Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der Diffusion von Molekülen in biologischen Membranen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. FCS kann die molekulare Konzentration und Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in der Zellmembran zu quantifizieren. Diese Technik hat die Fähigkeit , die molekularen Diffusionseigenschaften von Molekülen in der Plasmamembran von Immunzellen im eingeschwungenen Zustand (dh ohne Prozesse beeinflussen das Ergebnis bei der tatsächlichen Messzeit) zu erforschen. FCS ist für die Diffusion von Proteinen zu studieren, die typisch für die meisten endogenen Proteinen in Konzentrationen exprimiert werden. Hier wird eine einfache und robuste Methode, um die Diffusionsgeschwindigkeit von Zellmembranproteinen auf primären Lymphozyten zu bestimmen, wird demonstriert. Ein effektiver Weg, Messungen an Antikörper gefärbten lebenden Zellen durchzuführen und häufig auftretende Beobachtungen nach dem Erwerb werden beschrieben. Die jüngsten Fortschrittebei der Entwicklung von photostabile Fluoreszenzfarbstoffe können durch Konjugieren der Antikörper von Interesse verwendet werden Farbstoffe geeignet, dass während der Messungen nicht extensiv bleichen. Zusätzlich erlaubt dies für die Detektion von langsam diffundierenden Einheiten, die ein gemeinsames Merkmal der Proteine in Zellmembranen exprimiert wird. Das Analyseverfahren Molekülkonzentration und Diffusionsparameter aus den erzeugten Autokorrelationskurven zu extrahieren, wird markiert. Zusammenfassend ist ein Basisprotokoll für die FCS-Messungen vorgesehen sind; sie kann durch Immunologen mit einem Verständnis für die konfokale Mikroskopie, aber mit keiner anderen bisherigen Erfahrungen von Techniken zur Messung von dynamischen Parametern, wie Molekulardiffusionsraten folgen.
Introduction
Viele Immunzellen Funktionen basieren auf der molekularen Diffusion und Wechselwirkungen innerhalb Membranen. Biologische Membranen sind komplex und viele Faktoren, die für die Funktion von Immunzellen wichtig sein kann , um die Geschwindigkeit der Translationsdiffusion von Proteinen in Zellmembranen 1 beeinflussen kann. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die natürliche Killer (NK) Zellen, gehören , Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, weisen differentielle Diffusion von beiden untersuchten Proteine an der Zellmembran in Abhängigkeit von dem Zustand der NK – Zell – Aktivierung 2.
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine Technik, die zur Quantifizierung molekularen Diffusionsraten innerhalb biologischer Membranen fähig ist. Es zeigt die durchschnittliche Diffusionsrate von fluoreszenz Moleküle in einem festen Volumen markiert, üblicherweise im Mittelpunkt eines konfokalen Mikroskops. Es basiert auf der Messung der Schwankungen in der Fluoreszenz, die auf Molekularbewegung auftreten inein System im stationären Zustand. FCS wurde zur Untersuchung der Diffusion von fluoreszierenden Farbstoffen und Proteinen sowohl in Lösung als auch in Lipidmembranen verwendet. Andere Ausgabeparameter die Diffusionsgeschwindigkeit zu beeinflussen auch indirekt werden kann auf diese Weise (zB Konformationsänderungen von Proteinen oder Wechselwirkungen von Molekülen auf Zellmembranen) untersuchten 3, 4. FCS zeichnet sich im Vergleich zu anderen Verfahren aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, so dass die Möglichkeit zur Einzelmolekül-Detektion. Es funktioniert gut für die molekulare Konzentrationen im nanomolaren bis millimolaren Bereich, der für die endogene Expressionsniveaus der meisten Proteine 5 typisch ist. Weiterhin FCS kann eine Approximation der absolute Anzahl von Proteinen innerhalb des untersuchten Volumen geben, während die meisten anderen Techniken nur relative Informationen über die Proteinexpressionsniveaus ergeben. Andere Methoden molekularen Diffusionsraten zu messen, in Membranen Fluo umfassenzenz Erholung nach dem (FRAP), Einzelpartikelverfolgung (SPT), mehrere Pinhole FCS und Bildkorrelationsphotobleaching Methoden. FRAP und Bildkorrelationsverfahren sind ensemble Techniken, die im allgemeinen keine Informationen über die absolute Anzahl der Moleküle 10 geben. Im Vergleich zu SPT ist der Durchsatz von FCS höher in Bezug auf die Bevölkerungsdurchschnitt zu charakterisieren. Die Analyse ist auch weniger anspruchsvoll, da die durchschnittliche Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle innerhalb des Laserfokus wird gemessen, eher als die Geschwindigkeit der einzelnen Moleküle. Auch, es sei denn spezielle Mikroskope sind 11 verfügbar, SPT können keine Informationen über Konzentrationen geben, da Standard – SPT Kennzeichnung sehr gering sein muss für die Identifizierung von einzelnen Molekülen zu ermöglichen. Auf der anderen Seite erfordert FCS die Moleküle untersucht, mobil zu sein. Es wird einfach keine vermeintlichen immobile Fraktionen oder Moleküle sehr langsam bewegen erkennen. Die Diffusionsgeschwindigkeit von Molekülen, diebefinden sich innerhalb der Fokus mehr als etwa ein Zehntel der Akquisitionszeit 3, in FCS – Messungen werden 12 nicht korrekt dargestellt. Daher ist es durch FCS aufgezeichnet Diffusionskoeffizienten sind in der Regel schneller als die Diffusionsraten von Techniken wie FRAP und SPT berichtet werden, wo die Nähe zu unbeweglich und sehr langsam Fraktionen als auch berücksichtigt werden. SPT wird auch eine detailliertere Beschreibung der Variabilität von Diffusionsraten innerhalb der molekularen Population als FCS geben.
FCS quantifiziert die Schwankung der Fluoreszenzintensität über die Zeit innerhalb des angeregten Volumens. Im Falle von Membran Messungen bedeutet dies zu der beleuchteten Fläche der Membran. In diesem Papier nutzen wir die Tatsache, dass solche Schwankungen durch Moleküle aufweisen Brownsche Diffusion induziert werden und somit in und aus dem Anregungsvolumen bewegt. Es gibt auch mehrere andere mögliche Quellen für die schwankungentionen im Fluoreszenzsignal, wie Blinken oder Gegenwart eines Triplett-Zustand in der Fluorophore, Umweltauswirkungen, bindungs unbinding des Liganden, oder die Bewegung der gesamten Zellmembran. Diese vermeintliche Fehlerquellen müssen in Betracht gezogen werden , wenn ein FCS – Experiment , um die Gestaltung , um genau die Ergebnisse 12, 13 zu interpretieren. Typischerweise seitliche Diffusionsraten in biologischen Membranen sind gering durch Crowding und Interaktionen, sowohl zwischen den Membranproteinen und zwischen Proteinen und dem Zytoskelett. Historisch gesehen , wurde die Verwendung von FCS in Membranen somit durch das Fehlen von photostabilen Fluorophore behindert, die erforderlich sind , während der verlängerten Laufzeiten durch die Anregungsfokus 14 Bleichen zu vermeiden. Doch heute gibt es viele Möglichkeiten für geeignete photostabile Farbstoffe. Signifikante Verbesserungen in Detektoren und anderer Hardware ermöglicht auch die Detektion von fluoreszierenden ProteIns und Farbstoffe von geringer Helligkeit. Hierbei wird ein Basisprotokoll für die Anwendung von FCS murine primären Lymphozyten verwendet, wobei das Protein von Interesse mit einem fluoreszierend markierten Antikörper markiert ist, wird beschrieben. Ein Ansatz, um die Autokorrelationskurven, um zu passen den Diffusionskoeffizienten und die molekulare Dichte wird auch gezeigt, zu extrahieren. Das Protokoll zielt darauf ab, wird leicht gefolgt von Immunologen ohne vorherige Erfahrung von Techniken, um die Diffusion von Molekülen zu untersuchen. Es ist jedoch ein grundlegendes Verständnis für die konfokale Mikroskopie erwartet (um diese grundlegende Verständnis gewinnen, siehe Referenz 15). Dieses Protokoll kann relativ leicht auf andere Suspensionszellen adaptiert werden, die beide Zelllinien und Primärzellen. Für erfahrene Anwender FCS, verfeinerte Analysemethoden existieren, von denen einige in der Diskussion beschrieben werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll für FCS kann für die Bewertung der molekularen Dynamik von Oberflächenmolekülen auf allen Arten von Immunzellen (murine, menschliche oder andere Arten) verwendet werden. FCS Maßnahmen räumlich-zeitliche Molekulardynamik bis auf Einzelmolekülauflösung in lebenden Zellen. Die molekulare Dichte sowie die Diffusionsgeschwindigkeit und clustering Dynamik der Proteine von Interesse, aus den Autokorrelationskurven extrahiert werden.
Die Fluoreszenzmarkierung ist von z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Vladana Vukojević, Zentrum für Molekulare Medizin, Karolinska Institutet für die Aufrechterhaltung des Zeiss Confocor 3 Instrument und hilfreiche Tipps in Bezug auf Zellmessungen. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Vetenskapsrådet (Grant-Nummer 2012- 1629) finanziert werden, Magnus Bergvalls Stiftelse und von Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
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