Molekylær diffusjon i plasmamembraner Primære lymfocytter målt ved fluorescens korrelasjon spektroskopi

Abstract

Fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS) er en kraftfull teknikk for å studere diffusjonen av molekyler i biologiske membraner med høy romlig og tidsmessig oppløsning. FCS kan kvantifisere den molekylære konsentrasjon og diffusjonskoeffisienten av fluorescensmerkede molekyler i cellemembranen. Denne teknikken har evnen til å utforske de molekylære diffusjon egenskapene til molekylene i plasmamembranen av immunceller i stabil tilstand (dvs. uten prosesser som påvirker resultatet under den egentlige måletiden). FCS er egnet for å studere diffusjon av proteiner som er uttrykt på nivåer som er typisk for de fleste endogene proteiner. Her blir en enkel og robust metode for å fastslå diffusjonshastigheten av cellemembranproteiner på primære lymfocytter demonstrert. En effektiv måte å utføre målinger på antistoff-farget levende celler og vanlig forekommende observasjoner etter kjøpet er beskrevet. De siste fremskritti utviklingen av fotostabile fluorescerende fargestoffer kan benyttes ved å konjugere antistoffene av interesse til passende fargestoffer som ikke blekemiddel i stor utstrekning under målingene. I tillegg gir dette for påvisning av langsomt diffundere enheter, noe som er et vanlig trekk av proteiner uttrykt i cellemembraner. Analysen prosedyre for å trekke molekylære konsentrasjon og diffusjon parametere fra de genererte autokorrelasjonskurver er uthevet. Oppsummert er en grunnleggende protokollen for FCS målinger gitt; det kan etterfølges av immunologer med en forståelse av konfokal mikroskopi, men uten annen tidligere erfaring med teknikker for måling av dynamiske parametre, så som molekylære diffusjon priser.

Introduction

Mange immunceller funksjoner er avhengige av molekylær diffusjon og samhandling innenfor membraner. Biologiske membraner er komplekse, og mange faktorer som kan være viktige for funksjonen av immunceller kan påvirke hastigheten på translasjonsforskning diffusjon av proteiner i cellemembraner ^1. Vi har nylig vist at natural killer (NK) celler, lymfocytter som tilhører den medfødte immunsystemet, oppviser differensial diffusjon av to undersøkte proteiner i cellemembranen, avhengig av tilstanden til NK-celleaktivering ^2.

Fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS) er en teknikk som er i stand til å kvantifisere molekylære diffusjon priser innenfor biologiske membraner. Det melder den gjennomsnittlige diffusjon av fluorescensmerkede molekyler i en fast volum, typisk i fokus i en konfokal mikroskop. Den er basert på måling av svingningene i fluorescens som oppstår ved molekylær bevegelse iet system i stabil tilstand. FCS har blitt mye brukt for å studere diffusjon av fluorescerende fargestoffer og proteiner, både i løsning og i lipidmembraner. Andre utgang parametere som påvirker spredningen Frekvensen kan også indirekte studert på denne måten (f.eks konformasjonsendringer av proteiner eller interaksjoner av molekyler på cellemembraner) ^{3, 4.} FCS skiller seg ut i forhold til andre teknikker på grunn av sin høye følsomhet og gi mulighet for enkelt-molekyl deteksjon. Det fungerer godt for molekylære konsentrasjoner i nanomolar til millimolar rekkevidde, noe som er typisk for endogene ekspresjonsnivåer av de fleste proteiner ^5. Videre kan FCS gi en tilnærming av det absolutte antall proteiner i den undersøkte volum, mens de fleste andre teknikker bare gi relativ informasjon om protein ekspresjonsnivåer. Andre metoder for å måle molekylære diffusjon priser innen membraner inkluderer fluorescence utvinning etter fotobleking (FRAP), enkelt partikkel sporing (SPT), multippel pinhole FCS, og bildekorrelasjonsmetoder. FRAP og bilde korrelasjonsmetoder ensemble teknikker, som vanligvis ikke gir informasjon om det absolutte antallet molekyler ^10. Sammenlignet med SPT, gjennomstrømningen av FCS er høyere når det gjelder å karakterisere populasjonen gjennomsnittet. Analysen er også mindre krevende ettersom den gjennomsnittlige diffusjonshastigheten av molekylene som er tilstede i laserfokus er målt, snarere enn frekvensen av enkle molekyler. Også, med mindre spesialiserte mikroskoper er tilgjengelige ^11, SPT kan ikke gi noen informasjon om konsentrasjoner, ettersom standard SPT merking må være meget lav for å tillate identifisering av enkle molekyler. På den annen side krever FCS molekylene som studeres for å være mobil. Det vil rett og slett ikke merker noen antatte immobile fraksjoner eller molekyler beveger seg svært sakte. Diffusjonshastigheten av molekyler somligge innenfor fokus lenger enn omtrent en tiendedel av oppkjøpet tid vil ikke være riktig representert i FCS målinger ^{3, 12.} Derfor Diffusjonskoeffisientene registrert av FCS pleier å være raskere enn diffusjon priser rapportert fra teknikker som FRAP og SPT, hvor nær-til-immobile og svært langsomme fraksjoner blir tatt hensyn til også. SPT vil også gi en mer detaljert beskrivelse av variasjonen av diffusjon priser innen molekylær befolkningen enn FCS vil.

FCS kvantifiserer svingning av fluorescens intensitet over tid innenfor spent volum. I tilfelle av membran målinger, oversetter dette til det belyste området av membranen. I denne artikkelen, benytter vi det faktum at slike svingninger blir indusert av molekyler som utviser Brownsk diffusjon og således beveger seg inn og ut av eksitasjon volum. Det finnes også flere andre mulige kilder for fluctuasjoner i fluorescens-signalet, slik som blinker eller nærvær av en triplett tilstand i fluoroforer, miljøskadelige virkninger, binding-uforpliktende av liganden, eller bevegelse av hele cellemembran. Disse antatte feilkilder som må tas i betraktning ved utformingen av en FCS eksperiment for å nøyaktig tolke resultatene ^{12, 13.} Vanligvis lateral diffusjon priser i biologiske membraner er lav på grunn av trengsel og samhandling, både mellom membran proteiner og mellom proteiner og cytoskjelettet. Historisk sett har bruken av FCS i membraner således vært hemmet av mangel på fotostabile fluoroforer, som er nødvendig for å unngå bleking i løpet av den utvidede transittider gjennom fokus eksitasjon ^14. Men i dag, er det nok av muligheter for egnede foto stabil fargestoffer. Betydelige forbedringer i detektorer og annen maskinvare også tillate påvisning av fluorescerende beskyttins og fargestoffer av lavere lysstyrke. Her, et grunnleggende protokollen for anvendelse av FCS ved hjelp av murine primære lymfocytter, hvor proteinet av interesse er merket med et fluorescent merket antistoff, er beskrevet. En tilnærming for å passe til autokorrelasjonskurver for å ekstrahere diffusjonskoeffisienten og molekyltettheten er også vist. Protokollen tar sikte på å være lett fulgt av immunologer med ingen tidligere erfaring med teknikker for å studere diffusjon av molekyler. Det er imidlertid en grunnleggende forståelse av konfokalmikroskopi forventet (for å få denne grunnleggende forståelse, se referanse ^15). Denne protokollen kan forholdsvis lett tilpasses andre suspensjonsceller, begge cellelinjer og primære celler. For mer erfarne FCS brukere, finnes mer raffinerte analysemetoder, hvorav noen er beskrevet i diskusjonen.

Protocol

1. Farging for FCS

1. Isoler murine NK-celler fra milt lymfocytter ved hjelp av magnetiske kuler merking, som per produsentens protokoll ^16. Bruk 2-3 x 10 ⁵ celler per prøve for de neste trinnene.
   MERK: Bruk negativ seleksjon for å berike målcellen befolkningen, slik det urørt, slik at cellene kan merkes ved hjelp av primære antistoffer alene. Se referanse ² for mer detaljert informasjon om celle isolert fra mus ^2.
2. For murine celler som uttrykker Fc-reseptorer, blokkere Fc-reseptorer med antistoffet klon 2.4G2 ved 5 ug / ul i 25 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) og 1% føtalt bovint serum (FBS) per prøve. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
3. Utarbeidelse av antistoff blanding.
   1. Bruk antistoffer direkte konjugert til en foto-stabil fluorophore. Hvis to antistoffer mot to forskjellige proteinerer brukt, bruker fluoroforer som har godt atskilt emisjonsspekter for å redusere krysstale (f.eks opphisset av 488 og 633 lasere ^2, senere i protokollen referert til som "grønne" og "røde" lasere og fluorophores, henholdsvis ).
      MERK: Hvis kommersielle antistoffer merket med fotostabile fluorophores er ikke tilgjengelig for de valgte biomarkører, konjugerte umerkede antistoffer mot fluorophores henhold til produsentens instruksjoner. Se Materialer Tabell for antistoffene som anvendes i denne studien.
   2. Fremstille en antistoff-blanding ved fortynning av fluorescensmerkede antistoffer mot proteinet eller proteiner av interesse i PBS + 1% FBS. Legg antistoffet blandingen til hver prøve til et sluttvolum på 50 ul per prøve. Inkuber på is i 45 min i mørket.
      MERK: Optimaliser konsentrasjonen av antistoffene på forhånd for å sikre at antistoffet blir anvendt i en mettende konsentrasjon, typisk1-10 ug / ml.
4. Etter inkubering vaskes cellene ved tilsetning av 250 ul av PBS og sentrifuge dem ved 150 x g i 3 min. Kast supernatanten.
5. Gjenta trinn 1.4.
6. Resuspender cellene i 200 pl av PBS + 1% FBS. Hold på is og i mørke før oppkjøpet.
   MERK: Murine NK-celler kan holdes på is i opptil 10 timer.

2. Utarbeidelse av Mikroskop kamret dekkglass Slides

MERK: Bruk kamret dekkglass lysbilder eller retter med dekselet glasstykkelse som mikroskop er optimalisert for, enten # 1 og # 1.5. Dersom mikroskop ikke er innrettet for en viss tykkelse, eller hvis det er ukjent, må mikroskop kragen ring til å være optimalisert for den aktuelle dekkglass tykkelse ^17.

1. Fortynn poly-L-lysin med destillert vann i et 01:10 forhold. Tilsett 200 ul fortynnet poly-L-lysin til kamrene og inkuberes i 20 min.
2. Fjernpoly-L-lysin ved aspirasjon og la kammeret lufttørke ved å forlate det uten lokk ved romtemperatur i minst 20-30 min.

3. Starte FCS System

NB: Denne protokollen refererer til et bestemt mikroskop system og programvare (se Materialer / Reagenser tabell), selv om andre mikroskopi oppsett og programvarepakker kan også brukes.

1. Slå på konfokal laser scanning mikroskop med FCS correlator. Åpne programvaren i "Expert mode". Velg 40X nedsenking i vann linse.
2. Under fanen "Hent", trykk på "Config" og "Scan" for å åpne "Configuration Control" og "Scan kontroll" windows (windows A og B i figur 1, henholdsvis). Under "Confocor" fanen, trykk "Mål" åpne "Measurement" vindu (vinduet C i figur 1).
3. Lag en mappe for å lagre FCSmålinger. Start en ny bildedatabase ved å klikke på "Ny" under fanen "File".
4. Bruke "Laser" -knappen, slå på halogenlampen og de relevante lasere for spennende de fluorophores (for eksempel 488 nm for den "grønne" eksitasjon laser og 633 nm eksitasjon for "rød" eksitasjon laser).
5. Velg passende eksitasjon og emisjonsfiltre og aktivere de tilhørende detektorer.
   1. Angi innstillinger for bildeopptak, herunder eksitasjon laser, eksitasjon og emisjonsfiltre, lysbanen, og detektorer som skal brukes, i "Configuration Control" vinduet.
   2. Tilsvarende angir de tilsvarende innstillingene for FCS målinger i "Measurement" -vinduet, under "System Configuration" -kategorien. Bruk som lignende innstillinger som mulig for bildebehandling og FCS.
   3. Aktiver gjenkjenning kanaler for FCS opptak ved å sjekke "CH1" boksen for den grønne channel og "CH2" for den røde kanalen i "Measurement" vinduet.
      MERK: Innstillingene skal være optimalisert for fluoroforen (e) som brukes, som i en standard confocal bildebehandling eksperiment. I etterfølgende eksperimenter, kan de samme FCS innstillinger brukes på nytt ved å åpne en gammel FCS fil, ved hjelp av "Confocor" rullegardinmenyen øverst i brukergrensesnittet, og velge "Åpne fil". Trykk "Gjenbruk" i den nye oppkjøpet vinduet. På samme måte kan bildetakingsinnstillinger lastes ved å åpne et lagret bilde og trykke "Gjenbruk".
6. Vent til laseren er stabil før du utfører FCS målinger. Dette kan ta opp til 30 min for gass lasere, mens diode lasere stabilisere raskere. Juster pinhole mens du venter.

4. Pinhole Justering

1. Fremstille 0,2-0,5 uM oppløsninger av fluoroforer eller fluorescerende fargestoffer som svarer til eksitasjon og emisjonsspektra av etikettene på antistoffene. Defluorophores må ha visst Diffusjonskoeffisientene ^{18 19.}
2. Sette en 50 ul dråpe av oppløsningen med fluoroforen eksiteres av den grønn laser i sentrum av en brønn i et kammer, dekkglass lysbilde. Sett en dråpe destillert vann på 40X vann objektiv og posisjonere lysbildet. Trykk på "Vis" -knappen for å starte synlig lys og bruke okulær å finne og fokusere på fluorophore slipp.
   MERK: Bruk samme lysbilde som for senere cellemålinger, ettersom mulige små variasjoner i glasstykkelse mellom lysbildene kan påvirke mikroskop justering.
3. Plasserer fokus vel inne i flytende dråpen (10-100 um fra bunnen).
4. I "Measurement" vinduet, velg "Kjøp" -kategorien. Trykk "Nåværende posisjon" under "stillinger" (vindu C i figur 1).
5. Gå tilbake til "System Configuration" -kategorien i samme vindu. Sett en høy power for grønn laser.
   MERK: En høy lasereffekt refererer til metningsstrøm (dvs. gjør det fluorescente signalet ikke øker lineært dersom lasereffekten økes ytterligere). Rundt 1 mW av systeminnstillinger makt, eller 5-10% av maks laser makt, er vanligvis nok.
6. Test stabiliteten av signalet ved å trykke på "Start". Dette vil åpne et eget vindu som viser tid spor og autokorrelasjon kurve for strømmåling. Kontroller at det fluorescente signalet er høyt, stabilt over tid, og som viser variasjoner i den kHz snarere enn den Hz rekkevidde.
7. Velg "O Juster" -knappen i "Measurement" -vinduet. Sjekk om riktig deteksjon kanal (Ch1 eller CH2) er valgt. Trykk "AutoAdjust X." Hvis den resulterende kurven ikke viser en klar maksimum, eller maksimum er på kanten, markere "grov" og trykk "AutoAdjust X" igjen. Når den dannede skjerm i x-retningen er avsluttet, gjør det sameg for Y ved å trykke "AutoAdjust Y."
8. De-velg "grov", og veksler mellom å justere X og Y ved å trykke "AutoAdjust" inntil begge har klart maxima og verdiene ikke endrer mellom målingene.
9. Hvis cellene er merket med to forskjellige fluorophores, flytte til et kammer der er lagt rød fluorophore løsning. Velg en høy laser effekt for den røde laseren og gjenta trinn 4,6-4,8 for den røde eksitasjon og deteksjon kanal.
   MERK: Hvis X og Y-verdiene avvike mellom kanalene i systemer hvor bare en pinhole brukes til både deteksjon kanaler, velger mellomliggende verdier, og trykk OK for å godta endringene. Her, for 488 nm laser med maxima på X = 79 og Y = 189 og 633 nm laser med maxima på X = 80 og Y = 188, verdier X = 80 og Y = 189 ble valgt. Kombinasjonen av 488 nm og 633 nm lasere for eksitering av de to antistoffer merket med fluoroforer eksitert ved 488 nm eller 633 nm er et godt valg, ettersomrisiko for krysstale minimeres hvis emisjonsspekter ikke overlapper ^to.

5. Mål Transit Time of Free fluorophore

MERK: Ved å bestemme transittiden gjennom fokus (TauD) av en fluorofor med en kjent diffusjonskoeffisient, størrelsen av deteksjonsvolum, og dermed arealet av cellemembranen som er i fokus, kan beregnes. Beregningen av TauD er beskrevet i trinn 7,2.

1. Ved hjelp av de samme løsningene som brukes til pinhole justering, sette innsamlingstiden til 30 sek x 2 rapporter under "Kjøp" kategorien i "Measurement" vinduet (Figur 1, vindu C).
2. Start en måling ved å klikke på "Start" i "Measurement" vinduet (Figur 1, vindu B).
   1. Utføre en lasereffekten serie for hver eksitering laser og den tilsvarende fluoroforen i oppløsning, og starter ved eller nærmetting av kraft og redusert med halvparten for hver måling. Endre laser makt i "System Configuration" fanen i "Measurement" vinduet (Figur 1, vindu C). Trykk på "Start" -knappen for å starte en måling.
      MERK: Ta med laser makt for kommende cellemålinger i det nedre området (for eksempel måle på 16, 8, 4 og 2 μW makt, før målet) ^20. Systemet laser innstillinger er generelt høyere enn utgangs eksitasjon og kan variere i stor grad avhengig av mikroskop og kvaliteten av justering. I dette systemet tilsvarer den ovenfor angitte effektområdet til ca 60-500 μW av systeminnstillinger kraft. Det anbefales å bruke en kraftmåler for å måle effekt før målet første gang en ny mikroskop brukes. Den nåværende maksimal effekt av laser finnes under "Info" -knappen i "Measurement" -vinduet.
   2. Skriv ned antall pr molCule (CPM, Enhet: kHz) fra hver lasereffektmåling.
   3. Hvis to deteksjons kanaler brukes, sjekk vindu som viser autokorrelasjon kurve for cross-talk. Bruke en oppløsning inneholdende bare grønne fluoroforer for å måle detektert FCS autokorrelasjon i rødt deteksjonskanal og en løsning med bare røde fluoroforer å vurdere deteksjon i den grønne deteksjon kanalen. Som en tommelfingerregel, holde CPM oppdaget fra "feil" fluorophore under 5% av den spesifikke signalet fra riktig fluorophore.
   4. Sjekk at verdiene skalere lineært med laser makt brukes. Metning av CPM på høyeste laser makt (dvs. noe lavere verdier enn forventet fra en lineær sammenheng) er akseptabelt.
      MERK: CPM bør være godt over 10 for den høyeste laser makt for nesten alle mikroskopsystemer og vanlige fluorophores og kan være betydelig høyere for sensitive systemer. Den første gang en nylig konjugerte fluorescerende antistoff benyttes, utfører enFCS måling av antistoffet fritt diffunderer i oppløsning for å kvantifisere den forventede CPM. Før måling, belegge målekammeret med 200 ul av poly-L-lysin podet med polyetylenglykol (fortynnet til 0,5 mg / ml i PBS) i 1 time ved romtemperatur. Fjern væsken med en pipette og tillater kammeret å lufttørke. Lagre stamløsning i kjøleskapet (opptil 2 uker) og pulveret lager i fryseren. Ved mikroskop, fortynne antistoffet til 1-10 ug / ml i PBS. Følg trinn 4,2-4,4 og 6,7 i denne protokollen. Hvis overflaten ikke er belagt med et slipp løsning, vil antistoffer som interagere med glassoverflaten og hurtig bli tømt fra oppløsningen.

6. Cell Målinger

1. Legg 125 ul celler i PBS + 1% FCS fra det antistoff-merkede cellesuspensjonen (trinn 1,5) og 150 pl av gjennomsiktig Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI) inn i en brønn av en 8-brønns kammer dekkglass lysbilde. Leave cellene i mørke ved måling av temperatur i minst 20 minutter før oppstart FCS målinger.
   MERK: Dette er for å tillate cellene å slå seg ned og festes til bunnen av brønnene og for å stabilisere cellene og løsning til måletemperaturen.
2. I "Scan Control" vinduet (Figur 1, vindu B), sett zoom en og starte en rask XY skanning ved å trykke på "Fast XY" -knappen. Modifisere lasereffekten, slik at den er så lav som mulig mens cellene fremdeles er godt synlig. Sentrere bildet på en rund celle av gjennomsnittlig lysstyrke, hvor membranen er klart definert, og det er ingen fluorescerende signal i cytoplasma. Zoom inn til cellen dekker det meste av bildet.
3. Velg en ny celle hvis den aktive cellen er i bevegelse eller viser tentakler, profiler, eller ekstremt lyspunkter. Hold samme zoom og laser makt for alle celler fanget i samme eksperiment.
   MERK: En rusket membran kan også være et tegn på kommende apoptose.
4. Fokus på toppen av cellemembranen. I "Erverv" kategorien i "Measurement" vinduet (Figur 1, vindu C), velg en posisjon for FCS måling ved å aktivere "Crosshair." Alternativt kan du velge "LSM Bilde" fanen, marker ønsket måling sted i LSM bilde, og trykk på "Legg posisjon."
   MERK: Den øverste av cellemembranen vil ikke bli påvirket av fluorescerende antistoffer eller fluoroforer uspesifikt bundet til poly-L-lysin. Imidlertid er det viktig å forsikre seg om at cellen ikke beveger seg under målingen (se resultater).
5. I "Erverv" kategorien i "Measurement" vinduet (Figur 1, vindu C), angi antall repetisjoner til 6-10, med "Mål Time" satt til 10 sek per gjenta.
6. Gå tilbake til "System Configuration" fanen i "Measurement" -vinduet. Juster laser makt for FCS måling under "LAser "-knappen. Før målet, bruker lite strøm til cellemålinger i området mellom 1 og 10 μW ^20.
   MERK: De anbefalte verdiene er en avveining mellom signal deteksjon og photodamage til cellene. Se trinn 5.2.1 Note andelen av laser makt disse verdiene tilsvarer.
7. Starte en FCS målingen ved å trykke på "Start" i "Måling" -vinduet (vinduet C). Hvis celle blekemidler betydelig i begynnelsen av målingen, som detektert av et fall i intensiteten trase med mer enn 30% i løpet av de første 10 sek (et eksempel er vist i figur 3A, nedre panel), flytte til en annen celle og nedre lasereffekten for fremtidige målinger.
   1. Hvis signalet er tapt, justere fokus i Z-retningen. Etter målingen er fullført, bruker du "Scan Control" vinduet (Figur 1, vindu B) for å sjekke at cellen er fortsatt sentrert og at cellemembranen ble målt. Hvis the celle har flyttet, forkaste målingen.
   2. I autokorrelasjons vindu der målingen vises, manuelt slette enkelt repetisjoner som inneholder zooming manøvrer, bleking, store klynger eller andre gjenstander (se eksempler i figur 3). Gjør dette ved å merke dem, høyreklikke og velge "Slett". Lagre den endelige filen i .fcs format. Spare minst fire repetisjoner per celle.
8. Eventuelt kan erverve et bilde av cellen ved den midtre delen (med hele omkretsen av membranen synlig) ved hjelp av "Scan Control" vindu. Ta bildet etter FCS måling for å unngå bleking. Trykk på "Single" knappen for å starte bildeopptak.
9. Hvis du bruker "Legg til posisjon" for FCS fokus posisjonering, klikk på "Fjern posisjon" før du går videre til den neste cellen.
10. Endres til en ny porsjon av cellesuspensjonen etter et maksimum på 2 timer måle for å holde cellene levedyktige throughout forsøket.

7. FCS analyse

1. Åpne .fcs filene i en programvare med kurvetilpasningsevne (se Materialer / Reagenser tabell for programvaren som brukes i denne protokollen).
   MERK: FCS programvaren som følger med mikroskopet er et bra sted å bli kjent med grunnleggende montering, men ekstra programvare er nødvendig å montere to-dimensjonale membran diffusjon.
2. Først bestemmer størrelsen på eksitasjon volum ved å analysere de frie fluoroforen målingene. Monter en tre-dimensjonal fri diffusjon kurve til autokorrelasjonskurver ^21.
   (Eq. 1)
   MERK: Definisjon av parametere: N: betyr antallet fluorescerende enheter i det fokale volum, τ (Tau): korrelasjonstiden, τ _D (TauD): gjennomsnittlig oppholdstid i det fokale volum, T 1: sannsynlighet for fluoroforene å være i triplet staten, τ <sub> T: avslapping tid for singlet-triplet tilstandsoverganger, S: Forholdet mellom høyde og bredde diameter for fokus volum.
   1. Pakk TauD, transittiden for molekyler å overføre fokus.
   2. Bruk observerte TauD og publiserte diffusjonskoeffisienter (D) fluoroforer som brukes for kalibrering ^{18, 19} for å beregne pinhole radius (ω).
      (Eq. 2)
3. Analyse av autokorrelasjons kurver på cellemembraner.
   1. For å visualisere den del av kurven som representerer molekylær diffusjon, velger den tidsperioden som starter før den bratteste helning av autokorrelasjons kurve og slutter etter kurvesammenfallende ved en (for eksempel 0,001 til 5 sekunder for murine overflatereseptorer, se figur 4).
   2. Generere en gjennomsnittlig autokorrelasjon kurve av de enkelte gjentar lagret in trinn 6.7.2.
   3. Monter en to-dimensjonal membran diffusjon kurve til hver i gjennomsnitt autokorrelasjon kurve ved hjelp av ligning 3 ^3.
      (Eq. 3)
      MERK: Viktige output parametre er som følger: N er det gjennomsnittlige antall molekyler som er bosatt innenfor spent membranareal. Omberegne til tetthet (N / mikrometer ^2). τ _D (TauD): gjennomsnittlig oppholdstid i det sentrale område, begrenset av to-dimensjonalitet av membranen (e). Beregne gjennomsnittlige oppholdstiden til en diffusjonskoeffisient (mikrometer ² / sek) med en bestemt radius hullet (ω) og Ligning 2. T1 er sannsynligheten for fluoroforer til å være i triplet tilstand. Lysstyrken (CPM) blir beregnet ved å dividere den gjennomsnittlige intensiteten av målingen av N.
   4. Hvis en god passform ikke er oppnådd på første forsøk, endre startverdier og / eller de øvre og nedre grense for variablene inntil this er oppnådd.
      MERK: Typiske øvre nedre grense for protein diffusjon priser i primære cellemembraner er 10-500 msek for TauD, 0-100% for T1, og 0,1-5 millisekunder for TauT1. Velge startverdier for montering i midten av disse intervaller. Den del av kurven som representerer fluorescens svingninger som stammer fra diffusjonen er vanligvis plassert mellom 1 msek og en sek (se figur 4). Avhengig av fluorofor, kan det noen ganger være en annen prosess til stede, noe som gir opphav til autokorrelasjon med kortere tidsskala enn diffusjonen parameter. Dette er forårsaket av en forbigående mørk tilstand (triplet) eller blinker (som ofte oppstår for fluorescerende proteiner). En lett tilstand er regnskapsført i ligning 3, og presenterte modellen bør derfor også gi en god passform i disse situasjonene.

Representative Results

Et typisk resultat vil generere en autokorrelasjonskurve med en transittiden i området fra 10 ms til 400 ms for membranproteiner. Antallet molekyler som kan variere mellom 0,5 til omkring 200 mikrometer pr ² for endogent uttrykte proteiner. Sjekk nøye at CPM ikke er lavere enn forventet. Dette kan bety at det er en påvirkning av bakgrunnssignalet. Som en tommelfingerregel bør CPM signal på celler som er akseptert for analyse ikke være lavere enn 33% av CPM for fritt spre antistoffer på samme laser makt. CPM bør skalere lineært med laser makt. Autokorrelasjonskurve for primære immuncelleoverflatereseptorer er forventet å være glatt, med den bratteste delen mellom 0,001 og 1 sek. Se figur 2 for en representant autokorrelasjon kurve og det tid for spor.

Som nevnt kort i innledningen, denre finnes flere tilfeller der FCS er ikke egnet for måling av molekylær diffusjon på grunn av påvirkning fra andre kilder til fluorescens svingninger, noe som bidrar til forvirrer signalet. Figur 3 viser eksempler på tilfeller der en bestemt celle eller måling gjentar skal kastes. Det har allerede vært nevnt at en ekstremt lav signal (meget lav CPM) er grunn til å forkaste cellen. En annen grunn for å forkaste den enkelte celle, er at cellen er i bevegelse (figur 3A). Når det gjelder bleking (figur 3B), eller hvis store klynger er tilstede (figur 3C), bør målingene kastes dersom effekten er betydelig eller til stede gjennom hele målingen. Hvis denne egenskap er bare til stede i en eller to gjentagelser, kan disse enkelt gjentar kastes, men de gjenværende gjentakelser kan fortsatt benyttes.

Det er viktig at både bruke riktigmodell for å passe dataene og også å sjekke nøye at det passer tett overlapper med autokorrelasjon kurve. I figur 4, er eksempler på gode og dårlige kurve passer vist. Følg nøye med på den delen av kurven som representerer diffusjon (den mest bratt hellende del). Det er også viktig å forsikre seg om at både begynnelsen og enden av den hellende del av kurven er godt tilpasset av modellen. Hvis passformen er dårlig, uten tilsynelatende problemer som flytting, bleking, eller klynger, endre startverdier og / eller de øvre og nedre grense (innenfor en rimelig rekkevidde) før du tar en endelig beslutning om å forkaste cellen.

Figur 1: FCS programvaregrensesnitt. Vist her er de viktigste vinduene er nødvendige for å drive programvaren verktøy for FCS oppkjøp og bildebehandling, som beskrevet i protokollen. Vindu A, "Konfigurasjon Control "vinduet er kontrollvinduet for strålebanen, laser-kanaler, og filtre for bildebehandling. Window B er" Scan Control "vinduet for bildebehandling og viser skanneinnstillingene. Vindu C er" Measurement "vindu, vinduet for oppsett av måleinnstillinger FCS. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Representant spor og autokorrelasjonskurver for å spre H-2D ^d store histocompatibility klasse I overflatemolekyler i ferske isolert murine NK-celler. Det øvre panel i figuren viser det fluorescensmønster svingning som en funksjon av tid i løpet av hele tiden spor av 7 x 10 sek målinger. Den nedre panel representererer det i gjennomsnitt autocorrelation kurve fra disse sju repetisjoner. Høyden på autokorrelasjonskurve er omvendt proporsjonal med konsentrasjonen av mobil fluorescensmerkede H-2D ^d enheter innenfor fokal volum. X-aksen verdi ved den bratteste del av skråningen av kurven, halvparten av amplituden, representerer den gjennomsnittlige oppholdstiden for fluorescensmerkede H-2D ^d molekyler innenfor det sentrale volum. Målingen som presenteres er en del av datasettet er publisert i referanse ^2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Eksempel på problematiske celle traser. (A) Et glidende celle, som eksemplifisert ved sporet ikke å ha en stabil basal leVEL. Toppfeltet viser et eksempel hvor hele cellen har beveget seg ut av fokus etter omkring 35 sekunder, som representert ved meget lave signal etter dette tidspunkt. I det nedre panel, er effekten mer subtil, med ujevnheter synlig ved et intervall på flere sekunder. (B) Celle visning blekingen, høyden av sporet avtar med tiden. Sammenligne høyden av sporet ved starten av målingen til at ved slutten av målingen. (C) Tilstedeværelse av store klaser, representert ved toppene i sporet. I den øvre panel, en stor klynge på 20-25 sekunder er til stede. I det nedre panel, flere klynger er til stede gjennom hele målingen. Målingene som presenteres er en del av datasettet er publisert i referanse ^2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Representative autokorrelasjonskurver med kurvetilpasning og restprodukter. De røde og blå vertikale linjer representerer grensene av tidsvinduet brukt for montering. (A) Eksempel på en representativ form av en to-dimensjonal modell diffusjon til et prøveautokorrelasjon kurve. I den øvre panel, den grønne kurven (modell) overlegg den blå kurven (den oppkjøpte autocorrelation), noe som indikerer en god passform. Det nedre panel viser den gjenværende fra den kurvetilpasning. De svingninger rundt en sek, som ikke er montert riktig, er typisk for cellemålinger og er tålelig. (B) Eksempel på en dårlig tilpasning av 2-dimensjonale diffusjon til det samme autokorrelasjon kurve. Den tilpassede modellen ikke overlappe autokorrelasjon kurve, og det ikke samles i 1. nedre paneler i (A og B) viser rest fra kurvetilpasning. residualeneer betydelig større for dårlig passform, spesielt for diffusjonen del av kurven. Målingen som presenteres er en del av datasettet er publisert i referanse ^2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen for FCS kan anvendes for vurdering av de molekylære dynamikk overflatemolekyler på alle typer av immunceller (murin, human, eller andre arter). FCS tiltak rom-tid-molekyldynamikk ned til single-molekyl oppløsning i levende celler. Molekyl tetthet, så vel som diffusjonshastigheten og clustering dynamikken i proteiner av interesse, kan utvinnes fra autokorrelasjonskurver.

Den fluorescerende merking er av sentral betydning for vellykkede FCS eksperimenter. Proteiner av interesse på cellemembranen har tradisjonelt blitt merket ved anvendelse av antistoffer, og antistoffer er ofte mest passende for bruk i overflateproteiner i naive immunceller. -Merkede antistoffer skal bli direkte konjugert til fotostabile fluorescerende fargestoffer med en høy molekyl lysstyrke. Utvelgelsen av fluoroforen for antistoffet konjugering er viktig for kvaliteten av målingene. Standard etiketter for flowcytometri,slik som fluorescein og fykoerytrin-basert fargestoffer, er ikke anbefalt på grunn av rask bleking. Foto stabil fargestoffer for direkte konjugering til antistoffer deg for tiden flere selskaper. Produsentene vanligvis gir tilfredsstillende protokoller for konjugering og rensing av det resulterende konjugert antistoff, og dette kan gjøres i et par timer. Det er også mulig å utføre FCS ved hjelp av fluorescerende proteiner, men forsiktighet bør utvises for å minimalisere lasereffekt, ettersom fluorescerende proteiner er generelt mer tilbøyelige til bleking enn de fleste fotostabile kjemiske fluoroforer. I henhold til tidligere erfaring, over-ekspresjon av proteiner ofte fører til en betydelig reduksjon i diffusjonshastigheten på grunn samles, noe som gjør bruken av fluorescerende proteiner uegnet.

Pinhole kalibrering før målingene er også et kritisk trinn. Fluoroforene som benyttes for å bestemme størrelsen av det fokale volum må ha kjent diffusjonskoeffisients (se ligning 2). Bruk frie fluoroforer som svarer nøye til den emisjonsspektra av antistoff etikettene for å bestemme størrelsen av det fokale volum. Dette må gjøres for å sikre optimal signal effektivitet og riktig påvisning av mulige kryss korrelasjoner mellom fargekanalene. Utfør en FCS laser makt serie av fritt diffuseranordningen fluorophores for å sikre at systemet gir den forventede utgangssignalet over et spekter av krefter. Sammenlign CPM på samme laser makt mellom eksperimenter for å sikre konsistens mellom eksperimenter.

I analysetrinnet, er det viktig å sette rimelige områder og startverdier for de variable ved montering modellene. Bruk tidligere utgitt kunnskap fra lignende cellesystemer for å finne gode utgangspunkt. Teoretisk sett er FCS en kvantitativ teknikk, men siden optimale forhold sjelden oppstår, har en viss grad av forsiktighet må tas ved tolkning av resultatene. Alle typer svingninger vil bli registrert,uavhengig av opprinnelsen til slike svingninger. Derfor er det nyttig å ha så mye informasjon som mulig om den eksperimentelt system for å utelukke mulige feilkilder. For eksempel vil bevegelse av hele cellemembran gi opphav til svingninger med lengre TauD (figur 3A), mens antatte forurensninger fra de frie fluoroforer i oppløsningen vil diffundere med minst ti ganger kortere TauD.

Denne grunnleggende protokollen kan modifiseres på flere måter. Hvis to proteiner som er merket med forskjellige fluoroforer, kan ko-diffusjon (et indirekte mål på interaksjon) vurderes ved å utvide metode for å påvise krysskorrelasjonen. Den grad i hvilken disse proteiner binder seg til hverandre i cellemembranen er representert ved høyden av krysskorrelasjonskurve i forhold til høyden av autokorrelasjonskurver for de individuelle fargekanalene. Krysskorrelasjonen blir betegnet som Ch1-CH2-i måle programvare. den precise analyse av krysskorrelasjon krever kontroller for cross-talk og er dermed noe mer komplisert enn protokollen presenteres her. En detaljert beskrivelse av hvordan du går frem, som en forlengelse av denne grunnleggende protokollen, kan finnes i Strömqvist et al. ^13. For å optimalisere posisjoneringen i z-retningen, kan z-skanning FCS brukes ^22. Ifølge tidligere erfaring, det har vært tilfredsstillende å gjøre dette manuelt. Det er også mulig å få plass til flere diffusjonskoeffisientene til en FCS autokorrelasjon kurve ^23. Dette krever kjennskap til hvor mange subpopulasjoner med forskjellige diffusjonshastigheter og i de omtrentlige diffusjonshastigheter for minst ett av de subpopulasjoner. Ellers vil det være for mange frie variabler, som vil gjengi den passende upålitelig. Et typisk eksempel vil være en overflateprotein som har en diffusjonshastighet er betydelig bremset ned av binding av en ligand. Til slutt, cleaning spor av uteliggere uten helt å fjerne gjentakelser er mulig ^24.

Mangelen på en fluorescerende signal er et vanlig problem å feilsøke. For fritt spre fluoroforer, bruker halogenlampe for å sjekke om fallet er fluorescerende. Hvis fallet er ikke selvlysende, bland en ny gruppe med fluorophores med en litt økt konsentrasjon (innenfor nM område) og prøv igjen. Sjekk at fokuset er i fluoriserende drop, lasere er slått på i programvaren, er tilstrekkelig laser makt, er de riktige emisjonsfiltre og detektorer valgt, og de rette kanalene i "FCS Measurement" vinduet er aktivert (se trinn 3.6). Start laser og ser fra siden for å visuelt bekrefte at laserlyset når prøven. Unngå å se rett inn i laserkilden. Hvis den valgte utslipp filter omfatter laserbølgelengden, vil en lukker automatisk blokkerer lysbanen for å unngå skade på detektoren. Jegf alle innstillingene er fine, men ikke noe lys kommer, re-starte lasere, FCS system, og datamaskinen. Spør en ekspert om mangelen på et fluorescerende signal vedvarer. En forenklet prosedyre gjelder hvis de merkede cellene ikke viser fluorescens. Bekrefte tilstedeværelse av fluorescens med halogenlampe; slå på lasere, velger laser-kanaler og justere laser makt. Velg en posisjon på cellemembranen, enten ved hjelp av "Crosshair" eller "Legg til posisjon" alternativet (se trinn 6.4). Bytt til neste prøve hvis signalet er fortsatt for lavt.

Et viktig aspekt ved svingning basis av teknikken er at molekylene må være rimelig mobil som skal påvises. Meget langsomt bevegelige fraksjoner av molekyler eller molekyler som er fanget innenfor områder som er mindre enn den fokus under hele måletiden kan derfor ikke måles. Dette fører til en mulig undervurdering av overflatetettheter og en overestimering av diffusjonshastigheten. blekingkan også bidra til en antatt undervurdering av både tetthet og TauD, siden molekyler vil ha en høyere sannsynlighet for å bli bleket jo lengre tid de tilbringer i laser-belyste samlings volum. Påvirkning fra bakgrunnen (fluorescens fra utsiden av brennplanet) vil, på den annen side, kunstig øke antallet detekterte molekyler og redusere den målte CPM. Tidligere ble den samlede maksimale feil i den absolutte tetthet bestemmelse beregnet til å være rundt 40% ^20. Imidlertid er det vanligvis mulig å sammenligne forskjellige biologiske prøver til hverandre, ettersom de feilkilder er, i de fleste tilfeller lik i hele forsøkene. En annen potensiell feilkilde er at antistoffer er bivalent, noe som betyr at hvert antistoff potensielt kan binde seg til to målmolekyler. Forfatterne observerte ikke dette fenomenet, men det kan ikke garanteres at dette er en global funksjon for andre antistoffer. En mulig påvirkning av bivalenspunkt måderfor testes individuelt for hvert antistoff. Kombinasjonen av spesifikke primære og sekundære antistoffer merket må ikke brukes på grunn av den høye risiko for å indusere kunstig klynger fra to på hverandre følgende toverdige etiketter. Hvis celler har i stedet blitt transfektert med fluorescerende protein-merkede versjoner av proteinet av interesse, vil hvert protein ha bare en etikett. Dette krever imidlertid transfeksjon, som ikke alltid er ønskelig og kan ikke engang være mulig (for eksempel hvis du bruker immunceller direkte isolert fra menneskeblod). Til slutt, ikke enkeltpunkt FCS ikke ta bilder. Hvis bildene er nødvendig for publisering eller andre formål, må disse fanges separat med bilde del av programvaren. ta alltid bilder etter FCS målinger for å unngå unødvendig bleking av celleoverflaten.

I motsetning FCS, tradisjonelle konfokal mikroskopi-baserte, slik som FRAP, og bilde korrelasjonsmetoder kan ikke kvantifisere fluorescensen svingningerved enkelt-molekyl nivå ^6. Bildekorrelasjonsmetoder måle antallet molekyler indirekte og med lavere oppløsning, men de kan vurdere variasjonen av molekylær diffusjon og gruppering over hele avbildede området ^25. Standard SPT målt ved konfokalmikroskopi har en ideell grad av merking, størrelsesordener lavere enn FCS ^7. Derfor kan tettheten av merkede proteiner ikke måles ved hjelp av standard SPT. Kombinasjonen av SPT med andre mikroskopiteknikker (f.eks stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi eller fotoaktivering lokalisering mikroskopi) kan tettheten og bevegelse som skal vurderes, men det krever meget spesielle fargestoffer eller proteiner ^11. Super-oppløsning teknikker, for eksempel strukturerte belysning mikroskopi og stimulert emisjon utarmet mikroskopi, krever ofte faste prøver og en kombinasjon av primære og sekundære antistoffer for labeling ^26. Lokalisering er derfor meget presis, mens dynamikken i systemet ikke kan ofte bli vurdert. I forhold til SPT og super-oppløsningsteknikker, FCS krever også betydelig mindre datakraft og tid for analyse og utvinning av resultater. Flowcytometri er arbeidshesten i immunologi og kan fordelaktig kombineres med FCS. Cellesortering kan, for eksempel, bli etterfulgt av etterfølgende målinger på utvalgte cellepopulasjoner hvis fotostabile fargestoffer hadde blitt brukt før sorteringen. FCS er således en metode som kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre etablerte metoder.

Denne protokollen kan brukes for å identifisere for tiden ukjente trekk ved immuncelle dynamikk og interaksjoner i cellemembranen på enkelt-molekyl nivå. Videre kan funksjoner i hele befolkninger versus utvalgte undergrupper sammenlignes. Det har også en potensiell rolle som et utvalg skritt for immuncelleterapi. Siden målingene gjørikke forbruke cellen, i motsetning til de fleste andre metoder for å undersøke funksjonaliteten av immunceller, kan individuelle celler potensielt utvinnes og dyrkes. Dermed, etter analyse av kurvene FCS, lovende celler kan trekkes ut og ekspandert for ytterligere anvendelser, inkludert mulige kliniske anvendelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	-	-	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom