Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Vírus Zika (ZIKV) é um agente patogénico emergente que está ligada a anomalias do desenvolvimento fetal, tais como microcefalia, defeitos oculares, e comprometimento do crescimento. ZIKV é um vírus de RNA da família Flaviviridae. ZIKV é transmitido principalmente por mosquitos, mas também pode ser transmitida por maternal à transmissão vertical fetal, bem como o contato sexual. Até à data, não há nenhum tratamento ou vacinas fiáveis ​​opções disponíveis para proteger as pessoas infectadas pelo vírus. O desenvolvimento de um sistema de cultura de células reprodutível, eficaz Zika vírus infeccioso é fundamental para o estudo dos mecanismos moleculares de replicação ZIKV, bem como o desenvolvimento de drogas e vacinas. A este respeito, um protocolo descrevendo um in vitro Zika sistema de cultura de mamífero com base em células de vírus para análise da produção e crescimento virai é aqui relatado. Os detalhes sobre a formação de placas de vírus Zika numa monocamada de células e ensaio de placa para medição título virai são apresentados. cinética de replicação do genoma virale intermediários replicatory de cadeia dupla do genoma de ARN são determinadas. Esta plataforma de cultura foi utilizado para a tela de encontro a uma biblioteca de um pequeno conjunto de citocinas, resultando na identificação de interferão-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ como potentes inibidores do crescimento virai Zika. Em resumo, um sistema in vitro infecciosa viral Zika cultura e vários ensaios virológicos são demonstrados neste estudo, que tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de investigação para elucidar ainda mais os mecanismos de patogénese viral e a evolução da virulência do vírus. Antiviral IFN-alpha pode ainda ser avaliada como um, profilático pós-exposição, e opção de tratamento profilático para infecções por vírus Zika em populações de alto risco, incluindo mulheres grávidas infectadas.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Virus Zika (ZIKV) é um patógeno humano importante associado à microcefalia e pobres resultados perinatais 1,4. ZIKV pertence ao conjunto de flavivírus clinicamente relevantes que podem causar defeitos neurológicos, tais como o dengue, Nilo Ocidental, e vírus da encefalite de St. Louis. O principal modo de transmissão virai é pelo vector mosquito Aedes aegypti, e, além disso, a transmissão sexual também tem sido relatada 5,6. ZIKV tornou-se um grande problema global de saúde devido à distribuição geográfica expansão do mosquito vetor e sua forte correlação com defeitos de nascimento. ZIKV foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir de um macaco rhesus sentinela na floresta Zika, Uganda e o primeiro caso humano foi relatado em 1952 7,8. Indivíduos que se tornam infectados com ZIKV apresentam sintomas leves, como febre, erupção cutânea, dor de cabeça, conjuntivite e dor muscular / conjunta. Mulheres grávidas infectadas podem transmitir ZIKV ao feto em desenvolvimento 1. ZInfecção IKV também tem sido associada à síndrome de Guillain-Barre, um nervo periférico desordem auto-imune desmielinização 9.

O genoma viral consiste Zika de sentido positivo, de cadeia simples molécula de RNA que é cerca de 10,8 quilobases de comprimento. A estrutura do genoma está organizado como 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, com regiões não codificantes (NCR) flanqueando uma região codificadora de proteínas 6. A única poliproteína (3419 aa) é traduzida que é co- e pós-tradução clivada em 10 peptídeos menores. Tanto o 5'NCR e estruturas de haste-laçada 3'NCR RNA desempenham um papel crítico no início do genoma viral tradução e replicação. Os componentes estruturais do genoma são compostas das proteínas da cápside, a membrana, e de envelope. As proteínas não estruturais são essenciais para a replicação do genoma.

Atualmente, estirpes virais Zika são agrupados em três genótipos principais: Oeste Africano, Leste Africano e Asiático 6,10-13. Foi proposto que a linhagem do Leste Africano espalhou para a África Ocidental e Ásia, onde mais tarde evoluiu ainda mais 12. O genótipo asiático é responsável pelos surtos atuais nas Américas. Zika vírus podem ser cultivados em ambos os mosquitos e as células de mamíferos. Fibroblastos dérmicos primários, células dendríticas imaturas, células progenitoras neuronais corticais, células Vero e são susceptíveis a infecções virais Zika 10,14,15. Ambos os tipos I e tipo II interferões têm sido mostrados para restringir o crescimento ZIKV em fibroblastos da pele 15. Os objectivos deste estudo consistem em proporcionar, um protocolo detalhado passo a passo para a produção e o ensaio de genótipo asiática ZIKA estirpe viral PRVABC59 num sistema de cultura de células de mamífero e para demonstrar a utilidade deste sistema de cultura infecciosa como uma plataforma de desenvolvimento de drogas. Este recurso tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de pesquisa viral e neurológica Zika para elucidar ainda mais imecanismos ts da patogénese viral e evolução da virulência do vírus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nota: Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1.

1. células

  1. Utilização de células Vero para a produção de vírus e Zika análise do ciclo de replicação virai.
  2. Prepare meio completo de crescimento contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 unidades / ml), e 10 mM de HEPES.
  3. Células Vero de cultura com o meio de crescimento completo especificado a 37 ° C com 5% de CO 2.

2. Zika produção de vírus

  1. Colher as células Vero a densidade celular de 80% utilizando 0,25% de tripsina em T-75 balão e contar as células.
    1. Aspirar a mídia do frasco de cultura T-75 e lavar as células com 2 ml de tampão fosfato salino (PBS).
    2. Adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina e incubação do balão a 37 ° C durante 5 min.
    3. Adicionar 8 mL de meio de crescimento contendo soro, para inactivar a tripsina. Pipeta cima e para baixo para o SUScélulas pend e transferência das células para um tubo de 15 ml.
    4. Retirar 10 ml de células e misturar com uma quantidade igual de 0,4% de azul de tripano. Coloque a mistura preparada para o slide câmara de contagem de células e obter células viáveis ​​contagens utilizando um contador de células automatizado.
  2. Semente um total de 7 milhões de células num volume de 30 ml num frasco T-160.
  3. No dia seguinte, preparar uma multiplicidade de infecção adequado (0,01 a 0,1 MOI) de Zika inoculo de vírus em um meio de cultura livre de soro de 10 ml por frasco.
  4. Remova a mídia passou a partir do balão T-160 e, em seguida, adicionar o inóculo viral preparada na hora (10 ml).
  5. Incubar os balões inoculados em 37 ° C com 5% de CO 2 durante 4-6 horas. Espalhar o inoculo pela inclinação suavemente os frascos de lado em cada hora.
  6. Após a conclusão da incubação, o inoculo substituir com meio quente suplementado com soro de crescimento (30 ml) por cada frasco. Em seguida, continuar a cultura viral para o próximo 96 horas.
  7. Verificar a progressão da eminfecção através da observação do aparecimento de placas virais na monocamada de células utilizando um microscópio de contraste de fase e captar imagens (Figura 2), conforme necessário, em 40X e 200X ampliações.

Figura 2
Figura 2:. Placas formadas por vírus Zika numa monocamada de células Vero imagens de campo claro de diversas ampliações mostram placas virais Zika a 48 hpi. Observe a presença de focos de células arredondadas sobre a monocamada. (Barra de escala = 50 mm) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Colheita sobrenadantes de cultura celular no ponto de tempo de 96 h e centrifuga-se o sobrenadante a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para remover os restos celulares.
  2. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem detritos peletizada perturbador e transferência de to tubos de 15 ml. Ultracentrifugação a 24.000 xg pode ser realizada para concentrar as partículas virais (opcionais).
  3. Armazenar os sobrenadantes de culturas virais em várias alíquotas a -80 ° C.

3. Medir Zika título do vírus por Plaque Assay

  1. Semente células Vero naive a 1 x 10 5 células por poço em 2 ml de volume, utilizando uma placa de 12 poços.
  2. No dia seguinte, 10 preparar diluições em série de sobrenadantes de culturas virais colhidas a partir do balão T-160, utilizando meios isentos de soro. Remover os meios gastos de cada poço e adicionar 400 ul de inoculo preparada em células Vero em triplicado.
  3. Incubar os frascos inoculados em 37 ° C com 5% de CO 2 durante 4-6 horas. Espalhar o inoculo, inclinando gentilmente a placa de lado em cada um de RH.
  4. No final da incubação, o inoculo substitua com meio de soro suplementado (2 ml por poço).
  5. Em 48 horas após a inoculação, a contagem de focos viral usando um contr fasemicroscópio ast. Calcular o título virai como unidades formadoras de placas (PFU) por ml. Ver Figura 3 para o ensaio de placas.
  6. Fix e manchar as células em 4% de formaldeído e solução de violeta cristal 0,1% preparadas em 20% de etanol para a visualização clara de placas.

Ensaio 4. Zika Viral Genome Replication

  1. Semente células Vero naive a 1 x 10 5 células por poço em 2 volumes ml utilizando uma placa de 12 poços. No dia seguinte, preparar inóculos virais (MOI de 0,01 e 0,1; 400 ul / poço) de baixo e elevado título usando o meio livre de soro em triplicado. Para a infecção simulada, usar a mídia livre de soro (400 ul / poço) somente.
  2. Repita os passos 3.2 a 3.4.
  3. Nos 48 e 96 pontos Tempo hora, recolher as amostras para RNA e imunocitoquímica (ICC).
    1. Para amostras de RNA colheita, remova a mídia e, em seguida, adicione 400 ml de solução de lise diretamente a cada poço e recolher os lisados.
    2. Para ICC, remova a mídia e tgalinha fixar as células por adição de 1 ml de metanol a cada cavidade e incuba-se a placa a 4 ° C durante 30 min.
    3. A partir do lisado celular, isolar o ARN total utilizando um kit de isolamento de ARN de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar o ARN utilizando um espectrofotómetro.
  4. Realizar um de dois passos de transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) para determinar o teor de genoma ZIKV a partir de ARN colhido.
    1. Para a transcrição reversa do ARN, em primeiro lugar uma mistura de reacção 13 uL de composto de 5 ug de ARN isolado, 1 ul de dNTPs (10 mM), e um hexâmero aleatório ul (250 ng) em um tubo de 0,2 ml. Incubar o tubo a 65 ° C durante 5 min e, em seguida, colocá-lo em gelo durante um minuto. Subsequentemente, adicionar 1 ul de transcriptase reversa, 4 uL de tampão de síntese 5x Strand, 1 ul de ditiotreitol 0,1 M, e 1 ul de inibidor de RNase à mistura de reacção. Incubar o tubo durante um adicional de 5 min a 25 ° C, seguido de 60 min a 50 ° C e inactivComeram a reacção por aquecimento a 70 ° C durante 15 min.
    2. Execute qPCR utilizando 1 ul do cDNA resultante com 12,5 ul de 2x corante verde super-mistura contendo DNA polimerase e 1 ml de 10 mM iniciadores individuais específicas para o vírus Zika [Zika vírus primers pan-genótipo (Por: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), vírus de genótipos Zika asiática iniciadores estirpe PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ou o vírus da hepatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), ou gene GAPDH de limpeza celular (por: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') num volume reaccional de 25 ul.
    3. Executar PCR usando a condição de execução 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 30 segundos (40 ciclos) num sistema de PCR em tempo real.
    4. Use o nível de expressão de GAPDH com base nos limites ciclo de valor (Ct) para normalizar a Zmedição genoma viral ika. Calcular o valor de delta Ct (ΔCt) de Zika genoma comparada com a de GAPDH e obter o valor 2 ΔCt. Em seguida, calcular a variação de dobragem, tendo a proporção de conteúdo normalizados genoma Zika entre as células infectadas e não infectadas em pontos de tempo indicados. Veja a Figura 4 para resultados de replicação ZIKV genoma.
  5. Realizar ICC utilizando as células de metanol fixo.
    1. Lavam-se as células fixadas três vezes com PBS 1x e bloquear com tampão de bloqueio TPI (soro de cabra a 3%, 3% BSA, 0,1% de Triton X-100 em PBS).
    2. Use monoclonal de ratinho anti-ARNcd J2 anticorpo (1 ug / ml) a uma diluição de 1: 100 em tampão de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C.
    3. Lavam-se as células com PBS 1x e adicionar anticorpo secundário de cabra anti-IgG de ratinho-594 (1 ug / ml) a uma diluição de 1: 1000 em tampão de bloqueio e incubar durante uma hora à temperatura ambiente.
    4. Lave as células com PBS 1x e mancha de núcleos usando Hoechst corante eobservar as células utilizando um microscópio de fluorescência a uma amplificação de 100X (Figura 4).

5. Triagem de citocinas Biblioteca contra infecção por vírus de Zika

  1. Semente células Vero naive a 1 x 10 5 células por poço usando uma placa de 12 poços. Uma vez que as células são ligadas (6 horas após a sementeira), adicionar cada citocina nas concentrações indicadas em duplicados biológicos (2 ml de volume / poço). Incluir veículo (PBS) de controle sozinho.
  2. Aos 12 horas pós-tratamento, execute infecção viral Zika (MOI de 0,1 em 400 ul por poço). Incluem poços de controlo negativo sem infecção (simulada).
  3. Às 4 horas após a infecção, substituir o inoculo virai com meios de citocinas tratado (2 ml). Incubar as células a 37 ° C durante 44 h adicionais.
  4. Em 48 horas após a infecção, a contagem de placas virais utilizando um microscópio de contraste de fase e adquirir imagens representativas de células infectadas a uma ampliação de 40X (Figura 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Uma estirpe viral Zika (PRVABC59; número de acesso GenBank KU501215) do genótipo asiático foi utilizado neste estudo 12. Células Vero a 80% de confluência foram utilizadas para investigar Novo infecção viral de Zika. Para a produção viral e posterior caracterização virológica, foi empregado um início passagem de vírus (P3) Zika. As placas virais foram observadas no segundo dia da infecção. Progênies virais Zika libertados a partir da célula inicialmente infectados podem espalhar para as células vizinhas, o que resulta na formação de placas visíveis na cultura de monocamada (Figura 2). O efeito citopático (CPE) de infecção virai Zika é caracterizada por alterações morfológicas, tais como descolamento e arredondamento das células, bem como a morte celular lítico.

Para a medição do título viral, o sobrenadante isento de células contendo vírus colhidos a partir de frascos T-160 foi submetido a 10-Fold série de diluição e adicionados para a monocamada de células Vero num formato de placa de 12 poços (Figura 3). O ponto de tempo 48 horas pós-inoculação foi usada como um ponto final, para evitar a contagem das placas resultantes de infecção secundária. Os poços com 30-100 placas foram escolhidas para a contagem para obter um título de preciso.

ensaio de RT-qPCR foi utilizado para estimar a replicação do genoma do vírus da Zika. Um par de iniciadores pan-genótipo específico para a região NS5 ZIKV altamente conservada foi incluído 3,16. iniciadores específicos de estirpe viral PRVABC59 Zika com base na localização genómica de iniciadores pan-genotípica (sequências de iniciadores são dadas na secção protocolo 4.4.2) também foram testados. Ambos os pares de iniciadores apresentaram níveis semelhantes de sensibilidade na amplificação genoma viral Zika partir de células infectadas (figura 4). Como um controlo negativo, os iniciadores específicos do vírus da hepatite C também foram testados 17. A incr significativafacilidade no conteúdo ZIKV genoma viral foi observada entre 48 e 96 pontos de tempo tanto em RH a baixa e alta MOI células infectadas, sugerindo uma infecção viral robusta (Figura 4). Durante a replicação do genoma flavivirus, (DS) de ARN de cadeia dupla intermediários replicatory são geradas pela formação de emparelhamento de bases entre o sentido e o ARN genómico de sentido inverso. Uma sonda de anticorpo que reconhece especificamente para ARNcd detectadas células infectadas por vírus (Figura 4). ARNcd virais foram localizadas no citoplasma, sugerindo os compartimentos de replicação do genoma. coloração imunocitoquímica revelou expansão de células infectadas por vírus durante os 48 e 96 pontos no tempo hr.

Usando o sistema de cultura de vírus infeccioso Zika, uma pequena biblioteca de citocinas foi rastreada para determinar a actividade antiviral (Figura 5). As células foram pré-tratadas com várias citoquinas durante 12 h e, em seguida, infectadas com o vírus Zika. Tipo I I nterferon, IFN-α, exibiu uma forte actividade antiviral contra o vírus Zika em uma ampla gama de doses testadas [10 unidades internacionais (UI), 100 UI e 1000 UI]. IFN-β demonstraram um efeito inibidor potente bem. Tipo II IFN- γ também demonstrou actividade anti-viral Zika. Citocinas TNF-α, IL-1 e IL-6 não inibiram ZIKV as concentrações de droga indicadas.

figura 1
Figura 1:. Esquema geral da produção de vírus Zika e fluxo de trabalho de ensaio para a produção de vírus, ZIKV é inoculada em células Vero em T-160 frascos de cultura de tecidos. Após 48 ou 96 hpi, o sobrenadante de vírus livre de células é colhido e armazenado a -80 ° C para análise a jusante. o título do vírus é medido por um ensaio de diluição limitante. O vírus inóculo Zika for posteriormente utilizado para estudar a cinética de replicação do vírus e pesquisa de compostos de drogas.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Ensaio de placa para medição da produção de vírus Zika Naive células Vero foram usados ​​para medir o título do vírus. imagens de campo claro retratam a densidade de placas virais em várias diluições (Barra de escala = 50 m). Nota: O 1:. Image diluição de 100 mostra placas distintas que podem ser contados com precisão Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Os ensaios para avaliar a replicação do vírus Zika. (A) Gráfico mostra conteúdo genômico vírus Zika medido por RT-qPCR. Ambos pan-genótipo (ZIKV GEN) e PRVABC59-strain (ZIKV UNI) primers mostrou sensibilidade e especificidade iguais. Como esperado, virais (HCV) iniciadores hepatite C não amplificar todo o produto. (B) O gráfico apresenta a cinética de crescimento viral Zika nos pontos de tempo indicados em células de baixo e elevado título infectada em comparação com a do controlo não infectado simulada. Os valores médios e desvios-padrão são dadas. (C) Ensaio Imunocitoqu�ica para investigar a replicação viral. As células infectadas por vírus Zika foram coradas com anticorpo especificamente ARNcd. Aos 48 hpi, as células infectadas são em alguns aglomerados, enquanto que a 96 hpi a maioria das células estão infectadas. Hoechst mancha foi utilizado para a visualização de núcleos (Barra de escala = 50 uM). BF:. Imagem Campo brilhante Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. Os interferões demonstrar uma potente actividade anti virai-Zika (A) Gráfico mostrando o crescimento virai de modulação Zika por várias citocinas em comparação com a do controlo do veículo. Os valores médios e desvios padrão são apresentados no gráfico de barras. Os interferões demonstraram inibição estatisticamente significativa da replicação do vírus Zika (valor de p <0,05). (B e C), imagens de contraste de fase de Zika células infectadas com vírus, com ou sem tratamento com citocina. As placas virais formadas por células infectadas podem ser vistos como focos. Note-se que os poços tratados com interferão não tem placas virais. controle Mock sem infecção ZIKV incluído como controle negativo. (Barra de escala = 50 mm) Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aqui, um protocolo simplificado para a cultura de vírus Zika in vitro é apresentado. As etapas críticas incluindo, identificando pontos finais óptimas para a expansão da cultura de vírus, medindo título, e quantificar a replicação do genoma foram fornecidos. vírus Zika é um patógeno humano, por isso, enquanto manuseamento de agentes infecciosos, procedimentos de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas. Uma linha de células de rim de macaco, Vero, foi usado para demonstrar vários ensaios virológicos. cinética de replicação viral Zika pode ser diferente em células de vários tecidos e espécies. Linhas celulares adicionais podem ser utilizados como descrito anteriormente 15. Zika vírus foi isolado a partir de tecidos do cérebro de fetos infectados 3 e foi mostrada para infectar as células progenitoras neuronais corticais 14. Assim, a avaliação da patofisiologia da infecção ZIKV em células neuronais pode fornecer informações específicas de células adicionais. As diferenças no fenótipo neurovirulento de genótipos asiáticos Africano e podem ser investigadasusando este sistema de cultura infecciosa. O processo de produção virai aqui descrito também será útil para a geração de vírus de título elevado no sentido de estudos in vivo em primatas patogénicos em sistemas de modelo de roedor ou não-humanos.

Embora, neste estudo é limitado ao uso de células Vero, de título elevado produzir linhas celulares de origem humana e pode ser de mosquito testadas. Durante a produção virai, se CPE é observada em apenas 10-30% de células no dia 3, as células infectadas pode ser dividida em 1: 4 e a densidade de cultura pode ser continuada durante mais 4-5 dias. No final do 7 ° dia, um CPE completo podem ser observados.

A eficiência de ZIKV pan-genótipo e iniciadores específicos de estirpe foram comparadas e determinou que tanto são sensíveis na quantificação Zika genoma viral em células infectadas pelo vírus de título elevado e baixo. Além disso, no presente estudo, uma sonda baseada em anticorpos é verificado para identificar as células infectadas. Este anticorpo específico para o ARNcd reco com sucessognized genomas virais citoplasmáticos nas células infectadas por vírus Zika. Estes reagentes otimizados vai ser um recurso útil para dissecar vários estágios de replicação viral, como a tradução, a replicação do genoma, montagem e morfogênese viral.

Este sistema in vitro de cultura de células infecciosas é aplicável para estudos posteriores, utilizando replicões Zika sub-genómico específicos do vírus e vírus infecciosos gerados a partir de clones de DNA complementar (cDNA). O desenvolvimento de clones de ADNc infecciosos virais Zika irá acelerar o estudo funcional de genes virais, incluindo NS1, NS4B e através da combinação de técnicas biológicas moleculares e genéticas. Criação de vírus Zika marcados com um gene repórter fluorescente ou luminescente baseada seria uma valiosa ferramenta na tomada ainda usar o sistema de cultura de células em ensaios de rastreio de alto conteúdo.

Ambos tipo I e tipo II IFNs demonstrou atividade viral anti-Zika. IFN-α, IFN-β e IFN-γ pode ser ainda mais evaluated em ambientes clínicos como um profilático pós-exposição profilaxia e tratamento contra a infecção pelo vírus Zika e doenças associadas. Os grupos de alto risco, incluindo mulheres grávidas positivas para o vírus Zika, pode ser tratada com interferons como uma primeira linha de tratamento. O tratamento com interferão-α tem sido mostrado para ser seguro para mulheres grávidas 18,19.

Em resumo, um sistema de cultura de células infecciosa que pode ser utilizada para investigar vários aspectos do crescimento virai Zika é descrito e delineado. O protocolo e reagentes aqui descritos são recursos importantes para aqueles que estudam vírus Zika ea comunidade de investigação neurológica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter