Summary

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em> In vitro</em> Effet prophylactique des interférons

Published: August 23, 2016
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Summary

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Abstract

Zika Virus (ZIKV) est un pathogène émergent qui est lié à des anomalies du développement fœtal telles que la microcéphalie, des anomalies oculaires et troubles de la croissance. ZIKV est un virus à ARN de la famille des Flaviviridae. ZIKV est principalement transmis par les moustiques, mais peut aussi se propager par la mère à la transmission verticale du fœtus ainsi que le contact sexuel. À ce jour, il n'y a pas d'options de traitement ou de vaccin fiables pour protéger les personnes infectées par le virus. Le développement d'un système de culture cellulaire reproductible efficace du virus zika infectieux est essentielle pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réplication de ZIKV ainsi que le développement de médicaments et de vaccins. À cet égard, un protocole décrivant un système in vitro Zika de culture de mammifère à base de cellules pour la production virale et de la croissance virale analyse est rapporté ici. Des détails sur la formation de plaques de virus zika sur une monocouche cellulaire et un essai sur plaque pour mesurer le titre viral sont présentés. génome viral cinétique de replicationet intermédiaires replicatory double brin du génome de l'ARN sont déterminées. Cette plate-forme de culture a été utilisée pour l'écran contre une bibliothèque d'une petite série de cytokines conduisant à l'identification de l'interféron-α (IFN-α), l'IFN-β et IFN-γ en tant que puissants inhibiteurs de la croissance virale Zika. En résumé, une maladie infectieuse système in vitro Zika virale de la culture et de diverses analyses virologiques sont démontrées dans cette étude, qui a le potentiel de grandement bénéficier la communauté des chercheurs à élucider davantage les mécanismes de la pathogenèse virale et l'évolution de la virulence virale. Antiviral IFN-alpha peut en outre être évalué en tant que post-exposition prophylactique, et l'option de traitement prophylactique des infections à virus Zika dans les populations à haut risque, y compris les femmes enceintes infectées.

Introduction

Zika Virus (ZIKV) est un agent pathogène humain important associé à une microcéphalie et une mauvaise issue de la grossesse 1,4. ZIKV appartient à l'ensemble des flavivirus médicalement pertinents qui peuvent causer des troubles neurologiques tels que la dengue, virus du Nil occidental, et les virus de l'encéphalite de Saint-Louis. Le principal mode de transmission du virus est par le moustique vecteur Aedes aegypti, et, en outre, la transmission sexuelle a également été rapporté 5,6. ZIKV est devenu un problème de santé mondial majeur en raison de la répartition géographique de l'expansion du moustique vecteur et de sa forte corrélation avec des malformations congénitales. ZIKV a été isolé en 1947 à partir d' un singe rhésus sentinelle dans la forêt Zika, l' Ouganda et le premier cas humain a été rapporté en 1952 7,8. Les personnes qui sont infectées par le ZIKV présent avec des symptômes bénins tels que la fièvre, des éruptions cutanées, des maux de tête, la conjonctivite, et les muscles / douleurs articulaires. Les femmes enceintes infectées peuvent transmettre ZIKV au fœtus en développement 1. ZL' infection de IKV a également été lié à un syndrome de Guillain-Barré, un nerf périphérique démyélinisation auto-immune trouble 9.

Le génome viral est constitué d'Zika un sens positif, une molécule d'ARN simple brin qui est à environ 10,8 kilobases de longueur. La structure du génome est organisé comme 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, avec des régions non codantes (NCR) flanquant une région codant pour la protéine 6. Un polyprotéine unique (3419 aa) est traduit qui est co- et post-traductionnelle clivé en 10 petits peptides. Tant le 5'NCR et 3'NCR ARN structures tige-boucle jouent un rôle crucial dans le début de la traduction du génome viral et la réplication. Les éléments de structure du génome sont constitués par des protéines de capside, la membrane et l'enveloppe. Les protéines non structurelles sont essentielles pour la replication du génome.

Actuellement, Zika souches virales sont regroupées en trois génotypes principaux: Afrique de l'Ouest, Afrique de l' Est et d' Asie 6,10-13. Il a été proposé que la lignée Afrique de l' Est se propager à l' Afrique de l' Ouest et de l' Asie, où il est ensuite plus évolué 12. Le génotype asiatique est responsable des flambées actuelles dans les Amériques. zika virus peut être cultivé dans les deux moustiques et les cellules de mammifères. Des fibroblastes primaires dermiques, les cellules dendritiques immatures, des cellules progénitrices neurales corticales, ainsi que les cellules Vero sont sensibles à une infection virale Zika 10,14,15. À la fois de type I et de type II , interférons ont été montrés pour limiter la croissance des ZIKV dans les fibroblastes de la peau 15. Les objectifs de cette étude sont de fournir, un protocole détaillé par étapes pour la production et l'analyse du génotype asiatique ZIKA souche virale PRVABC59 dans un système de culture de cellules de mammifères et de démontrer l'utilité de ce système de culture infectieuse comme une plate-forme de développement de médicaments. Cette ressource a le potentiel de grandement bénéficier la communauté de recherche virale et neurologique Zika à élucider imécanismes ts de la pathogenèse virale et de l'évolution de la virulence virale.

Protocol

Note: Un aperçu schématique du flux de travail est présenté dans la figure 1. 1. cellules Utiliser des cellules Vero pour la production de virus zika et l'analyse du cycle de réplication virale. Préparer un milieu complet de croissance contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 unités / ml) et 10 mM de HEPES. La culture des cellules Vero avec le milieu de…

Representative Results

Une souche virale Zika (PRVABC59; numéro d'accession GenBank KU501215) du génotype asiatique a été utilisé dans cette étude 12. Cellules Vero à 80% de confluence ont été utilisés pour étudier de novo Zika infection virale. Pour la production virale et la caractérisation virologique ultérieure, un passage précoce virus (P3) Zika a été employé. Les plaques virales ont été observées sur le deuxième jour d'infection. Descendances viraux Zika l…

Discussion

Ici, un protocole simplifié pour la culture de virus Zika in vitro est présenté. Les étapes critiques notamment, l'identification des points d'extrémité optimales pour l'expansion de la culture du virus, la mesure de titre, et la quantification de la réplication du génome ont été fournies. virus Zika est un agent pathogène humain, de sorte que, lors de la manipulation d'agents infectieux, les procédures de biosécurité doivent être strictement suivies. Une lignée de cellules de re…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

References

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Cite This Article
Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

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