Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika Virüsü (ZIKV), mikrosefali, göz kusurları, ve bozulmuş büyüme gibi fetal gelişim anomalileri bağlı ortaya çıkan bir patojendir. ZIKV Flaviviridae ailesinin bir RNA virüsüdür. ZIKV esas sivrisinekler tarafından iletilir, ama aynı zamanda fetal dikey geçiş yanı sıra cinsel temas için maternal tarafından yayılır. Bugüne kadar, virüs tarafından enfekte olanlar korumak için hiçbir güvenilir tedavi veya aşı seçenekleri vardır. tekrarlanabilir etkili Zika virüsü enfeksiyon hücre kültür sisteminin geliştirilmesi ZIKV çoğaltma gibi aşı ve ilaç geliştirme moleküler mekanizmalarının incelenmesi için kritik önem taşır. Bu bağlamda, virüs üretimi ve büyüme analizi için bir memeli hücresi bazlı in vitro Zika virüs kültür sistemi açıklayan bir protokol burada rapor edilmektedir. viral titresi ölçmek için bir hücre tek ve plak deneyi ile ilgili Zika virüsünün plakların oluşumu ile ilgili ayrıntılar sunulmaktadır. Viral genomun replikasyonu kinetiğive çift kollu bir RNA genomu replicatory ara belirlenir. Bu kültür platformu, interferon-a (IFN-α) tanımlanmasında ortaya çıkan küçük sitokin kümesinin bir kütüphanede karşı ekran için kullanılmıştır, IFN-β ve Zika viral büyüme potent inhibitörleri olarak, IFN-γ. Özetle, bir in vitro enfeksiyon Zika viral kültür sistemi ve çeşitli virolojik deneyler büyük ölçüde daha viral patogenez mekanizmaları ve viral virulans evrimini durulaştırmada araştırma toplum yararına potansiyeline sahip bu çalışmada, ortaya konmuştur. Antiviral IFN-alfa ayrıca enfekte hamile kadınlar da dahil olmak üzere yüksek riskli toplumlarda Zika virüs enfeksiyonları için profilaktik, maruziyet sonrası profilaktik ve tedavi seçeneği olarak değerlendirilebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zika Virüsü (ZIKV) mikrosefali ve kötü gebelik 1,4 çıktıları ile ilişkili önemli bir patojendir. ZIKV gibi Dengue, Batı Nil, ve St Louis ensefalit virüsleri gibi nörolojik bozukluklara neden olabilir tıbben ilgili flavivirüslerin kümesine aittir. Viral başlıca bulaşma ek olarak, cinsel iletim de 5,6 rapor edilmiştir, sivrisinek vektörü Aedes aegypti tarafından ve. ZIKV nedeniyle sivrisinek vektör genişleyen coğrafi dağılımı ve doğum kusurları ile güçlü korelasyon büyük bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir. ZIKV ilk Zika ormanda bir sentinel rhesus maymun 1947 yılında izole edilmiştir, Uganda ve ilk insan olgusu 1952 7,8 bildirildi. ateş, döküntü, baş ağrısı, konjunktivit ve kas / eklem ağrısı gibi hafif belirtileri olan mevcut ZIKV ile enfekte bireyler. Enfekte hamile kadınlar gelişmekte olan fetus 1'e ZIKV iletebilir. ZĐKV enfeksiyonu da Guillain-Barre sendromu, periferik sinir oto-immün demiyelinasyon hastalığı 9 ile bağlantılı olmuştur.

Zika viral genomun uzunluğu yaklaşık 10.8 kilobaz olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA molekülü içerir. genomun yapısı, bir protein-kodlama bölümünü eteklendiren kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCR) ile 5'NCR-Cı-prM-e-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR olarak düzenlenmiş 6. Tek bir poliprotein (3419 aa) o eş ve post-translasyonel 10 daha küçük peptidler halinde bölünmüş olan çevrilmiştir. 5'NCR ve 3'NCR RNA kök döngü yapıları Hem viral genomun çeviri ve replikasyon başlamasından kritik bir rol oynar. genomun yapısal bileşenleri kapsid, membran ve zarf proteinlerinin oluşmaktadır. yapısal olmayan proteinleri genom replikasyonu için kritik öneme sahiptir.

Şu anda, Zika viral suşları üç ana genotipler ayrılır: Batı AfrikaDoğu Afrika ve Asya 6,10-13. Bu teklif edildiğini daha sonra daha 12 gelişti Batı Afrika ve Asya'ya yayıldı Doğu Afrika soy. Asya genotip Amerika'da mevcut salgınlar sorumludur. Zika virüsü sivrisinek ve memeli hücrelerinde hem de kültürlenebilir. Primer dermal fibroblastlar, olgunlaşmamış dendritik hücreler, kortikal nöral projenitör hücreleri, Vero hücreleri, Zika viral enfeksiyona 10,14,15 duyarlıdırlar. Hem tip I ve tip II interferonlar cilt fibroblastlar 15 ZIKV büyümesini sınırlamak için gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, bir memeli hücre kültür sistemi, üretim ve Asya genotip ZIKA virüs tipi PRVABC59 deneyleri için aşamalı bir ayrıntılı protokol sağlamak ve ilaç geliştirme ortamı olarak, bu enfeksiyon kültür sisteminin kullanılmasını göstermek için vardır. Bu kaynak büyük ölçüde daha i aydınlatmak için Zika viral ve nörolojik araştırma toplum yararına potansiyeline sahipViral patogenez ve viral virulans evrimi ts mekanizmaları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: iş akışının şematik taslağı Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Hücreler

  1. Zika virüs üretimini ve viral replikasyon döngüsü analizi için Vero hücreleri kullanır.
  2. Tam,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 birim / ml), streptomisin ihtiva eden büyüme ortamı (100 birim / ml) ve 10 mM HEPES hazırlayın.
  3. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen tam büyüme ortamı ile kültür Vero hücreleri.

2. Zika Virüs Üretimi

  1. T-75 balonuna% 0.25 tripsin kullanılarak% 80 hücre yoğunluğunda Vero hücreleri hasat ve hücreleri saymak.
    1. T-75 kültür şişelerinde ortamı aspire ve 2 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkayın.
    2. % 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve 5 dakika için 37 ° C 'de balon inkübe edin.
    3. Tripsin etkisiz hale getirmek için bir büyüme ortamı içeren serum 8 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı suspend hücreler 15 ml tüp hücreleri transferi vb.
    4. hücrelerin 10 ul çıkarın ve% 0.4 tripan mavisi eşit miktarda karıştırın. hücre sayım odası slayt hazırlanan karışımı yükleyin ve otomatik kan sayım cihazının kullanıldığı sayımları canlı hücre elde.
  2. T-160 şişesi içine 30 ml hacim içinde 7.000.000 hücre toplam tohum.
  3. Ertesi gün, şişesi başına 10 ml serum serbest kültür ortamı Zika virüs inokulum (0.1 İçişleri Bakanlığı 0.01) enfeksiyon uygun bir çokluğu hazırlar.
  4. T-160 şişesi harcanan Ortamı çıkarın ve taze hazırlanmış viral inoculum (10 mi) ilave edin.
  5. 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inoküle şişeleri inkübe edin. yavaşça her saatte yan şişeleri eğerek inokulum yayıldı.
  6. İnkübasyonun tamamlanmasından sonra, her şişenin sıcak serum desteklenmiş büyüme ortamı (30 mi) ile inokulum değiştirin. Ardından bir sonraki 96 saat boyunca viral kültür devam ediyor.
  7. içinde ilerlemesini doğrulamaBir faz kontrast mikroskobu kullanarak ve 40X ve 200X büyütmede gerektiği gibi görüntüleri (Şekil 2) almak hücre tek tabaka viral plakların görünümünü gözlemleyerek Fection.

şekil 2
Şekil 2:. Çeşitli büyütme Vero hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde Zika virüs tarafından oluşturulmuş Plaklar Aydınlık alan ve görüntüler 48 HPI de Zika virüs plakları göstermektedir. tek tabaka yuvarlak hücre odakları varlığını unutmayın. (Ölçek çubuğu = 50 um) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. 96 saat zaman noktasında ve santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de süpernatan hasat hücre kültürü süpernatanları hücre debrisini uzaklaştırmak için.
  2. Dikkatle rahatsız pelet haline enkaz ve transfer t olmadan süpernatant kaldırmak15 ml tüpler o. 24.000 xg, ultra santrifüje (isteğe bağlı), viral parçacıklar konsantre gerçekleştirilebilir.
  3. -80 ° C 'de birden fazla alikotları viral kültür süpernatanlarının saklayın.

Plak Testi ile 3. Ölçme Zika Virüs Titre

  1. 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 ml hacim içinde oyuk başına 1 x 10 5 hücre Tohum naif Vero hücreleri.
  2. Ertesi gün, serumsuz ortam kullanılarak T-160 şişesi toplanan virüs kültürü yüzen maddelerinin seri seyreltil 10 kat hazırlar. Her harcanan medyayı iyi çıkarın ve üç kopya halinde Vero hücrelerinde üzerine hazırlanan inokulum 400 ul ekleyin.
  3. 37 aşılandı şişeler inkübe 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile ° C. yavaşça her bir saatte yana plaka eğerek inokulum yayıldı.
  4. İnkübasyonun sonunda, serum takviye ortamla inokulum (oyuk başına 2 mi) değiştirin.
  5. 48 saat sonrası aşılama at, bir faz Contr kullanılarak viral odağını saymakast mikroskop. ml başına plak oluşturucu birim (pfu) gibi viral titresi hesaplanır. Plak analizi için Şekil 3'e bakınız.
  6. Düzeltmek ve plakların açık bir görünüm için% 20 etanol içinde hazırlanmıştır% 4 formaldehit hücreleri ve% 0.1 kristal mor çözelti leke.

4. Zika Viral genom replikasyonu Deneyi

  1. 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 mi hacminde göz başına 1 x 10 5 hücre Tohum saf Vero hücreleri. üç kopya halinde serumsuz ortam kullanılarak, düşük ve yüksek titresi, Ertesi gün, viral inokulum (400 ul / göz, 0.01 ve 0.1 arasında MOI) hazırlanması. sahte enfeksiyon için, serumsuz ortam (400 ul / göz) kullanın.
  2. 3.4 adımları 3.2 tekrarlayın.
  3. 48 ve 96 saat zaman noktalarında, RNA ve immunositokimya (ICC) için numune toplayın.
    1. hasat RNA örnekleri için, ortamı çıkartın ve sonra lizatları iyi doğrudan her lizis çözeltisi 400 ul ekleyin ve toplamak.
    2. ICC, medya ve t kaldırmakTavuk her bir metanolün 1 mi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe plakası.
    3. hücre lizatından, üreticinin talimatlarına göre, bir RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole eder. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA sayısal olarak.
  4. Hasat RNA'dan ZIKV genom içeriğini belirlemek için, iki aşamalı bir ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) uygulayın.
    1. RNA nın ters transkripsiyonunu için, ilk olarak, 0.2 ml tüp içinde izole edilmiş RNA 5 ug, dNTP (10 mM) 1 ul, 1 ul rastgele heksamer (250 ng) içeren bir 13 ul reaksiyon karışımı ayarlayın. 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir tüp inkübe ve daha sonra bir dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, ters transkriptazın 1 ul 5x iplik sentez tamponu 4 ul 0.1 M ditiyotreitol ve 1 ul ve reaksiyon karışımı RNaz inhibitörü 1 ul ekle. 50 ° C ve inactiv 60 dakika, ardından 25 ° C'de ek 5 dakika boyunca tüp inkübe15 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtılarak reaksiyon yedi.
    2. qPCR 2x yeşil boya süper karışımı 12.5 ul içeren DNA polimeraz ve Zika virüsü [için Zika virüs pan-genotip primerler (spesifik 10 mM bireysel primerlerin 1 ul sonuçlanan cDNA 1 ul kullanarak gerçekleştirin: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virüsü Asya genotip PRVABC59 soyu primerler (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ya da hepatit C virüsü (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') için veya hücresel ev bakıcısı geni GAPDH (: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'), bir 25 ul reaksiyon hacmi içinde.
    3. çalışma durumunu 15 sn için 95 ° C, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde 30 sn (40 döngü) 60 ° C ile PCR gerçekleştirin.
    4. Z normalleştirmek için döngü eşiğe göre (Ct) değeri GAPDH ifade düzeyini kullanmakika viral genomun ölçümü. GAPDH kıyasla Zika genomunun delta Ct (ACt) değerini hesaplayın ve 2 ACt değerini elde. Daha sonra, belirtilen zaman noktalarında enfekte olan ve olmayan hücreler arasında normalize Zika genom içerik oranı alınarak kat değişimi hesaplamak. ZIKV genom çoğaltma sonuçları için bakınız Şekil 4.
  5. metanol sabit hücreler kullanılarak ICC gerçekleştirin.
    1. (PBS içinde% 0.1 Triton-X 100,% 3 keçi serumu,% 3 BSA) 1 x PBS ile sabitlenmiş hücreler üç kez yıkayın ve ICC bloke tamponu ile bloklayın.
    2. bloke edici tampon içinde 100 ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe: 1 seyreltme fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 (1 ug / ml) kullanın.
    3. 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve 1 de ikincil antikor keçi anti-fare IgG-594 (1 ug / ml) ekleyin: bloke tamponu içinde 1.000 seyreltme ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edin.
    4. Hoechst boyası kullanılarak çekirdekleri için 1x PBS ve leke hücreleri yıkayın ve100X büyütmede bir floresan mikroskop (Şekil 4) kullanarak hücrelerin gözlemleyin.

Zika virüs enfeksiyonuna karşı sitokin kütüphane tarama 5.

  1. De 12 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 1 x 10 5 hücre naif Vero hücreleri tohumu. Hücreler (6 saat Ekim sonrası) birleştirildikten sonra, biyolojik çiftleri belirtilen konsantrasyonlarda (2 ml hacim / oyuk) her bir sitokin ekleyin. Araç (PBS) tek başına kontrol içerir.
  2. 12 saat tedavi sonrası, Zika viral enfeksiyon (kuyu başına 0.1 400 ul İçişleri Bakanlığı) gerçekleştirin. enfeksiyon (sahte) olmadan negatif kontrol kuyuları yer alır.
  3. 4 saat sonrası enfeksiyon, sitokin muamele ortam (2 mi) ile, viral aşının değiştirin. Ek 44 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  4. 48 saat sonrası enfeksiyon, bir faz kontrast mikroskop kullanılarak viral plaklar sayısı ve 40X büyütmede (Şekil 5) ile enfekte hücrelerin temsili görüntüler elde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir Zika viral suşu, Asya genotip (PRVABC59 GenBank erişim numarası KU501215) Bu çalışmada 12 kullanılmıştır. % 80 birleşme Vero hücreleri de novo Zika viral enfeksiyon araştırmak için kullanıldı. Viral üretiminde ve daha sonra virolojik karakterizasyonu için, erken geçit (P3) Zika virüsü kullanılmıştır. Viral plaklar enfeksiyon ikinci gününde gözlendi. Başlangıçta enfekte olan hücre serbest Zika, viral yavrularıyla tek tabakalı kültürü (Şekil 2) görünür plakların oluşumuna neden komşu hücreler, yayılabilir. Zika viral enfeksiyonun sitopatik etki (CPE) gibi yuvarlama ve ayrılma hücrelerin hem de parçalayıcı hücre ölümü gibi morfolojik değişiklikler ile karakterizedir.

viral titresi ölçülmesi için, T-160 şişelerinde hasat virüs içeren hücresiz süpernatan 10-fol tabi tutuldu veD seri seyreltme ve 12 kuyucuklu bir plaka biçiminde Vero hücreleri tek tabaka üzerine eklenir (Şekil 3). 48 saat sonra aşılama zaman noktası, ikincil enfeksiyon kaynaklanan lekeleri sayan önlemek için bir son nokta olarak kullanılmıştır. 30-100 plaklar ile kuyu doğru titreye elde etmek saymak için seçildi.

RT-qPCR deney Zika virüsünün genomu çoğaltma tahmin etmek için kullanılmıştır. Son derece korunmuş ZIKV NS5 bölge için özel bir pan-genotip primer çifti 3,16 dahil edildi. pan-genotipik primerler genomik yere göre Zika virüs tipi PRVABC59 özgü primerler (primerlerinin sekansları protokolü bölüm 4.4.2 verilmektedir) de test edilmiştir. Primer çiftleri her iki enfekte olmuş hücrelerde (Şekil 4) Zika viral genomu amplifiye duyarlılık benzer seviyeleri göstermişlerdir. Bir negatif kontrol olarak, hepatit C virüsü özgü primerleri, 17 test edildi. Önemli bir artırımZIKV viral genomun içeriğine kolaylığı, düşük ve İB sağlam viral enfeksiyon öne hücreler enfekte yüksek (Şekil 4) her ikisi de 48 ve 96 saat zaman noktalarında arasında gözlenmiştir. Flavivirüs genom replikasyonu esnasında, çift sarmallı (ds), RNA replicatory ara anlamda ve anti-sens RNA, genomik arasındaki baz çiftleştirmesi oluşumu ile üretilir. Özel olarak tanıyan dsRNA için bir antikor probu, virüs tarafından enfekte hücreleri (Şekil 4) tespit edilmiştir. Viral dsRNA genom çoğaltma bölmeleri düşündüren sitoplazmada lokalize edildi. Immünsitokimya boyama 48 ve 96 saat zaman noktalarında sırasında virüs bulaşmış hücrelerin genişlemesini ortaya koymuştur.

Bulaşıcı Zika virüsü kültür sistemi kullanılarak, bir sitokin küçük bir kütüphane (Şekil 5) anti-viral aktivitesini belirlemek için elenmiştir. Hücreler 12 saat boyunca farklı sitokinler ile önceden muamele edilmiş ve daha sonra Zika virüsü ile enfekte edildi. Tip I IFN-α nterferon, test edilen dozlarda [10, uluslararası ünitedir (IU), 100 IU 1000 IU] geniş bir aralıkta Zika virüsüne karşı güçlü antiviral aktivite göstermiştir. IFN-β da güçlü bir inhibe edici etki göstermiştir. Tip II IFN-γ, aynı zamanda, anti-Zika viral etkinlik sergiledi. TNF-α, IL-1 ve IL-6, belirtilen ilaç konsantrasyonlarında ZIKV inhibe etmemiştir Sitokinler.

Şekil 1
Şekil 1:. Zika virüs üretimi ve deney akışı genel hatları virüs üretimi için, ZIKV T-160 doku kültürü şişelerinde Vero hücreleri üzerinde aşılanır. 48 veya 96 'de HPI, hücre içermeyen virüs süpernatan hasat ve alt analiz için -80 ° C'de saklandı. Virüs titresi sınırlayıcı seyreltme testi ile ölçülür. Zika virüsü aşı daha sonra, virüs replikasyonu kinetiği okuyan ve ilaç bileşiklerin taranması için kullanılır.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank" href> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Zika virüs üretimini ölçmek için bir plak deneyi Naif Vero hücreleri virüs titresi ölçmek için kullanılmıştır. Parlak alan görüntüleri çeşitli dilüsyonları (Ölçek çubuğu = 50 um) viral plakların yoğunluğunu betimliyor. Not: 1:. 100 seyreltme görüntü doğru sayılabilir farklı plaklar gösteren bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Zika virüs replikasyonunu değerlendirmek için deneyler. (A) Grafik RT-qPCR ile ölçülen Zika virüsü genomik içeriği gösterir. Her ikisi de pan-genotip (ZIKV GEN) ve PRVABC59-suşu (ZIKV UNI) primerleri eşit duyarlılık ve özgüllük göstermiştir. Beklendiği gibi, hepatit C viral (HCV) primerleri herhangi bir ürün büyütmemiştir. (B) Grafik enfekte yalancı kontrol ile karşılaştırıldığında, düşük ve yüksek titre enfekte olmuş hücrelerde belirtilen zaman noktalarında Zika viral büyüme kinetiklerini göstermektedir. Ortalama değerleri ve standart sapmaları yer almaktadır. Viral replikasyonu araştırmak için (C) İmmünositokimya deneyi. Zika virüs enfekte edilmiş hücreler, özellikle dsRNA antikor ile boyandı. 96 HPI hücrelerin çoğu enfekte ise 48 HPI de, enfekte olmuş hücreler, birkaç kümeler halinde bulunmaktadır. Hoechst boyası çekirdeklerinin görselleştirme (Ölçek çubuğu = 50 um) için kullanılmıştır. BF:. Aydınlık alan görüntüsü bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:. İnterferonlar güçlü bir anti-viral aktivite gösteren Zika (A) grafik, araç kontrolü ile karşılaştırıldığında çeşitli sitokinler tarafından Zika viral büyüme modülasyonu gösteren. Ortalama değerleri ve standart sapma, çubuk grafikte gösterilmiştir. İnterferonlar Zika virüs replikasyonu (p değeri <0.05) istatistiksel olarak anlamlı inhibe ettiği görülmüştür. (B ve C) veya sitokin tedavisiz Zika virüs ile enfekte olmuş hücre Faz kontrast görüntüleri. enfekte olmuş hücreler tarafından oluşturulan viral plakların odakları olarak görülebilir. interferon ile tedavi edilen kuyular viral plaklar yok unutmayın. ZIKV enfeksiyonu olmadan sahte kontrol negatif kontrol olarak dahil. (Ölçek çubuğu = 50 um) bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada, in vitro Zika virüsü kültürü için bir aerodinamik protokol sunulmuştur. Virüs kültürü genişleyen titresi ölçmek ve sağlanan genom replikasyonu ölçülmesi için en uygun uç noktalarının belirlenmesi de dahil olmak üzere kritik adımlar. Zika virüsü enfeksiyon ajanlarını işlerken, biyogüvenlik prosedürleri sıkı takip edilmelidir, bir insan patojeni, yani. Bir maymun böbrek hücre çizgisi, Vero çeşitli virolojik ölçümlerde göstermek için kullanılmıştır. Zika viral replikasyon kinetiği, çeşitli doku ve tür hücrelerde farklı olabilir. Daha önce tarif edildiği gibi, 15 ek hücre çizgileri de kullanılabilir. Zika virüsü bulaşmış fetus 3 beyin dokularından izole edilmiş ve kortikal nöral projenitör hücreleri 14 enfekte ettiği gösterilmiştir. Böylece, nöronal hücrelerde ZIKV enfeksiyonu patofizyoloji değerlendiren ek hücre spesifik bilgiler sağlayabilir. Afrika ve Asya genotiplerin Neurovirulent fenotip farklılıkları araştırılabilirBu bulaşıcı kültür sistemi kullanılarak. Burada tarif edilen viral üretim prosedürü, aynı zamanda, insan olmayan primat ya da kemirgen modeli sistemlerinde in vivo patojen çalışmalarına yönelik yüksek titresi virüs üretmek için yararlı olacaktır.

Iken, bu çalışmada Vero hücrelerinde kullanım ile sınırlıdır, ve insan sivrisinek kökenli hücre çizgileri üretmek yüksek titre test edilebilir. CPE 3. gününde hücrelerin sadece% 10-30'unda görülmektedir ise viral üretim sırasında, enfekte hücreler 1 bölünebilir: 4 yoğunluk ve kültürleme ek 4-5 gün devam edilebilir. 7. günün sonunda tam bir CPE gözlenebilir.

ZIKV pan-genotip ve suşa özel primerler etkinliği karşılaştırıldığında hem düşük hem de yüksek titresi virüs enfekte edilmiş hücrelerde Zika viral genomu miktarının hassas olduğu saptanmıştır. Bundan başka, bu çalışmada, bir antikor-bazlı prob enfekte hücreleri tanımlamak için doğrulanır. Bu dsRNA'nın özgü antikor başarıyla recoZika virüs ile enfekte olmuş hücrelerde gnized sitoplazmik viral genomların. Bu optimize edilmiş reaktifler gibi çeviri, genom replikasyonu, montaj ve viryon morfolojilerinden gibi viral replikasyon çeşitli aşamalarında incelemek için yararlı bir kaynak olacaktır.

Bu in vitro olarak enfeksiyon, hücre kültür sistemi Tamamlayıcı DNA (cDNA) klonları elde Zika virüs özel alt genomik replikonlar ve bulaşıcı virüs kullanılarak gelecek çalışmalara uygundur. Zika, viral enfeksiyon cDNA klonlarının geliştirilmesi genetik ve moleküler biyolojik teknikler birleştirerek NS1 ve NS4B'nin dahil olmak üzere viral genlerin fonksiyonel çalışma hızlandıracaktır. Bir flüoresan veya lüminesans bazlı raportör gen ile etiketlenmiş Zika virüsünün kurulması yüksek içerik tarama tahlillerinde hücre kültür sistemi kullanmak daha yapımında değerli bir araç olacaktır.

Hem tip I ve tip II IFN'ler anti Zika viral etkinlik sergiledi. IFN-α, IFN-β ve IFN-γ başka ev olabilirZika virüsü enfeksiyonu ile ilişkili hastalıklara karşı profilaktik sonrası maruz profilaktik ve tedavi klinik ortamlarda aluated. Zika virüsü için pozitif hamile kadınlar da dahil olmak üzere, yüksek risk grupları, tedavi ilk satırı olarak interferonlar ile tedavi edilebilir. İnterferon-α tedavisi hamile kadınlar 18,19 için güvenli olduğu gösterilmiştir.

Özet olarak, Zika viral büyüme çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilen bir bulaşıcı hücre kültür sistemi tarif ve özetlenmiştir. protokol ve burada açıklanan reaktifler Zika virüs ve nörolojik araştırma topluluğu incelemek isteyenler için önemli kaynaklardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter