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Immunology and Infection

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell'occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l'evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.

Introduction

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Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti 1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche 5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da una scimmia Rhesus sentinella nel bosco Zika, l'Uganda e il primo caso umano è stato segnalato nel 1952 7,8. Gli individui che si infettano con ZIKV presente con sintomi lievi come febbre, eruzioni cutanee, mal di testa, congiuntivite, dolori muscolari e / articolare. Le donne in gravidanza infettate possono trasmettere ZIKV al feto in via di sviluppo 1. ZInfezione IKV è stata anche legata alla sindrome di Guillain-Barre, un nervo periferico demielinizzazione autoimmune disturbo 9.

Il genoma virale Zika consiste in un senso positivo, molecola a singolo filamento di RNA che è di circa 10,8 chilobasi di lunghezza. La struttura del genoma è organizzato come 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, con le regioni non codificanti (NCR) che fiancheggia una regione codificante 6. Una singola poliproteico (3.419 bis) è tradotto cioè co- e post-traduzionali spaccati in 10 piccoli peptidi. Sia il 5'NCR e strutture stem-loop 3'NCR RNA svolgono un ruolo critico nella inizio della traduzione del genoma virale e la replica. I componenti strutturali del genoma sono costituiti da proteine ​​capside, membrana, e la busta. Le proteine ​​non strutturali sono fondamentali per replicazione del genoma.

Attualmente, i ceppi virali Zika sono raggruppati in tre genotipi principali: West African, Dell'Africa orientale e asiatico 6,10-13. E 'stato proposto che l'Oriente lignaggio africano diffuso in Africa occidentale e in Asia, dove poi ulteriormente evoluto 12. Il genotipo asiatico è responsabile per le epidemie in corso in America. virus Zika può essere coltivato sia in zanzare e cellule di mammifero. Fibroblasti dermici primarie, cellule dendritiche immature, cellule progenitrici neurali corticali, e le cellule Vero sono suscettibili alle infezioni virali Zika 10,14,15. Sia di tipo I e tipo II interferoni hanno dimostrato di limitare la crescita ZIKV nei fibroblasti cutanei 15. Gli obiettivi di questo studio sono quelli di fornire un graduale, protocollo dettagliato per la produzione e il saggio del genotipo asiatico ZIKA ceppo virale PRVABC59 in un sistema di coltura cellulare di mammifero e per dimostrare l'utilità di questo sistema di coltura infettiva come piattaforma di sviluppo di droga. Questa risorsa ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca virale e neurologica Zika di chiarire ulteriormente imeccanismi di patogenesi ts virale e l'evoluzione della virulenza del virus.

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Protocol

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Nota: Un profilo schematico del flusso di lavoro è presentato in Figura 1.

1. cellule

  1. Utilizzare cellule Vero per la produzione di virus Zika e l'analisi del ciclo di replicazione virale.
  2. Preparare mezzi completi crescita contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 unità / ml), e 10 mM HEPES.
  3. Cellule Vero coltura con terreno di coltura completo specificato a 37 ° C con 5% di CO 2.

2. Zika Virus Produzione

  1. Raccogliere le cellule Vero a densità cellulare 80% con 0,25% tripsina in T-75 pallone e contare le cellule.
    1. Aspirare il supporto dal pallone di coltura T-75 e sciacquare le cellule con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS).
    2. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C per 5 min.
    3. Aggiungere 8 ml di siero contenenti terreno di coltura per inattivare la tripsina. Pipettare su e giù per suscellule pend e trasferire le cellule ad una provetta da 15 ml.
    4. Rimuovere 10 ml di cellule e mescolare con la stessa quantità di 0,4% trypan blu. Caricare il mix preparato alla diapositiva camera di conteggio delle cellule e di ottenere cellule vitali conteggi si utilizza un contatore di cellule automatizzato.
  2. Seme un totale di 7 milioni di cellule in un volume di 30 ml in un pallone T-160.
  3. Il giorno successivo, preparare una molteplicità appropriata di infezione (0,01-0,1 MOI) di Zika inoculo virus in un terreno di coltura libero 10 ml di siero per bombola.
  4. Rimuovere il supporto trascorso dal pallone T-160 e quindi aggiungere l'inoculo virale appena preparato (10 ml).
  5. Incubare i flaconi inoculati nel 37 ° C con 5% di CO 2 per 4-6 ore. Stendere l'inoculo inclinando leggermente i fiaschi di traverso ad ogni ora.
  6. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzi calda siero integrato crescita (30 ml) in ciascun contenitore. Poi continuare la coltura virale per il prossimo 96 ore.
  7. Verificare la progressione infection osservando la comparsa di placche virali sul monostrato cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase e prendere immagini (Figura 2) come necessario al 40X e 200X ingrandimenti.

figura 2
Figura 2:. Placche formate da virus Zika su un monostrato di cellule Vero immagini in campo chiaro di vari ingrandimenti mostrano Zika placche virali a 48 HPI. Si noti la presenza di foci di cellule arrotondate sul monostrato. (Scala bar = 50 micron) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Harvest supernatanti di coltura cellulare al punto di tempo a 96 ore e centrifugare il surnatante a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
  2. rimuovere con attenzione il surnatante, senza detriti pellet inquietante e trasferimento to provette da 15 ml. Ultracentrifugazione a 24.000 xg può essere eseguita per concentrare le particelle virali (opzionali).
  3. Conservare i sovranatanti virali in più aliquote a -80 ° C.

3. Misurazione Zika Virus Titer dalla placca Assay

  1. Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 5 cellule per pozzetto a 2 ml di volume, con un 12-pozzetti.
  2. Il giorno seguente, preparare 10-diluizioni seriali di surnatanti virali raccolti dai pallone T-160 utilizzando supporti privo di siero. Rimuovere i supporti spesi da ciascun pozzetto e aggiungere 400 ml di inoculo preparato su cellule Vero in triplice copia.
  3. Incubare i flaconi inoculati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 4-6 ore. Stendere l'inoculo inclinando leggermente la piastra di traverso ad ogni ora.
  4. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzi di siero integrato (2 ml per pozzetto).
  5. A 48 ore post-inoculazione, contare i fuochi virale utilizzando un contr fase diMicroscopio ast. Calcolare il titolo virale come unità formando la placca (PFU) per ml. Vedi Figura 3 per il saggio di placca.
  6. Fissare e macchiare le cellule del 4% di formaldeide e la soluzione al cristalvioletto 0,1% preparate in etanolo al 20% per una chiara visualizzazione delle placche.

Assay 4. Zika virale Genome replica

  1. Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 5 cellule per pozzetto in 2 volumi ml con un 12-pozzetti. Il giorno seguente, preparare inoculi virali (MOI di 0,01 e 0,1; 400 ml / pozzetto) di basso e alto titolo utilizzando siero media liberi in triplice copia. Per l'infezione finto, utilizzare il siero media liberi (400 ml / pozzetto) solo.
  2. Ripetere i passaggi 3,2-3,4.
  3. Nei punti di tempo 48 e 96 ore, raccogliere i campioni di RNA e immunocitochimica (ICC).
    1. Per i campioni di raccolta di RNA, rimuovere il supporto e poi aggiungere 400 ml di soluzione di lisi direttamente a ciascun bene e raccogliere i lisati.
    2. Per ICC, rimuovere il supporto e tgallina fissare le cellule aggiungendo 1 ml di metanolo a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 4 ° C per 30 min.
    3. Dal lisato cellulare, isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento di RNA secondo le istruzioni del produttore. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro.
  4. Eseguire due fasi di trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) per determinare il contenuto genoma ZIKV da RNA raccolto.
    1. Per invertire trascrivere l'RNA, prima impostare un mix di reazione 13 ml composta da 5 mg di RNA isolato, 1 ml di dNTP (10 mm), e 1 ml esamero casuale (250 ng) in un tubo di 0,2 ml. Incubare la provetta a 65 ° C per 5 minuti e poi posto in ghiaccio per un minuto. Successivamente, aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa, 4 ml di tampone di sintesi 5x filone, 1 ml di 0,1 M ditiotreitolo, e 1 ml di RNasi inibitore alla miscela di reazione. Incubare la provetta per altri 5 minuti a 25 ° C, seguita da 60 minuti a 50 ° C e inactivmangiato la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 15 min.
    2. Eseguire qPCR utilizzando 1 ml di cDNA risultante con 12,5 ml di colorante verde 2x eccellente mix contenenti DNA polimerasi e 1 ml di 10 mm singoli primer specifici per il virus Zika [Zika virus pan-genotipo primer (per: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), virus Zika genotipo asiatico primer deformazione PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], o il virus dell'epatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), o cellulare GAPDH gene housekeeping (Per: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in un volume di reazione di 25 microlitri.
    3. Eseguire la PCR utilizzando la condizione di esercizio 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 30 sec (40 cicli) in un sistema PCR in tempo reale.
    4. Utilizzare livello di espressione GAPDH sulla base di soglie ciclo value (Ct) per normalizzare la Zika misura genoma virale. Calcolare il valore delta Ct (ΔCt) di Zika genoma rispetto a quello della GAPDH e ottenere il valore 2 ΔCt. Quindi, calcolare la variazione volte prendendo il rapporto tra normalizzati Zika contenuti del genoma tra le cellule infetti e non infetti in punti all'ora indicata. Si veda la Figura 4 per i risultati di replica ZIKV genoma.
  5. Eseguire ICC utilizzando le cellule metanolo fisso.
    1. Lavare le cellule fissate tre volte con PBS 1x e bloccare con ICC tampone bloccante (3% siero di capra, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS).
    2. Usa il mouse monoclonale anti-dsRNA anticorpi J2 (1 mg / ml) alla diluizione di 1: 100 in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C.
    3. Lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere anticorpo secondario di capra anti-topo IgG-594 (1 mg / ml) ad una diluizione 1: 1.000 in tampone bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
    4. Lavare le cellule con PBS 1x e colorare per i nuclei con colorante Hoechst eosservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X (Figura 4).

5. Screening citochine Biblioteca contro Zika infezione da virus

  1. Seed cellule Vero naive a 1 x 10 5 cellule per pozzetto utilizzando un 12-pozzetti. Una volta che le cellule sono fissati (6 ore post-semina), aggiungere ciascuna citochina a concentrazioni indicate in duplicati biologici (2 ml di volume / pozzetto). Includi veicolo (PBS) il controllo da solo.
  2. A 12 ore dopo il trattamento, effettuare infezione virale Zika (MOI di 0,1 a 400 ml per pozzetto). Includere pozzetti di controllo negativo senza infezione (finto).
  3. A 4 ore dopo l'infezione, sostituire l'inoculo virale con i media di citochine trattati (2 ml). Incubare le cellule a 37 ° C per ulteriori 44 ore.
  4. A 48 ore dopo l'infezione, contare le placche virali utilizzando un microscopio a contrasto di fase e di acquisire immagini rappresentative di cellule infettate a 40X di ingrandimento (Figura 5).

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Representative Results

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Un ceppo virale Zika (PRVABC59; GenBank numero di accesso KU501215) del genotipo asiatico è stato utilizzato in questo studio 12. Cellule Vero a 80% di confluenza sono stati usati per indagare de novo Zika infezione virale. Per la produzione virale e la successiva caratterizzazione virologica, un passaggio precoce del virus (P3) Zika è stato impiegato. Sono state rilevate le placche virali il secondo giorno di infezione. Zika progenie virali rilasciate dalla cellula infettata inizialmente possono diffondersi in celle vicine, che danno luogo alla formazione di placche visibili sulla coltura monostrato (Figura 2). L'effetto citopatico (CPE) di infezione virale Zika è caratterizzata da cambiamenti morfologici come l'arrotondamento e distacco delle cellule e morte cellulare litico.

Per la misurazione titolo virale, surnatante acellulare virus contenenti raccolte da T-160 palloni è stato sottoposto a 10-Fold diluizioni seriali e adattata il monostrato di cellule Vero in formato 12-pozzetti (Figura 3). Il punto di tempo di post-inoculazione 48 ore è stato utilizzato come un punto finale per evitare di contare le placche derivanti dalle infezioni secondarie. I pozzetti con 30-100 placche sono stati scelti per il conteggio per ottenere un titolo preciso.

saggio RT-qPCR è stato utilizzato per stimare la replicazione del genoma del virus Zika. Un fondo coppia di pan-genotipo specifico per la regione ZIKV NS5 altamente conservata è stato incluso 3,16. Zika ceppo virale primer specifici PRVABC59 in base alla posizione genomica di primer pan-genotipica (sequenze di primer sono riportati nella sezione del protocollo 4.4.2) sono stati testati anche. Entrambe le coppie di primer hanno mostrato livelli simili di sensibilità amplificando Zika genoma virale da cellule infettate (Figura 4). Come controllo negativo, l'epatite C primer specifici per il virus sono stati testati anche 17. Un significativo incrfacilità nel contenuto genoma virale ZIKV stata osservata tra 48 e 96 punti temporali hr sia in bassa ed alta MOI infettato cellule, suggerendo un robusto infezione virale (Figura 4). Durante Flavivirus replicazione del genoma, a doppio filamento (ds) RNA intermedi replicatory sono generati dalla formazione di base-accoppiamento tra senso e antisenso RNA genomico. Una sonda anticorpo specifico per riconoscere dsRNA rilevato cellule infettate virali (Figura 4). Viral dsRNA sono stati localizzati nel citoplasma che suggerisce i vani replicazione del genoma. Immunocitochimica colorazione rivelato espansione delle cellule infettate da virus durante i punti temporali ore 48 e 96.

Utilizzando il sistema di coltura virus infettivo Zika, una piccola libreria di citochine è stato proiettato per determinare l'attività antivirale (Figura 5). Le cellule sono state pre-trattate con varie citochine per 12 ore e poi infettati con il virus Zika. Tipo I i nterferon, IFN-α, espone una forte attività antivirale contro il virus Zika in una vasta gamma di dosaggi testati [10 unità internazionali (UI), 100 UI e 1.000 UI]. IFN-β dimostrato un potente effetto inibitorio pure. Tipo II IFN-γ ha dimostrato anche anti-Zika attività virale. Citochine TNF-α, IL-1 e IL-6 non ha inibito ZIKV alle concentrazioni farmaco indicato.

Figura 1
Figura 1:. Contorno generale di produzione di virus Zika e il flusso di lavoro di analisi per la produzione di virus, ZIKV viene inoculato su cellule Vero in T-160 fiasche di coltura tissutale. A 48 o 96 hpi, il supernatante privo di virus-cellula è raccolto e conservato a -80 ° C per l'analisi a valle. Virus titolo è misurata da un saggio di diluizione limitante. Il virus inoculo Zika viene successivamente utilizzato per studiare la cinetica replicazione del virus e lo screening di composti di droga.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Saggio di placca per la misurazione della produzione di virus Zika cellule Vero naive sono stati utilizzati per la misurazione titolo virale. immagini in campo chiaro rappresentano la densità di placche virali a varie diluizioni (scala bar = 50 micron). Nota: Il 1:. Immagine di diluizione 100 mostra placche distinte che possono essere contati con precisione prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: saggi per valutare la replicazione del virus Zika. (A) Grafico mostra virus Zika contenuto genomico misurata mediante RT-qPCR. Entrambi pan-genotipo (ZIKV GEN) e PRVABC59-ceppo (ZIKV UNI) primer hanno mostrato uguale sensibilità e specificità. Come previsto, l'epatite C virale (HCV) primer non amplificano qualsiasi prodotto. (B) Grafico presenta la cinetica di crescita virale Zika ai punti di tempo indicati nelle celle a bassa e alta titolazione infetti rispetto a quella del controllo finto non infetto. I valori medi e le deviazioni standard sono dati. (C) saggio Immunocitochimica per indagare la replicazione virale. cellule infettate da virus Zika sono stati appositamente colorate con anticorpi dsRNA. Al 48 HPI, le cellule infette sono in pochi grappoli, mentre a 96 HPI maggior parte delle cellule sono infetti. Hoechst macchia è stata utilizzata per la visualizzazione dei nuclei (Scala bar = 50 micron). BF:. Campo immagine luminosa Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Interferoni dimostrano potente attività virale anti-Zika (A) Grafico che mostra modulazione Zika crescita virale da varie citochine rispetto a quella del controllo del veicolo. I valori medi e deviazione standard sono riportati nel grafico a barre. Gli interferoni hanno dimostrato statisticamente significativa inibizione della replicazione del virus Zika (valore p <0,05). (B e C) immagini a contrasto di fase di cellule infettate da virus Zika con o senza trattamento di citochine. placche virali formate da cellule infette possono essere visti come focolai. Si noti che i pozzi interferone-trattate non hanno placche virali. Controllo Mock senza infezione ZIKV incluso come controllo negativo. (Barra di scala = 50 micron) Clicca qui per visualizzare un più grandeversione di questa figura.

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Discussion

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Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virologici. Zika cinetica di replicazione virale possono differire in cellule di vari tessuti e specie. Linee cellulari aggiuntivi possono essere utilizzati come descritto in precedenza 15. Virus Zika è stato isolato dai tessuti cerebrali di feti infetti 3 e ha dimostrato di infettare le cellule progenitrici neurali corticali 14. Così, valutando la fisiopatologia dell'infezione ZIKV in cellule neuronali può fornire ulteriori approfondimenti specifici delle cellule. Le differenze nel fenotipo neurovirulento di africani e asiatici genotipi possono essere indagatiUtilizzando questo sistema di coltura infettiva. La procedura di produzione virale qui descritta sarà anche utile per la generazione di virus ad alto titolo verso in vivo studi patogeni non umani sistemi di primati o modello di roditore.

Mentre questo studio è limitato all'utilizzo di cellule Vero, alto titolo produrre linee cellulari di origine umana e zanzare può essere testato. Durante la produzione virale, se CPE si osserva solo nel 10-30% delle cellule il giorno 3, le cellule infette possono essere suddivise in 1: 4 densità e coltura può continuare per altri 4-5 giorni. Alla fine del 7 ° giorno, un CPE completo può essere osservato.

L'efficienza di ZIKV pan-genotipo e primer specifici-deformazione sono stati confrontati e ha stabilito che entrambi sono sensibili a quantificare Zika genoma virale nelle cellule infettate dal virus a bassa e alta del titolo. Inoltre, in questo studio, una sonda a base di anticorpi è verificata per identificare le cellule infette. Questo anticorpo specifico-dsRNA reco con successognized genomi virali citoplasmatici nelle cellule infettate da virus Zika. Questi reagenti ottimizzati sarà una risorsa utile per analizzare varie fasi della replicazione virale come la traduzione, la replicazione del genoma, il montaggio e virione morfogenesi.

Questo sistema di coltura cellulare infettiva in vitro è applicabile a studi futuri che utilizzano Zika repliconi sub-genomica virus-specifici e virus infettivo generati da DNA complementare (cDNA) cloni. Sviluppo di Zika virali cloni di cDNA infettive accelererà lo studio funzionale dei geni virali, tra cui NS1, e NS4B combinando tecniche biologiche genetici e molecolari. Istituzione di virus Zika contrassegnati con un gene reporter fluorescente o luminescente base sarebbe un valido strumento per rendere più utilizzare il sistema di coltura cellulare in saggi di screening ad alto contenuto.

Sia di tipo I e tipo II IFNs dimostrato attività virale anti-Zika. IFN-α, IFN-β e IFN-γ possono essere ulteriormente evaluated in ambito clinico come profilattico, post-esposizione profilassi e il trattamento contro l'infezione da virus Zika e malattie associate. gruppi ad alto rischio, tra cui le donne in gravidanza risulta positivo al virus Zika, possono essere trattati con interferoni come prima linea di trattamento. Trattamento con interferone-α ha dimostrato di essere sicuro per le donne in gravidanza 18,19.

In sintesi, un sistema di coltura cellulare infettiva che può essere utilizzato per studiare vari aspetti della Zika crescita virale è descritto ed illustrato. Il protocollo e reagenti qui descritti sono risorse importanti per coloro che studiano il virus Zika e la comunità di ricerca neurologica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

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References

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Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni
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Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

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