıklık hücre dinamikleri ve etkileşimleri halen bilinmeyen özelliklerini tanımlamak için kullanılabilir. Ayrıca, seçilen alt kümeleri karşı bütün nüfus özellikleri mukayese edilebilir. Aynı zamanda, bağışıklık hücresi terapisi için bir seçme adımı olarak potansiyel bir role sahiptir. Ölçümler yapmak beriİmmün hücrelerin özelliğe araştırmak için çoğu diğer yöntemlerin aksine, tek tek hücreler, potansiyel olarak geri kazanılır ve kültüre edilebilir hücre tüketir. Böylece, FCS eğrilerinin analizinden sonra, gelecek vaat eden hücreler elde edilebilir ve varsayılan klinik uygulamalar da dahil olmak üzere ek uygulamalar için genişletilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Zeiss Confocor 3 aracın bakımı için ve hücre ölçümleri konusunda yararlı ipuçları Dr. Vladana Vukojeviç, Moleküler Tıp Merkezi, Karolinska Enstitüsünde teşekkür ederim. Bu çalışmada, Magnus Bergvalls Stiftelse ve Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond gelen Vetenskapsrådet hibe (1629 hibe sayısı 2012-) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | - | - | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
