Molekylær diffusion i plasma Membraner af primær lymfocytter målt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi

Abstract

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en kraftfuld teknik til undersøgelse af diffusion af molekyler i biologiske membraner med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. FCS kan kvantificere den molekylære koncentration og diffusionskoefficient fluorescensmærkede molekyler i cellemembranen. Denne teknik har evnen til at udforske de molekylære diffusion karakteristika molekyler i plasmamembranen af immunceller i stationær tilstand (dvs. uden processer, som påvirker resultatet under selve måletid). FCS er god til at undersøge udbredelsen af ​​proteiner, som udtrykkes ved niveauer typiske for de fleste endogene proteiner. Her er en enkel og robust metode til at bestemme diffusionshastigheden af ​​cellemembran proteiner på primære lymfocytter demonstreret. En effektiv måde at udføre målinger på antistof-farvede levende celler og almindeligt forekommende observationer efter erhvervelsen beskrevet. De seneste fremskridti udviklingen af ​​foto-stabilt fluorescerende farvestoffer kan anvendes ved at konjugere antistofferne af interesse til passende farvestoffer, der ikke blege udførligt under målingerne. Desuden tillader dette til påvisning af langsomt spredende enheder, som er et fælles træk ved proteiner udtrykt i cellemembraner. Analysen procedure at udtrække molekylære koncentration og diffusion parametre fra de genererede autokorrelationsfunktioner kurverne fremhæves. Sammenfattende er en grundlæggende protokol for FCS målinger leveres; det kan efterfølges af immunologer med en forståelse af konfokal mikroskopi, men med nogen anden tidligere erfaring med teknikker til måling af dynamiske parametre, såsom molekylær diffusion satser.

Introduction

Mange immunceller funktioner er afhængige af molekylær diffusion og interaktioner inden membraner. Biologiske membraner er komplekse, og mange faktorer, der kan være vigtige for funktionen af immunceller kan påvirke hastigheden af translationelle diffusion af proteiner i cellemembraner ^1. Vi har for nylig vist, at naturlige dræberceller (NK-celler), lymfocytter, der tilhører det medfødte immunsystem, udviser differentieret diffusion af to undersøgte proteiner på cellemembranen afhængigt af tilstanden af NK-celle-aktivering ^2.

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en teknik, der er i stand til at kvantificere molekylære diffusionshastigheder inden biologiske membraner. Det rapporterer den gennemsnitlige diffusionshastighed af fluorescensmærkede molekyler i et bestemt volumen, typisk i fokus i et konfokalt mikroskop. Den er baseret på måling af udsvingene i fluorescens, der forekomme ved molekylær bevægelse iet system i steady state. FCS har været meget anvendt til undersøgelse af diffusion af fluorescerende farvestoffer og proteiner, både i opløsning og i lipidmembraner. Andre output parametre, der påvirker diffusionshastigheden kan også indirekte undersøgt på denne måde (fx konformationelle ændringer af proteiner eller interaktioner af molekyler på cellemembraner) ^{3, 4.} FCS står i forhold til andre teknikker på grund af dens høje følsomhed, hvilket vil give mulighed for enkelt-molekyle detektion. Det fungerer godt for molekylære koncentrationer i det nanomolære til millimolære område, hvilket er typisk for endogene ekspressionsniveauer af de fleste proteiner ^5. Endvidere kan FCS giver en tilnærmelse af det absolutte antal proteiner i den undersøgte volumen, mens de fleste andre teknikker kun give relativ oplysninger om protein ekspressionsniveauerne. Andre fremgangsmåder til måling af molekylære diffusionshastigheder inden membraner indbefatter fluorescence inddrivelse efter fotoblegning (FRAP), enkelt partikel sporing (SPT), flere pinhole FCS, og image korrelation metoder. FRAP og image korrelation metoder er ensemble teknikker, som generelt ikke giver oplysninger om det absolutte antal af molekyler ^10. Sammenlignet med SPT, gennemløb af FCS er højere i forhold til at karakterisere gennemsnit befolkningen. Analysen er også mindre krævende, da den gennemsnitlige diffusionshastighed af molekylerne til stede i laserfokus måles, snarere end hastigheden af ​​enkelte molekyler. Også, medmindre specialiserede mikroskoper er tilgængelige ^11, SPT kan ikke give nogen oplysninger om koncentrationer, da standard SPT mærkning skal være meget lav til at gøre det muligt at identificere enkelte molekyler. På den anden side, FCS kræver molekylerne under behandling, til at være mobile. Det vil simpelthen ikke afsløre eventuelle formodede immobile fraktioner eller molekyler bevæger sig meget langsomt. Diffusionshastigheden af ​​molekyler,opholde sig fokus længere end ca. en tiendedel af købet tid vil ikke være korrekt repræsenteret i FCS målinger ^{3, 12.} Derfor diffusionskoefficienter indspillet af FCS tendens til at være hurtigere end diffusion satser rapporteret fra teknikker som FRAP og SPT, hvor der træffes de tæt-på-immobile og meget langsom fraktioner i betragtning. SPT vil også give en mere detaljeret beskrivelse af variabiliteten af ​​diffusion satser inden for den molekylære befolkning end FCS vil.

FCS kvantificerer udsving i fluorescens intensitet over tid inden for ophidset volumen. I tilfælde af membran målinger svarer dette til det belyste område af membranen. I dette papir, udnytter vi det faktum, at sådanne udsving er fremkaldt af molekyler udviser brownske diffusion og er således bevæger sig ind og ud af excitation volumen. Der er også flere andre mulige kilder til udsvingoner i fluorescenssignalet, såsom blinkende eller tilstedeværelsen af ​​en triplet tilstand i fluoroforer, miljømæssige virkninger, binding-uforpligtende af liganden, eller bevægelse af hele cellemembranen. Disse formodede fejlkilder skal tages i betragtning ved udformning af et FCS eksperiment for nøjagtigt fortolke resultaterne ^{12, 13.} Typisk laterale diffusionshastigheder i biologiske membraner er lav på grund af fortrængning og interaktioner, både mellem membranproteiner og mellem proteiner og cytoskelettet. Historisk set har anvendelsen af FCS i membraner således blevet hæmmet af manglen på foto-stabil fluoroforer, som er nødvendige for at undgå blegning i den forlængede transittider gennem excitation fokus ^14. Men i dag, er der masser af muligheder for egnede foto-stabil farvestoffer. Væsentlige forbedringer i detektorer og andet hardware tillader også påvisning af fluorescerende proteins og farvestoffer med lavere lysstyrke. Her, en grundlæggende protokol for anvendelse af FCS ved anvendelse murine primære lymfocytter, hvor proteinet af interesse er mærket med en fluorescerende mærkede antistof, er beskrevet. En tilgang til at passe til autokorrelationsfunktioner kurver for at ekstrahere diffusionskoefficienten og den molekylære tæthed er også vist. Protokollen har til formål at blive let efterfulgt af immunologer uden tidligere erfaring med teknikker til at studere diffusion af molekyler. Dog forventes en grundlæggende forståelse af konfokal mikroskopi (for at få denne grundlæggende forståelse, se reference ^15). Denne protokol kan relativt let tilpasses andre suspensionsceller, begge cellelinier og primære celler. For mere erfarne FCS-brugere, findes mere raffinerede analysemetoder, hvoraf nogle er beskrevet i diskussionen.

Protocol

1. Farvning for FCS

1. Isoler murine NK-celler fra miltlymfocytter anvender magnetisk bead mærkning, som pr fabrikantens protokol ^16. Brug 2-3 x 10 ⁵ celler pr prøve for de følgende trin.
   BEMÆRK: Anvend negativ selektion at berige målcellepopulationen, efterlader det urørt, således at cellerne kan mærkes ved anvendelse af primære antistoffer alene. Se henvisning ² for mere detaljerede oplysninger om celle isolation fra mus ^2.
2. For murine celler, der udtrykker Fc-receptorer, blokere Fc-receptorer med antistoffet klon 2.4G2 ved 5 pg / pl i 25 pi phosphatpufret saltvand (PBS) og 1% føtalt bovint serum (FBS) per prøve. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
3. Fremstilling af antistof-blanding.
   1. Brug antistoffer direkte konjugeret til et foto-stabil fluorophor. Hvis to antistoffer mod to forskellige proteinerer anvendt, brug fluorophorer, der har godt adskilt emission spektre for at minimere krydstale (f.eks ophidset af de 488 og 633 lasere ^2, senere i protokollen benævnt "grønne" og "røde" lasere og fluoroforer, henholdsvis ).
      BEMÆRK: Hvis kommercielle antistoffer mærket med foto-stabil fluoroforer er ikke tilgængelige for de udvalgte biomarkører, konjugerede umærkede antistoffer mod fluoroforer i overensstemmelse med producentens anvisninger. Se Materialer Tabel til antistofferne anvendt i denne undersøgelse.
   2. Forbered et antistof blanding ved fortynding fluorescensmærkede antistoffer mod proteinet eller proteinerne af interesse i PBS + 1% FBS. Tilsæt antistof mix til hver prøve til et endeligt volumen på 50 pi per prøve. Der inkuberes på is i 45 minutter i mørke.
      BEMÆRK: Optimer koncentrationen af ​​antistofferne i forvejen for at sikre, at antistoffet anvendes i en mættende koncentration, typisk1-10 ug / ml.
4. Efter inkubation vaskes cellerne ved tilsætning af 250 pi PBS og centrifugere dem ved 150 xg i 3 min. Supernatanten kasseres.
5. Gentag trin 1.4.
6. Resuspender cellerne i 200 pi PBS + 1% FBS. Hold på is og i mørke, indtil overtagelsen.
   BEMÆRK: Murint NK-celler kan opbevares på is i op til 10 timer.

2. Udarbejdelse af Mikroskop Chambered dækglas Slides

BEMÆRK: Brug kamre dækglas dias eller retter med dækglasset tykkelse, at mikroskopet er blevet optimeret til enten # 1 eller # 1.5. Hvis mikroskopet ikke er justeret til en vis tykkelse, eller hvis det er ukendt, skal optimeres for den aktuelle dækglas tykkelse ¹⁷ mikroskopet krave klinger.

1. Fortynd poly-L-lysin med destilleret vand i en 1:10 ratio. Tilsæt 200 pi fortyndet poly-L-lysin til kamrene og inkuberes i 20 min.
2. Fjernpoly-L-lysin ved aspiration og lad kammeret lufttørre ved at efterlade det uden låg ved stuetemperatur i mindst 20-30 min.

3. Start af FCS System

BEMÆRK: Denne protokol refererer til en specifik mikroskop og software (se Materialer / reagenser tabel), selvom der også kan anvendes andre mikroskopi opsætninger og softwarepakker.

1. Tænd konfokal laser scanning mikroskop med FCS korrelator. Åbn softwaren i "Expert mode". Vælg 40X nedsænkning i vand linse.
2. Under fanebladet "Acquire", tryk på "Config" og "Scan" for at åbne "Configuration Control" og "Scan Control" vinduer (vinduer A og B i figur 1, henholdsvis). Under "Confocor" fanen, skal du trykke på "Measure" åbne "måling" vindue (vindue C i figur 1).
3. Opret en mappe at gemme FCSmålinger. Start et nyt billede database ved at klikke på "Ny" under fanebladet "Filer".
4. Brug af "Laser" knappen, tænde halogenlampe og de relevante lasere til spændende fluoroforerne (fx 488 nm for den "grønne" excitation laser og 633 nm excitation for den "røde" excitation laser).
5. Vælg egnede excitation og emission filtre og aktivere de tilsvarende detektorer.
   1. Angiv indstillinger for billedoptagelse, herunder excitation laser, excitation og emission filtre, strålegang, og detektorer, der skal bruges, i "Configuration Control" vinduet.
   2. Tilsvarende angive de tilsvarende indstillinger for FCS målinger i "Måling" vinduet, under "System Configuration" fanen. Brug så lignende indstillinger som muligt for billedbehandling og FCS.
   3. Aktiver afsløring kanaler for FCS optagelser ved at markere feltet "Ch1" for den grønne Channel og "Ch2" for den røde kanal i "måling" vinduet.
      BEMÆRK: Indstillingerne skal være optimeret til fluoroforen (r), der anvendes, som i en standard konfokal imaging eksperiment. I efterfølgende eksperimenter, kan de samme FCS indstillinger genbruges ved at åbne en gammel FCS-fil, ved hjælp af "Confocor" pull-down menuen øverst af brugergrænsefladen, og vælge "Åbn fil." Tryk på "genbrug" i det nye erhvervelse vinduet. På samme måde kan indstillinger billedoptagelse indlæses ved at åbne et gemt billede og trykke på "Genbrug".
6. Vent til laseren er stabil, før du udfører FCS målinger. Dette kan tage op til 30 min for gas lasere, mens diodelasere stabiliserer hurtigere. Juster pinhole mens du venter.

4. Pinhole Justering

1. Forbered 0,2-0,5 uM opløsninger af fluorophorer eller fluorescerende farvestoffer, der svarer til excitations- og emissionsspektre af etiketterne på antistofferne. Detfluoroforer må have kendt diffusionskoefficienter ^{18, 19.}
2. Sætte en 50 pi dråbe opløsning med fluoroforen exciteres af den grønne laser i centrum af en brønd i en kamre dækglas slide. Sæt en dråbe destilleret vand på 40X vand objektiv og placere dias. Tryk på knappen "Vis" for at starte synligt lys og bruge okulær at finde og fokusere på fluorophoren drop.
   BEMÆRK: Brug samme dias som for senere celle målinger, da formodede små variationer i glas tykkelse mellem dias kan påvirke mikroskop tilpasning.
3. Placer fokus godt inde i flydende dråbe (10-100 um fra bunden).
4. I "måling" vinduet, skal du vælge "Acquisition" fanen. Tryk på "Aktuel position" under "Positioner" (vindue C i figur 1).
5. Retur til "System Configuration" fanen i samme vindue. Sætte en høj power for grøn laser.
   BEMÆRK: En høj lasereffekt refererer til mættende effekt (dvs. gør det fluorescerende signal ikke stige lineært hvis lasereffekten forøges yderligere). Omkring 1 mW af systemet strømstyringsindstillinger eller 5-10% af max laser magt, er typisk nok.
6. Test stabiliteten af ​​signalet ved at trykke "Start". Dette vil åbne et separat vindue, der viser tiden spor og autokorrelation kurve for den aktuelle måling. Kontroller at det fluorescerende signal er højt, stabilt over tid, og viser udsving i kHz snarere end Hz.
7. Vælg knappen "O Juster" i "Måling" vinduet. Kontroller, om den rigtige påvisning kanal (CH1 eller CH2) er valgt. Tryk på "AutoJustér X." Hvis den resulterende kurve ikke viser en klar maksimum, eller den maksimale er på kanten, markere "grove", og tryk på "AutoJustér X" igen. Når den resulterende skærm i x-retningen er færdig, skal du gøre samig for Y ved at trykke på "AutoJustér Y."
8. De-vælg "grov" og veksler mellem at justere X og Y ved at trykke på "AutoJustér", indtil begge har klare maksima og værdierne ændrer ikke mellem målingerne.
9. Hvis celler er mærket med to forskellige fluoroforer, flytte til et kammer, hvor rød fluorophor løsning er blevet tilføjet. Vælg en høj lasereffekt for den røde laser og gentag trin 4,6-4,8 for den røde excitation og detektion kanal.
   BEMÆRK: Hvis X og Y-værdier afviger mellem kanalerne i systemer, hvor kun en lille hul bruges til både afsløring kanaler, skal du vælge mellemliggende værdier og tryk på OK for at acceptere ændringerne. Her, for 488 nm laser med maksima ved X = 79 og Y = 189 og 633-nm-laser med maksima ved X = 80 og Y = 188, værdier X = 80 og Y = 189 blev udvalgt. Kombinationen af ​​de 488 nm og 633 nm laser til excitation af de to antistoffer mærket med fluoroforer ophidset af 488 nm eller 633 nm er et godt valg, da denrisiko for cross-talk minimeres, hvis emission spektre ikke overlapper hinanden ^2.

5. Mål Transit Time for Free fluoroforen

BEMÆRK: Ved at bestemme transittiden gennem fokus (TAUD) af en fluorofor med en kendt diffusionskoefficient, størrelsen af ​​volumenet detektion, og derfor området af cellemembranen, der er inden i fokus, kan beregnes. Beregningen af ​​TAUD er beskrevet i trin 7.2.

1. Brug de samme løsninger, der anvendes til pinhole justering, indstilles købet tid til 30 sek x 2 gentagelser under "Acquisition" fanen i "Måling" vinduet (figur 1, vindue C).
2. Start en måling ved at klikke på "Start" i "Måling" vinduet (figur 1, vindue B).
   1. Udfør en lasereffekt serie for hvert excitation laser og den tilsvarende fluorofor i opløsning, begyndende ved eller nærmætte magt og faldt med halvdelen til hver måling. Skift laser magt i "System Configuration" fanen af "Måling" vinduet (figur 1, vindue C). Tryk på knappen "Start" for at starte en måling.
      BEMÆRK: Medtag laser strøm til de kommende celle målinger i det nedre område (fx måle ved 16, 8, 4 og 2 pW magt, før målet) ^20. System laser indstillinger er generelt højere end produktionen excitation og kan variere i vid udstrækning afhængigt af mikroskopet og kvaliteten af ​​tilpasningen. I dette system ovenstående effektområdet svarer til ca. 60-500 pW systemindstillinger magt. Det anbefales at bruge en power meter til at måle effekt, før det mål første gang der anvendes et nyt mikroskop. Den nuværende maksimale effekt af laseren findes under "Info" knappen i "Måling" vinduet.
   2. Skriv ned tællingerne per molCule (CPM, Enhed: kHz) fra hver laser effektmåling.
   3. Hvis der anvendes to afsløring kanaler, skal du kontrollere vinduet viser autokorrelation kurven for krydstale. Brug en opløsning, der kun indeholder grønne fluoroforer til måling detekteret FCS autokorrelation i det røde påvisning kanal og en opløsning med kun røde fluoroforer at vurdere påvisning i den grønne påvisning kanal. Som en tommelfingerregel, holde CPM opdaget fra den "forkerte" fluorophor under 5% af den specifikke signal fra den korrekte fluoroforen.
   4. Kontroller, at værdierne skaleres lineært med laser strøm, der bruges. Mætning af CPM ved den højeste lasereffekten (dvs. lidt lavere værdier end forventet fra et lineært forhold) er acceptabel.
      BEMÆRK: CPM skal være et godt stykke over 10 for den højeste laser strøm til næsten alle mikroskop og fælles fluoroforer og kan være væsentligt højere for følsomme systemer. Første gang der anvendes en nyligt konjugeret fluorescerende antistof, udføre enFCS måling af antistoffet frit diffundere i opløsning at kvantificere den forventede CPM. Før målingen, belægge målekammeret med 200 pi poly-L-lysin podet med polyethylenglycol (fortyndet til 0,5 mg / ml i PBS) i 1 time ved stuetemperatur. Fjern væsken med en pipette og tillade kammeret at lufttørre. Gem stamopløsning i køleskabet (op til 2 uger) og pulveret lager i fryseren. Ved mikroskopet, fortyndes antistoffet til 1-10 ug / ml i PBS. Følg trin 4,2-4,4 og 6,7 i denne protokol. Hvis overfladen ikke er belagt med en ikke-klæbende løsning, vil antistoffer interagerer med glasoverfladen og hurtigt udtømt fra opløsningen.

6. Cell Målinger

1. Tilføj 125 pi celler i PBS + 1% FCS fra antistof-mærket cellesuspension (trin 1.5) og 150 pi af transparent Roswell Park Memorial Institute medium 1640 (RPMI) i en brønd på en 8-brønds kamre dækglas slide. Leave cellerne i mørke ved målingen temperatur i mindst 20 minutter, før du starter FCS målinger.
   BEMÆRK: Dette er for at lade cellerne sætte sig og lægger på bunden af ​​brøndene, og at ækvilibrere cellerne og løsning på måletemperaturen.
2. I vinduet "Scan Control" (figur 1, vindue B), sæt zoom 1 og starte en hurtig XY scanning ved at trykke på "Fast XY" knappen. Modificere lasereffekten, så den er så lav som muligt, mens cellerne stadig er klart synlige. Centrere billedet på en rund celle af lysstyrke, hvor membranen er klart defineret, og der er ingen fluorescerende signal i cytoplasmaet. Ind i indtil cellen dækker det meste af billedet.
3. Vælg en ny celle, hvis den aktuelle celle er i bevægelse eller viser slyngtråde, strengpressede eller meget lyse pletter. Hold samme zoom og laser strøm til alle celler fanget i samme eksperiment.
   BEMÆRK: En pjusket membran kan også være et tegn på kommende apoptose.
4. Fokus på toppen af ​​cellemembranen. I "Acquisition" fanen af "Måling" vinduet (figur 1, vindue C), skal du vælge en position for FCS måling ved at aktivere "Crosshair." Alternativt kan du vælge fanebladet "LSM billede", markere ønskede måling plet i LSM billedet, og tryk på "Tilføj position."
   BEMÆRK: Toppen af ​​cellemembranen vil ikke blive påvirket af fluorescerende antistoffer eller fluoroforer uspecifikt bundet til poly-L-lysin. Det er imidlertid vigtigt at sikre sig, at cellen ikke bevæger sig under målingen (se resultaterne).
5. I "Acquisition" fanen af "Måling" vinduet (figur 1, vindue C), skal du indstille antallet af gentagelser til 6-10, med "Mål Time" indstillet på 10 sek per gentagelse.
6. Retur til "System Configuration" fanen af ​​"Måling" vinduet. Juster laser strøm til FCS måling under "LAser "knappen. Før målet, bruge lav effekt til celle målinger i intervallet mellem 1 og 10 pW ^20.
   BEMÆRK: De anbefalede værdier er en afvejning mellem signal detektion og solskader til celler. Se trin 5.2.1 Bemærk procentdelen af ​​lasereffekten disse værdier svarer til.
7. Start en FCS måling ved at trykke på "Start" i "måling" vindue (vindue C). Hvis cellen blegemidler betydeligt i begyndelsen af målingen, som detekteret ved et fald i intensiteten spor med mere end 30% i den første 10 sek (et eksempel er vist i figur 3A, nedre panel), flytter til en anden celle og lavere lasereffekten for fremtidige målinger.
   1. Hvis signalet er tabt, justere fokus i Z-retningen. Efter målingen er færdig benyttes vindue "Scan Control" (figur 1, vindue B) for at kontrollere, at cellen stadig er centreret, og at cellemembranen blev målt. Hvis the celle er flyttet, kasseres målingen.
   2. I auto-korrelationen vindue, hvor målingen vises, manuelt slette enkelte gentagelser, der indeholder zoome manøvrer, blegning, store klynger eller andre artefakter (se eksempler i figur 3). Gør dette ved at markere dem, højreklikke og vælge "Slet." Gem den sidste fil i .fcs format. Spar mindst fire gentagelser per celle.
8. Eventuelt erhverve et billede af cellen ved den midterste sektion (med hele omkredsen af ​​membranen synlig) ved hjælp af "Scan Control" vinduet. Tage billedet efter FCS måling for at undgå blegning. Tryk på knappen "Single" for at starte capture billedet.
9. Hvis du bruger "Tilføj position" for FCS fokus positionering, skal du klikke på "Fjern position" før man går videre til den næste celle.
10. Skift til en ny prøve af cellesuspension efter maksimalt 2 timer af målingen til at holde cellerne levedygtige throughout eksperimentet.

7. FCS Analysis

1. Åbn .fcs filer i en software med kurvetilpasning kapacitet (se Materialer / reagenser Tabel til den software, der anvendes i denne protokol).
   BEMÆRK: FCS software, der følger med mikroskopet er et godt sted at blive fortrolig med grundlæggende montering, men ekstra software er nødvendig for at passe todimensional membran diffusion.
2. Først bestemme størrelsen af ​​excitation volumen ved at analysere de frie fluoroforen målinger. Monter en 3-dimensionel fri diffusion kurve til autokorrelationsfunktioner kurverne ^21.
   (Eq. 1)
   BEMÆRK: Definition af parametre: N: gennemsnitligt antal fluorescerende enheder i fokale volumen, τ (Tau): korrelation tid, τ _D (TAUD): gennemsnitlig opholdstid i fokale volumen, T 1: Sandsynligheden for fluoroforer at være i triplet tilstand, τ <sub> T: relaksationstiden for singlet-triplettilstand overgange, S: forholdet mellem højde og bredde diameter for det fokale volumen.
   1. Uddrag TAUD, transittiden for molekyler at overføre fokus.
   2. Brug de observerede TAUD og offentliggjort diffusionskoefficienter (D) af fluorophorer anvendes til kalibrering ^{18, 19} til at beregne pinhole radius (ω).
      (Eq. 2)
3. Analyse af autokorrelations kurver på cellemembraner.
   1. At visualisere den del af kurven, der repræsenterer molekylær diffusion, vælge den tidsramme starter før den stejleste hældning af autokorrelation kurve og slutter efter kurven konvergenser på 1 (f.eks 0,001 til 5 sek for murine overfladereceptorer, se figur 4).
   2. Generer en gennemsnitlig autokorrelation kurve af de enkelte gentagelser gemte in trin 6.7.2.
   3. Monter en 2-dimensional membran diffusion kurve til hver gennemsnit autokorrelation kurve ved hjælp af ligning 3 ^3.
      (Eq. 3)
      BEMÆRK: Vigtige output parametre er som følger: N er det gennemsnitlige antal molekyler, der er bosiddende inden for det begejstrede membran området. Genberegne til densitet (N / um ^2). τ _D (TAUD): gennemsnitlig opholdstid i fokusområde, begrænset af to dimensioner af membranen (r). Genberegne gennemsnitlige opholdstid til en diffusionskoefficient (gm ² / sek) via den bestemte pinhole radius (ω) og ligning 2. T1 er sandsynligheden for fluoroforer at være i triplettilstand. Lysstyrken (CPM) beregnes ved at dividere den gennemsnitlige samlede intensitet af målingen af ​​N.
   4. Hvis en god pasform der ikke opnås ved første forsøg, skal du ændre startende værdier og / eller de øvre og nedre grænser for variablerne indtil this er opnået.
      BEMÆRK: Typiske øverste nedre grænser for protein diffusion satser i ubearbejdet cellemembraner er 10-500 ms for TAUD, 0-100% for T1, og 0,1-5 ms for TauT1. Vælg startværdierne af fittingen i midten af ​​disse intervaller. Den del af kurven repræsenterer fluorescens udsving afledt af diffusion er typisk placeret mellem 1 ms og 1 sekund (se figur 4). Afhængigt af fluorofor, kan der undertiden være en anden proces til stede, giver anledning til autokorrelation med kortere tidsskalaer end diffusionen parameter. Dette er forårsaget af en forbigående mørk tilstand (triplet) eller blinker (som ofte forekommer for fluorescerende proteiner). En triplet tilstand regnskabsmæssigt i ligning 3, og den præsenterede model bør således også give en god pasform i disse situationer.

Representative Results

Et typisk resultat vil generere en autokorrelation kurve med en transittid i området fra 10 msek til 400 msek for membranproteiner. Antallet af molekyler kan variere mellem 0,5 til omkring 200 pr um ² for endogent udtrykte proteiner. Kontroller omhyggeligt, at CPM ikke er lavere end forventet. Dette kan betyde, at der er en påvirkning af baggrundssignalet. Som en tommelfingerregel bør CPM signalet på celler, der er godkendt til analyse ikke være lavere end 33% af CPM for frit diffundere antistoffer på samme laser magt. CPM bør skalere lineært med lasereffekten. Autokorrelation kurve for primære immun celleoverfladereceptorer forventes at være glat, med den stejleste del mellem 0,001 og 1 sek. Se figur 2 for en repræsentativ autokorrelation kurve og dens tid spor.

Som kort nævnt i indledningen, denre er flere tilfælde, hvor FCS er ikke egnet til måling molekylær diffusion på grund af påvirkning af andre kilder til fluorescens udsving, som bidrager til confounding signalet. Figur 3 viser eksempler på tilfælde, hvor en bestemt celle eller måling gentagelse skal kasseres. Det er allerede blevet nævnt, at en ekstremt lav signal (meget lav CPM) er grund til at kassere cellen. En anden grund til at kassere den enkelte celle er, at cellen er i bevægelse (figur 3A). I tilfælde af blegning (figur 3B), eller hvis store klynger er til stede (figur 3C), bør målingerne kasseres hvis virkningen er væsentlig eller til stede under hele målingen. Hvis denne funktion er kun til stede i et eller to gentagelser, kan disse individuelle gentagelser kasseres, men de resterende gentagelser kan fortsat anvendes.

Det er vigtigt at begge anvender den korrektemodel til at passe dataene og også at kontrollere omhyggeligt, at pasformen tæt overlapper med autokorrelation kurve. I figur 4 er vist eksempler på gode og dårlige kurve passer. Vær meget opmærksom på den del af kurven repræsenterer diffusion (den mest stejlt skrånende del). Det er også vigtigt at sikre sig, at både begyndelsen og afslutningen af ​​den skrånende del af kurven er godt monteret af modellen. Hvis pasformen er dårligt, uden åbenbare problemer såsom bevægelige, blegning, eller klynger, ændre udgangspunktet værdier og / eller de øvre og nedre grænser (inden for en rimelig rækkevidde), før der træffes en endelig beslutning om at skille sig af cellen.

Figur 1: FCS software interface. Vist her er de vigtigste vinduer nødvendige for at drive den softwareværktøj til FCS erhvervelse og billedbehandling, som beskrevet i protokollen. Vindue A, "Konfiguration Control "vinduet er kontrol vinduet for strålegangen, laser-kanaler, og filtre til billeddannelse. Vindue B er" Scan Control "vindue til billedbehandling og viser scanningsindstillinger. Vindue C er" Måling "vinduet, vinduet for opsætning af måleindstillinger FCS. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Repræsentativ spor- og autokorrelations kurver af spredende H-2D ^d major histocompatibility klasse I overflademolekyler i frisk isolerede murine NK-celler. Det øvre panel i figuren viser fluorescens udsving som funktion af tid i hele tidskurven for 7x 10 sek målinger. Den nederste panel repræsenterers den midlede autokorrelation kurven fra disse syv gentagelser. Højden af autokorrelation kurve er omvendt proportional med koncentrationen af mobile fluorescensmærket H-2D ^D enheder inden den fokale volumen. X-aksen værdi på den stejleste del af hældningen af kurven, halvdelen af amplituden, repræsenterer den gennemsnitlige opholdstid for fluorescensmærket H-2D ^D molekyler i det fokale volumen. Målingen præsenteres er en del af datasættet offentliggjort i reference ^2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Eksempler på problematiske celle spor. (A) En bevægelig celle, som eksemplificeret ved spor ikke at have en stabil basal level. Toppanelet viser et eksempel, hvor hele cellen er flyttet ud af fokus efter ca. 35 sek, som repræsenteret ved den meget lave signal efter dette tidspunkt. I det nedre panel, effekten er mere subtile, med undulationer åbenbare ved et interval på adskillige sekunder. (B) Cell viser blegning, højden af spor faldende med tiden. Sammenlign højden af ​​spor ved begyndelsen af ​​målingen til at der ved udgangen af ​​målingen. (C) Tilstedeværelsen af store klynger, repræsenteret ved pigge i spor. I det øverste panel, en stor klynge ved 20-25 sek er til stede. I det nedre panel, flere klynger er repræsenteret over hele målingen. Målingerne præsenteres er en del af datasættet offentliggjort i reference ^2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentative autokorrelationsfunktioner kurver med kurve-fitting og restprodukter. De røde og blå lodrette linier repræsenterer grænserne for tidsvinduet anvendes til montering. (A) Eksempel på et repræsentativt pasform af en 2-dimensional diffusion model til en prøve autokorrelation kurve. I det øverste panel, den grønne kurve (model) overlejrer blå kurve (den erhvervede autokorrelation), hvilket indikerer en god pasform. Det nedre panel viser den resterende fra kurvetilpasning. Udsvingene omkring 1 sek, der ikke er monteret godt, er typiske for celle målinger og er acceptable. (B) Eksempel på en dårlig pasform af 2-dimensional diffusion til den samme autokorrelation kurve. Den udstyret modellen ikke overlejrer autokorrelation kurve, og det ikke konvergerer ved 1. De nedre paneler i (A og B) viser det tilbageværende fra kurvetilpasning. residualerneer betydeligt større for den dårlige pasform, især for diffusion del af kurven. Målingen præsenteres er en del af datasættet offentliggjort i reference ^2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol for FCS kan anvendes til vurdering af de molekylære dynamik overflademolekyler på alle typer immunceller (murine, humane eller andre arter). FCS måler spatio-temporale molekylær dynamik ned til enkelt-molekyle opløsning i levende celler. Den molekylære tæthed, samt diffusionshastigheden og klyngedannelse dynamik proteinerne af interesse, kan ekstraheres fra autokorrelationsfunktioner kurver.

Den fluorescerende mærkning er af central betydning for en vellykket FCS eksperimenter. Proteiner af interesse på cellemembranen er traditionelt blevet mærket ved anvendelse af antistoffer, og antistoffer er ofte mest praktisk til brug på overfladeproteiner i naive immunceller. Umærkede antistoffer skal være direkte konjugeret til foto-stabil fluorescerende farvestoffer med høj molekylær lysstyrke. Udvælgelsen af ​​fluoroforen til antistofkonjugering er vigtigt for kvaliteten af ​​målingerne. Standard etiketter til flowcytometri,såsom fluorescein og phycoerythrin-baserede farvestoffer, ikke anbefales på grund af hurtig blegning. Foto-stabile farvestoffer til direkte konjugation til antistoffer i øjeblikket leveres af flere selskaber. Producenterne giver normalt tilfredsstillende protokoller til konjugering og rensning af det resulterende konjugerede antistof, og dette kan gøres på et par timer. Det er også muligt at udføre FCS hjælp fluorescerende proteiner, men der bør tages særlig omhu for at minimere laser magt, da fluorescerende proteiner er generelt mere tilbøjelige til blegning end de fleste foto-stabil kemiske fluoroforer. Ifølge tidligere erfaringer, over-ekspression af proteiner fører ofte til et betydeligt fald i diffusionshastigheden skyldes fortrængning, som gør brug af fluorescerende proteiner uegnede.

Pinhole kalibrering før målingerne er også et kritisk trin. De fluorophorer anvendes til at bestemme størrelsen af ​​den fokale volumen må have kendt diffusionskoefficients (se ligning 2). Brug gratis fluoroforer svarer nøje til emission spektre af de antistof etiketter for at bestemme størrelsen af ​​den fokale volumen. Dette skal gøres for at sikre optimal signalkvalitet effektivitet og korrekt detektion af potentielle krydskorrelationer mellem farvekanaler. Udfør en FCS lasereffekt serie af de frit spredende fluoroforer at sikre, at systemet giver den forventede udgangssignal over en række beføjelser. Sammenlign CPM på samme laser magten mellem eksperimenter for at sikre overensstemmelse mellem forsøgene.

I analysen trin, er det vigtigt at sætte rimelige intervaller og startværdier for variabler ved montering model. Brug tidligere offentliggjorte viden fra lignende cellesystemer at finde gode udgangspunkter. Teoretisk FCS er en kvantitativ teknik, men da optimale betingelser sjældent opstår, skal tages ved fortolkning af resultaterne en vis grad af forsigtighed. Alle typer af udsving vil blive registreret,uanset oprindelsen af ​​sådanne udsving. Derfor er det nyttigt at have så mange oplysninger som muligt om det eksperimentelle system for at udelukke mulige fejlkilder. For eksempel vil bevægelse af hele cellemembranen give anledning til udsving med længere TAUD (figur 3A), hvorimod formodede forureninger af de frie fluorophorer i opløsningen vil diffundere med mindst ti gange kortere TAUD.

Denne grundlæggende protokol kan modificeres på flere måder. Hvis to proteiner er mærket med forskellige fluoroforer, kan co-diffusion (et indirekte mål for vekselvirkning) vurderes ved at udvide den metode til påvisning af krydskorrelationen. I hvilket omfang disse proteiner binder til hinanden i cellemembranen er repræsenteret ved højden af ​​krydskorrelationen kurve i forhold til højden af ​​autokorrelations kurverne i de enkelte farvekanaler. Krydskorrelation benævnes Ch1-Ch2 i målingen software. præpræcise analyse af krydskorrelation kræver kontrol for cross-talk og er således noget mere kompliceret end den protokol, der præsenteres her. En detaljeret beskrivelse af hvordan vi kommer videre, som en udvidelse til denne grundlæggende protokol, kan findes i Strömqvist et al. ^13. For at optimere placeringen i z-retningen, kan z-scanning FCS anvendes ^22. Ifølge tidligere erfaringer, har det været tilfredsstillende at gøre det manuelt. Det er også muligt at montere flere diffusionskoefficienter til en FCS autokorrelation kurve ^23. Dette kræver forudgående kendskab til antallet af subpopulationer med forskellige diffusionshastigheder og de omtrentlige diffusionshastigheder af mindst en af ​​de subpopulationer. Ellers vil der være alt for mange frie variabler, som vil gøre fittingen upålidelige. Et typisk eksempel ville være en overflade protein, hvis diffusionshastighed er betydeligt langsommere ved bindingen af ​​en ligand. Endelig cleanIng spor af outliers uden helt at fjerne gentagelser er mulig ^24.

Manglen på en fluorescerende signal er et fælles problem for fejlfinding. For frit diffuserende fluoroforer bruge halogenlampe at kontrollere, om faldet er fluorescerende. Hvis dråben ikke fluorescerende, blande en ny batch af fluoroforer med en let øget koncentration (i nM interval), og prøv igen. Kontroller, at der inden for den fluorescerende slip, er laserne tændt fokus i softwaren, laser magt er tilstrækkelig, er de korrekte emission filtre og detektorer valgt, og de rigtige kanaler i "FCS Measurement" vinduet er aktiveret (se trin 3.6). Start laseren og ser fra siden til visuelt at bekræfte, at laserlyset når prøven. Undgå at se direkte ind i laseren kilde. Hvis den valgte emission filter omfatter laserbølgelængden, vil en lukker automatisk blokere strålegangen at undgå skader på detektoren. jegf alle indstillinger er fint, men intet lys kommer, re-starte lasere, FCS-systemet, og computeren. Spørg en ekspert, hvis manglen på en fluorescerende signal fortsætter. En forenklet procedure gælder, hvis de mærkede celler ikke vise fluorescens. Bekræfte tilstedeværelsen af ​​fluorescens med halogenlampe; tænde laserne, vælge laserkanaler, og justere lasereffekten. Vælg en position på cellemembranen, enten ved hjælp af "Crosshair" eller "Tilføj position" option (se trin 6.4). Skift til den næste prøve, hvis signalet er stadig for lavt.

Et vigtigt aspekt af svingningerne grundlag af teknikken er, at molekyler skal være rimeligt mobile, der skal detekteres. Meget langsomt bevæger fraktioner af eller molekyler fanget i områder mindre end fokus under hele måletid kan derfor ikke måles. Dette fører til en eventuel undervurdering af overflade tætheder og en overvurdering af diffusionshastigheden. Blegningkan også bidrage til en formodet undervurdering af både tætheden og TAUD, eftersom molekyler vil have en højere sandsynlighed for at blive bleget jo længere tid, de tilbringer i laser-belyste fokal volumen. Indflydelse fra baggrunden (fluorescens fra uden for fokusplanet) ville på den anden side, kunstigt øge antallet af detekterede molekyler og mindske den målte CPM. Tidligere blev den samlede maksimale fejl i den absolutte massefyldebestemmelse skønnes at være omkring 40% ^20. Imidlertid er det som regel muligt at sammenligne forskellige biologiske prøver til hinanden, da de fejlkilder er, i de fleste tilfælde lig hele eksperimenterne. En anden potentiel fejlkilde er, at antistoffer er bivalente, hvilket betyder, at hvert antistof potentielt kan binde til to målmolekyler. Forfatterne observerede ikke dette fænomen, men det kan ikke garanteres, at dette er en global funktion for andre antistoffer. Den potentielle indflydelse af bivalens skalderfor testes individuelt for hvert antistof. Kombinationen af ​​specifikke primære og mærkede sekundære antistoffer må aldrig anvendes på grund af den høje risiko for at fremkalde kunstige klynger fra to på hinanden følgende bivalente etiketter. Hvis celler i stedet er blevet transficeret med fluorescerende protein-mærkede versioner af proteinet af interesse, vil hver protein har kun én etiket. Dette kræver imidlertid transfektion, hvilket ikke altid er ønskeligt og kan endda være muligt (fx hvis der anvendes immune celler direkte isoleret fra humant blod). Endelig er single-point FCS ikke optage billeder. Hvis der er behov billeder til offentliggørelse eller andre formål, skal disse opfanges separat med den billeddannende del af softwaren. fange altid billeder efter FCS målinger for at undgå unødvendig blegning af celleoverfladen.

I modsætning til FCS, traditionelle konfokal-baserede mikroskopi, såsom FRAP, og image korrelation metoder kan ikke kvantificere fluorescens udsvingpå single-molekyle niveau ^6. Billede sammenligningstabeller metoder måle antallet af molekyler indirekte og med lavere opløsning, men de kan vurdere variabiliteten af molekylær diffusion og klyngedannelse over hele afbildede område ^25. Standard SPT målt ved konfokal mikroskopi har en ideel niveau af mærkning, størrelsesordener lavere end FCS ^7. Derfor kan tætheden af ​​mærkede proteiner ikke måles ved standard-SPT. Kombinationen af SPT med andre mikroskopiteknikker (f.eks stokastisk optisk genopbygning mikroskopi eller fotoaktivering lokalisering mikroskopi) tillader tætheden og udviklingen fastsættes, men det kræver meget specialiserede farvestoffer eller proteiner ^11. Super opløsning teknikker, såsom strukturerede belysning mikroskopi og stimuleret emission udtømte mikroskopi, kræver ofte faste prøver og en kombination af primære og sekundære antistoffer til labeling ^26. Lokalisering er derfor meget præcist, mens kan ofte ikke vurderes dynamikken i systemet. I forhold til SPT og super opløsning teknikker, FCS kræver også væsentligt mindre computerkraft og tid til analyse og udvinding af resultater. Flowcytometri er arbejdshest af immunologi og kan gunstigt kombineres med FCS. Cellesortering kan for eksempel blive efterfulgt af efterfølgende målinger på udvalgte cellepopulationer, hvis tilgængeligt-stabile farvestoffer havde været brugt før sorteringen. FCS er således en metode, der kan anvendes alene eller i kombination med andre etablerede fremgangsmåder.

Denne protokol kan anvendes til at identificere øjeblikket ukendte træk ved immuncellepopulationer dynamik og interaktioner i cellen membran ved den enkelt-molekyle niveau. Endvidere kan funktioner i hele befolkninger versus udvalgte undersæt sammenlignes. Det har også en potentiel rolle som en markering skridt for immun celleterapi. Da målingerne gøreikke forbruge cellen, i modsætning til de fleste andre metoder til at undersøge funktionaliteten af ​​immunceller, kan individuelle celler potentielt udvindes og dyrkes. Således efter analysen af ​​FCS kurver, lovende celler kan udvindes og udvides til yderligere applikationer, herunder putative kliniske anvendelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	-	-	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom