Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Зика Вирус (ZIKV) является новым патогеном, который связан с отклонениями в развитии плода, таких как микроцефалия, дефектами глаз, и ослабленный рост. ZIKV является РНК - вирусом из семейства Flaviviridae. ZIKV в основном передается комарами, но также может быть распространен материнской плода вертикальной передачи, а также сексуального контакта. На сегодняшний день не существует надежных лечения или вакцины варианты, доступные для защиты лиц, инфицированных вирусом. Развитие воспроизводимым, эффективного вируса Зика системы инфекционного культивирования клеток имеет решающее значение для изучения молекулярных механизмов репликации ZIKV, а также разработки лекарственных средств и вакцин. В связи с этим, протокол описания клеток на основе в пробирке Zika системы культуры млекопитающих от вирусов для вирусного роста производства и анализа сообщается здесь. Более подробная информация о формировании бляшек вирусом Зика на монослой клеток и анализа бляшек для измерения вирусного титра представлены. Кинетика репликации вирусного геномаи replicatory промежуточные двухцепочечной РНК генома определяются. Эта культура платформа была использована для экрана с библиотекой небольшого набора цитокинов, в результате идентификации интерферона-альфа (IFN-a), ИФН-β и IFN-γ в качестве сильнодействующих ингибиторов Зика вирусного роста. Таким образом, инфекционный Зика вирусная система в пробирке культура и различные вирусологические анализы показано в этом исследовании, у которого есть потенциал , чтобы большую пользу научному сообществу в выяснении дальнейшем механизмы вирусного патогенеза и эволюцию вирусной вирулентности. Противовирусные IFN-альфа может быть дополнительно оценена в качестве профилактического, постэкспозиционная профилактического и вариант лечения для Зика вирусных инфекций в группах высокого риска, в том числе инфицированных беременных женщин.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Зика Вирус (ZIKV) является важным патогеном человека , связанный с микроцефалия и бедными беременности исходы 1,4. ZIKV принадлежит множеству соответствующих медицинской точки зрения флавивирусов, которые могут вызвать неврологические дефекты, такие как лихорадка денге, Западного Нила и вируса энцефалита Сент-Луис. Основной способ передачи вируса является москита вектора комар жёлтолихорадочный, и, кроме того, передача инфекции половым путем также сообщалось 5,6. ZIKV стала одним из основных глобальной проблемой здравоохранения из-за расширения географического распределения вектора комара и его сильной корреляции с врожденными дефектами. ZIKV был впервые выделен в 1947 году из дозорного макаки - резуса в лесу Зика, Уганда и первый случай заболевания человека был зарегистрирован в 1952 году 7,8. Лица, которые становятся зараженными ZIKV настоящего с умеренными симптомами, такими как лихорадка, сыпь, головная боль, конъюнктивит и мышцы / боли в суставах. Инфицированные беременные женщины могут передавать ZIKV для развивающегося плода 1. ZIKV инфекция также связана с синдромом Гийена-Барре, периферического нерва аутоиммунной демиелинизации расстройства 9.

Вирусный геном Зика состоит из положительном смысле, одноцепочечной молекулы РНК, которая составляет около 10,8 тысяч пар нуклеотидов в длину. Структура генома организована 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR с некодирующие областей (NCR), фланкирующих область белоккодирующей 6. Один полипротеина (3419 аа) переводится именно со- и посттрансляционно расщепляется на 10 небольших пептидов. Оба 5'NCR и структуры стволовых петля 3'NCR РНК играют решающую роль в начале вирусного генома трансляции и репликации. Структурные компоненты генома состоят из капсида, мембран и белков оболочки. Неструктурные белки имеют решающее значение для репликации генома.

В настоящее время вирусные штаммы Zika сгруппированы в три основных генотипов: Западной Африки, Восточной Африки и Азии 6,10-13. Было высказано предположение , что восточноафриканское родословная распространилась на Западной Африке и Азии, где впоследствии дальнейшее развитие 12. Азиатский генотип несет ответственность за нынешние вспышки в Северной и Южной Америке. Вирус Зика может культивироваться в обоих комара и в клетках млекопитающих. Первичные фибробласты кожи, незрелые дендритные клетки, корковые нервные клетки - предшественники и клетки Vero чувствительны к Зика вирусной инфекции 10,14,15. Интерфероны обоих типов I и II типа , как было показано , чтобы ограничить рост ZIKV в кожных фибробластов 15. Целями данного исследования являются обеспечение поэтапного, подробный протокол для производства и опробования азиатских генотипа Zika вирусного штамма PRVABC59 в в системе культивирования клеток млекопитающих и продемонстрировать полезность этой инфекционной системы культуры в качестве платформы разработки лекарственных средств. Этот ресурс имеет потенциал, чтобы в значительной мере способствовать Zika вирусные и неврологическое научное сообщество дальнейшее выявление IТ.С. механизмы вирусного патогенеза и эволюции вирусной вирулентности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: Схематическое контур потока работы представлен на рисунке 1.

1. Клетки

  1. Использование Vero клеток для вирусного производства и анализа вирусного цикла репликации Зика.
  2. Подготовка полной среды для роста, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицина (100 ед / мл), и 10 мМ HEPES.
  3. Культура клеток Vero с указанной полной ростовой среде при температуре 37 ° С с 5% CO 2.

2. Зика Вирус Производство

  1. Урожай клетки Vero при плотности 80% клеток с использованием 0,25% трипсина в Т-75 колбу и подсчета клеток.
    1. Аспирируйте носитель из культуральной колбы Т-75 и промойте клетки с 2 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
    2. Добавляют 2 мл 0,25% трипсина и инкубировать колбы при 37 ° С в течение 5 мин.
    3. Добавить 8 мл сыворотки, содержащей среду для роста инактивирует трипсин. Пипеткой вверх и вниз к СусПЭНД клетки и переносят клетки в 15 мл пробирку.
    4. Удалить 10 мкл клеток и смешивают с равным количеством 0,4% трипанового синего. Загрузите подготовленную смесь счетной ячейки камеры горкой и получить жизнеспособную Цитоз с использованием автоматического счетчика клеток.
  2. Семенной в общей сложности 7 миллионов клеток в объеме 30 мл в колбу Т-160.
  3. На следующий день, подготовить соответствующую множественности заражения (от 0,01 до 0,1 МВД) Зика вируса инокулята в 10 мл бессывороточной культуральной среды на колбу.
  4. Удалите отработанный материал из колбы Т-160, а затем добавить свежеприготовленный вирусный инокулят (10 мл).
  5. Инкубацию засеянных колб в 37 ° C с 5% CO 2 в течение 4-6 ч. Спред прививочный, осторожно наклоняя колб боком на каждом час.
  6. При завершении инкубации, заменить прививочный материал с теплой ростовой средой сывороткой (30 мл) для каждой колбы. Затем продолжить культивирование вируса в течение следующего 96 часов.
  7. Проверьте прогрессирование вфекции путем наблюдения появления вирусных бляшек на монослое клеток с использованием фазового контраста микроскопа и получения изображений (рисунок 2) в случае необходимости в 40X и 200X увеличениях.

фигура 2
Рис . 2: Бляшки , образованные вирусом Зика на монослой клеток Vero поля изображения Яркие различных увеличениях показывают Zika вирусных бляшек на 48 HPI. Обратите внимание на наличие округлой клеток очагов на монослой. (Шкала бар = 50 мкм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Урожай надосадочной жидкости культуры клеток в момент времени 96 ч и центрифугируют надосадочной жидкости при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
  2. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулированной мусора и т переносаO 15 мл пробирки. Ультрацентрифугирование при 24000 XG могут быть выполнены, чтобы сконцентрировать вирусные частицы (необязательные).
  3. Хранить вирусные супернатантов культуры в нескольких аликвотах при -80 ° C.

3. Измерение Зика Вирус Титр бляшкой Пробирной

  1. Семенной наивные клетки Vero на 1 × 10 5 клеток на лунку в 2 мл объема с использованием 12-луночного планшета.
  2. На следующий день, подготовить 10-кратных серийных разведений вируса супернатантов культуры, собранных из Т-160 колбы с использованием не содержащей сыворотки среде. Удалите истощенные среды из каждой лунки и добавляют 400 мкл приготовленного инокулюма на клетки Vero в трех экземплярах.
  3. Инкубацию засеянных колб в 37 ° C с 5% CO 2 в течение 4-6 ч. Распространение прививочный, осторожно наклоняя тарелку в сторону на каждом один час.
  4. В конце инкубации, замените прививочный материал в присутствии сыворотки, дополненной сред (2 мл на лунку).
  5. В 48 ч после инокуляции подсчета вирусной фокусы с использованием фазы CONTRAST микроскоп. Рассчитывают титр вируса в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл. Смотрите рисунок 3 для анализа бляшек.
  6. Фикс и окрашивают клетки в 4% формальдегида и 0,1% раствор кристаллическим фиолетовым, приготовленные в 20% этанола для четкой визуализации бляшек.

Анализ 4. Зика вирусного генома репликации

  1. Семенной наивные клетки Vero на 1 × 10 5 клеток на лунку в объемах 2 мл с использованием 12-луночного планшета. На следующий день готовят вирусный инокулята (MOI от 0,01 до 0,1; 400 мкл / лунку) низкого и высокого титра с использованием бессывороточной среды в трех экземплярах. Для макете инфекции, используйте бессывороточной среды (400 мкл / лунку) только.
  2. Повторите шаги 3.2 до 3.4.
  3. На 48 и 96 часов моменты времени, собрать образцы для РНК и иммуногистохимии (ICC).
    1. Для получения образцов заготовки РНК, удалите носитель, а затем добавить 400 мкл лизирующего раствора непосредственно в каждую лунку и собрать лизатов.
    2. Для ICC, удалите средства массовой информации и ткурица фиксации клеток путем добавления 1 мл метанола в каждую лунку и инкубируйте при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
    3. Из лизата клеток, изолируют тотальной РНК с использованием набора для выделения РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественная РНК с использованием спектрофотометра.
  4. Выполните обратную транскрипцию двухступенчатую количественный ПЦР (RT-КПЦР) для определения содержания ZIKV генома от заготовленной РНК.
    1. Для обратного транскрибировать РНК, первый раз настраивали реакционной смеси 13 мкл, состоящей из 5 мкг выделенной РНК, 1 мкл дНТФ (10 мМ) и 1 мкл случайного гексамере (250 нг) в 0,2 мл пробирку. Инкубируйте пробирку при 65 ° С в течение 5 мин, а затем поместить его на льду в течение одной минуты. Затем добавляют 1 мкл обратной транскриптазы, 4 мкл 5х буфера для синтеза цепи, 1 мкл 0,1 М дитиотреитола и 1 мкл ингибитора РНКазы в реакционной смеси. Инкубируйте пробирку в течение еще 5 мин при 25 ° С, а затем 60 мин при 50 ° С и неактивноели реакции при нагревании до 70 ° С в течение 15 мин.
    2. Выполните КПЦР с использованием 1 мкл кДНК, полученной с 12,5 мкл 2x зеленого красителя супер смесь, содержащую ДНК-полимераза, и 1 мкл 10 мМ индивидуальных праймеров, специфичных для вируса Зика [Zika вируса пан-генотип праймеров (для: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), вирус Зика Азиатский генотип PRVABC59 штамм праймеров (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], или вирус гепатита С (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), или клеточный ген GAPDH, ведение домашнего хозяйства (для: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; REV: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') в объеме реакционной смеси 25 мкл.
    3. Выполните ПЦР с использованием условия запуска 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 30 секунд (40 циклов) в режиме реального времени системы ПЦР.
    4. Используйте уровень экспрессии GAPDH на основе порогового цикла значение (Ct) для нормализации ZIKA измерения вирусного генома. Вычислить значение дельта Ct (& Delta ; CТ) из генома Зика сравнению с этим GAPDH и получить значение 2 & Delta ; CТ. Затем рассчитать кратное изменение, беря отношение нормированных содержание генома Zika между инфицированных и неинфицированных клеток в указанные моменты времени. Рисунок 4 для репликации результатов ZIKV генома.
  5. Выполнение ICC с использованием метанола фиксированных клеток.
    1. Промыть фиксированные клетки три раза 1x PBS и блок с ICC блокирующим буфером (3% сыворотки козы, 3% БСА, 0,1% тритона-Х 100 в PBS).
    2. Используйте мышиное моноклональное анти-дсРНК антитела J2 (1 мкг / мл) в разведении 1: 100 в блокирующем буфере и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
    3. Промывают клетки с 1х PBS и добавляют козий вторичное антитело анти-мышь IgG-594 (1 мкг / мл) при 1: 1000 разбавление в блокирующем буфере и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.
    4. Вымойте клеток с 1x PBS и красителем для ядер с использованием Hoechst красителя инаблюдать клеток с использованием флуоресцентного микроскопа при 100 - кратном увеличении (рисунок 4).

5. Скрининг цитокин библиотеки против Зика вирусной инфекции

  1. Семенной наивных клеток Vero в количестве 1 × 10 5 клеток на лунку с использованием 12-луночного планшета. После того, как клетки прикреплены (6 ч после высева), добавьте каждого цитокина в указанных концентрациях в биологических дублей (2 мл объема / лунку). Включите транспортное средство (PBS) в одиночку контроль.
  2. В 12 ч после обработки, выполняют Zika вирусной инфекции (MOI 0,1 в 400 мкл на лунку). Включите отрицательные скважины контроль без инфекции (макете).
  3. В течение 4 часов после инфицирования, замените вирусный прививочный материал с цитокинами лечение сред (2 мл). Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение дополнительного 44 ч.
  4. В 48 ч после инфекции, вирусные подсчет бляшек с помощью фазово - контрастного микроскопа и получить репрезентативные изображения инфицированных клеток при 40 - кратном увеличении (рисунок 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Вирусный штамм Зика (PRVABC59; GenBank инвентарный номер KU501215) азиатского генотипа использовали в данном исследовании 12. Веро клетки на 80% сплошности были использованы для исследования De Novo Zika вирусной инфекции. Для вирусного производства и последующего вирусологической характеристик, был применен ранний переход вируса (P3) Зика. Вирусные бляшки наблюдались на второй день после заражения. Зика вирусные потомства , высвобождаемые из первоначально зараженной клетки могут распространяться на соседние клетки, что приводит к образованию видимых бляшек на культуре монослоя (рис 2). Цитопатический эффект (ЦПЭ) от Зика вирусной инфекции характеризуется морфологическими изменениями, такими как скругления и отсоединении клеток, а также литической гибель клеток.

Для измерения титра вируса, содержащую вирус свободный от клеток супернатант собирали из Т-160 колбы подвергали 10-ВОЛПd последовательное разведение и добавляют на монослое клеток Vero в 12-луночного формата пластины (Рисунок 3). 48 ч момент времени после инокуляции использовали в качестве конечной точки, чтобы избежать подсчета бляшек, возникающих от вторичной инфекции. Скважины с 30-100 бляшек были выбраны для подсчета, чтобы получить точный титр.

RT-КПЦР анализ был использован для оценки репликации генома вируса Зика. Праймер пара пан-генотип специфическим для высоко законсервированного ZIKV области NS5 был включен 3,16. Zika вирусный штамм праймеров PRVABC59 специфичные на основе геномного расположения пан-генотипической праймеров (последовательности праймеров приведены в разделе 4.4.2 протокола) также были протестированы. Обе пары праймеров показали аналогичные уровни чувствительности в усилении Zika вирусного генома из инфицированных клеток (рисунок 4). В качестве отрицательного контроля, вируса гепатита С-специфичные праймеры были также протестированы 17. Значительное инкрлегкость в содержании вирусного генома ZIKV наблюдалась между 48 и 96 ч время точек как в низкой и высокой MOI инфицированных клеток, что указывает на надежную вирусную инфекцию (рисунок 4). Во время репликации генома флавивирусов, двухцепочечной (DS) РНК replicatory промежуточные образуются путем образования спаривания оснований между чувством и антисмысловой геномной РНК. Зонд антитело специфически для распознавания дсРНК обнаружены вирусные инфицированные клетки (Рисунок 4). Вирусный дсРНК были локализованы в цитоплазме предлагая отделения репликации генома. Иммуноцитохимическая окрашивание показало расширение инфицированных вирусом клеток в течение 48 и 96 ч время очков.

Используя систему инфекционного вируса Зика культуры, небольшая библиотека цитокинов подвергали скринингу для определения противовирусной активности (рисунок 5). Клетки предварительно обрабатывали различными цитокинами в течение 12 ч, а затем инфицируют вирусом Зика. Тип I я nterferon, ИФН-α, оказала сильное противовирусную активность в отношении вируса Зика в широком диапазоне испытанных доз [10 международных единиц (МЕ), 100 МЕ и 1000 МЕ]. ИФН-β продемонстрировали сильное ингибирующее действие, а также. Тип II IFN-γ также продемонстрировали анти-Zika вирусной активности. Цитокины TNF-α, IL-1 и IL-6, не ингибирует ZIKV при указанных концентрациях препарата.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Общая схема производства вируса Зика и анализа рабочего процесса Для производства вируса, ZIKV высевают на клетки Vero в Т-160 колбах для культуры ткани. На 48 или 96 HPI, бесклеточного вируса супернатант собирают и хранят при -80 ° C для нисходящего анализа. Титр Вирус измеряется с помощью предельного анализа разбавления. Вирус инокулята Зика впоследствии используется для изучения кинетики репликации вируса и скрининга лекарственных соединений.HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: Налет анализ для измерения производства вируса Зика Наивные клетки Vero были использованы для измерения титра вируса. Яркие изображения поля изображают плотность вирусных бляшек при различных разведениях (Шкала бар = 50 мкм). Примечание: 1:. Разбавление изображение 100 показывает различные бляшки , которые могут быть точно подсчитанные Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Анализы для оценки репликации вируса Зика. (A) График показывает вируса Зика геномную содержание было определено с помощью RT-КПЦР. И пан-генотип (ZIKV GEN) и PRVABC59-штамм (ZIKV UNI) праймеры показали одинаковую чувствительность и специфичность. Как и следовало ожидать, гепатит С (HCV вирусные) праймеры не усилить какой-либо продукт. (B) График представляет вирусные кинетики роста Зика на указанные моменты времени в низких и высоких титрах инфицированных клеток по сравнению с неинфицированных макете контроля. Средние значения и стандартные отклонения приведены. (С) анализ Иммуноцитохимическая для исследования вирусной репликации. Вирус Зика Инфицированные клетки специфически окрашивали дсРНК антителом. На 48 HPI, инфицированные клетки находятся в нескольких кластерах, в то время как при 96 HPI большинство клеток инфицированы. Hoechst краситель используется для визуализации ядер (масштаб бар = 50 мкм). BF:. Светлое поле изображения Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,

Рисунок 5
Рисунок 5:. Интерфероны демонстрируют сильное анти-Zika вирусную активность (А) График , показывающий модулирование Зика вирусного роста с помощью различных цитокинов по сравнению с контрольным носителем. Средние значения и стандартное отклонение показано на гистограмме. Интерфероны показали статистически значимое подавление репликации вируса Зика (значение р <0,05). и С) фазового контраста изображения Zika инфицированных вирусом клеток с лечением или без цитокина. Вирусные бляшки, образованные инфицированными клетками можно рассматривать как фокусы. Обратите внимание, что интерферон-обработанных скважин не имеют вирусные бл шки. Тестовая модель управления без ZIKV инфекции включены в качестве отрицательного контроля. (Шкала бар = 50 мкм) Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра большеговерсия этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь, обтекаемый протокол для культивирования вируса Зика в пробирке представлена. Критические шаги в том числе, определение оптимальных конечных точек для расширения вирусной культуры, измерения титра, и количественной оценки репликации генома были предоставлены. Вирус Зика является патогеном человека, поэтому, при обращении с инфекционными агентами, биологической безопасности процедуры должны быть строго соблюдены. Клеточная линия почек обезьяны, Веро, использовали для демонстрации различных вирусологических анализов. Zika кинетика репликации вируса может отличаться в клетках различных тканей и видов. Дополнительные клеточные линии могут быть использованы , как описано выше 15. Вирус Зика был выделен из тканей мозга зараженных плодах 3 , и было показано , чтобы инфицировать корковые нервные клетки 14 - предшественников. Таким образом, оценка патофизиологии ZIKV инфекции в нервных клетках может обеспечить дополнительные клеточные специфические идеи. Различия в нейровирулентных фенотипа африканских и азиатских генотипов могут быть исследованыс помощью этой системы инфекционной культуры. Вирусная процедура производства , описанный здесь также будет полезен для создания вируса высокого титра по отношению к патогенным исследований в естественных условиях в приматах или модельных системах с грызунами нечеловеческих.

В то время как данное исследование ограничивается использованием клеток Vero, с высоким титром производства клеточных линий человека и происхождения от комаров может быть протестирована. Во время вирусного производства, если наблюдается ЦПЭ только 10-30% клеток, на 3-й день, инфицированные клетки могут быть разделены на 1: 4 плотности и культивированием может быть продолжено в течение дополнительных 4-5 дней. В конце 7 - й день, полный CPE можно наблюдать.

Эффективность ZIKV пан-генотипа и деформационных специфических праймеров были сопоставлены и определили, что оба они чувствительны в количественной оценке Zika вирусного генома в странах с низким и высоким титром инфицированных вирусом клеток. Кроме того, в этом исследовании, тестовое сообщение на основе антител проверяется, чтобы идентифицировать инфицированные клетки. Эта дцРНК-специфическое антитело успешно RECOgnized цитоплазматические вирусные геномы в инфицированных вирусом клетках Зика. Эти оптимизированные реагенты будут полезным ресурсом рассекать различные стадии вирусной репликации, такие как перевод, репликации генома, сборки и вириона формообразования.

Эта система культивирования клеток в пробирке инфекционный применима к будущим исследований с использованием Zika специфичных на вирус суб-геномных репликоны и инфекционный вирус , сгенерированные из комплементарной ДНК (кДНК) клонов. Развитие Zika вирусных инфекционных кДНК-клонов ускорит функциональное исследование вирусных генов, включая NS1 и NS4B путем сочетания генетических и молекулярно-биологические методы. Создание вируса Зика помеченных флуоресцентным или люминесцентным на основе гена-репортера будет ценным инструментом в создании в дальнейшем использовать систему культивирования клеток в скрининг-тестах с высоким содержанием.

Оба типа I и II типа интерферонов продемонстрировали анти-Zika вирусной активности. ИФН-α, IFN-β и IFN-γ может быть дополнительно Э.В.aluated в клинических условиях в качестве профилактического средства, после воздействия профилактического и лечения против вирусной инфекции Зика и сопутствующих заболеваний. группы высокого риска, включая беременных женщин, положительных на наличие вируса Зика, можно лечить с помощью интерферонов в качестве первой линии лечения. Лечение интерфероном-α было показано , чтобы быть безопасным для беременных женщин 18,19.

Таким образом, инфекционный система клеточной культуры, которая может быть использована для исследования различных аспектов Зика вирусного роста описывается и описано. Протокол и реагенты, описанные здесь, являются важными ресурсами для тех, кто изучает вирус Зика и неврологического научного сообщества.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em&gt; In Vitro</em&gt; Профилактический эффект интерферонов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter