Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zika Virus Infektiøs Cell Culture System og doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika Virus (ZIKV) er en ny patogen, der er knyttet til føtale udviklingsmæssige abnormaliteter såsom mikrocefali, øje defekter, og nedsat vækst. ZIKV er et RNA-virus af Flaviviridae-familien. ZIKV hovedsageligt overføres af myg, men kan også spredes ved moderens til føtal vertikal transmission og seksuel kontakt. Til dato er der ingen pålidelige behandling eller vaccine muligheder for at beskytte dem, inficeret med virus. Udviklingen af ​​en reproducerbar, effektiv Zika virus infektiøs cellekultursystem er kritisk for at studere de molekylære mekanismer i ZIKV replikation samt lægemiddel og vaccineudvikling. I denne henseende er en protokol, der beskriver en pattedyr celle-baserede in vitro Zika virus kultur for viral produktion og vækst analyse rapporteret her. Nærmere oplysninger om dannelsen af ​​plaques af Zika virus på en cellemonolaget, og plaque-analyse til måling virustiter præsenteres. Viral genomreplikation kinetikog dobbeltstrengede RNA-genom replicatory mellemprodukter bestemmes. Denne kultur platform blev anvendt til screening mod et bibliotek af et lille sæt af cytokiner resulterer i identifikationen af ​​interferon-α (IFN-α), IFN-β og IFN-γ som potente inhibitorer af Zika viral vækst. Sammenfattende er en in vitro infektiøs Zika viral kultur-system og forskellige virologiske analyser påvist i denne undersøgelse, som har potentiale til at få stor gavn forskersamfundet i at belyse yderligere mekanismerne i viral patogenese og udviklingen af viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan yderligere vurderes som et profylaktisk, post-eksponering profylaktisk, og mulighed for Zika virusinfektioner i højrisikogrupper, herunder smittede gravide kvinder behandling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zika Virus (ZIKV) er en vigtig humant patogen forbundet med mikrocefali og dårlig graviditetsudfald 1,4. ZIKV hører til sættet af medicinsk relevante flavivirus, som kan forårsage neurologiske defekter såsom dengue, West Nile og St. Louis encephalitis virus. Den vigtigste form for viral transmission er ved myg vektor Aedes aegypti, og derudover har seksuel overførsel også rapporteret 5,6. ZIKV er blevet et stort globalt sundhedsproblem på grund af den voksende geografiske fordeling af myg vektor og dens stærk korrelation med fosterskader. ZIKV blev først isoleret i 1947 fra en skildvagt rhesus abe i Zika skoven, blev Uganda og det første menneske tilfælde rapporteret i 1952 7,8. Personer, der bliver smittet med ZIKV stede med milde symptomer som feber, udslæt, hovedpine, conjunctivitis, og muskel / ledsmerter. Inficerede gravide kvinder kan overføre ZIKV til det udviklende foster en. ZIKV infektion har også været forbundet med Guillain-Barre syndrom, en perifer nerve autoimmun demyelinisering disorder 9.

Den Zika virale genom består af en positiv sense, enkeltstrenget RNA-molekyle, som er ca. 10,8 kilobaser i længden. Genomet struktur er organiseret som 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med ikke-kodende områder (NCR) flankerer et protein-kodende region 6. En enkelt polyprotein (3419 aa) oversættes som er co- og posttranslationelt kløvet i 10 mindre peptider. Både 5'NCR og 3'NCR RNA stem-loop strukturer spiller en afgørende rolle i begyndelsen af ​​virale genom oversættelse og replikation. De strukturelle komponenter af genomet består af capsid, membran og kappeproteiner. De ikke-strukturelle proteiner er kritisk for genom replikation.

I øjeblikket er Zika virusstammer grupperet i tre overordnede genotyper: vestafrikanske, Østafrikanske og asiatiske 6,10-13. Det er blevet foreslået, at Østafrikanske afstamning spredt sig til Vestafrika og Asien, hvor det senere videreudviklet 12. Den asiatiske genotype er ansvarlig for de aktuelle udbrud i Amerika. Zika virus kan dyrkes i både myg og pattedyrceller. Primære dermale fibroblaster, umodne dendritiske celler, corticale neurale progenitorceller og Vero-celler er modtagelige for Zika virusinfektion 10,14,15. Både type I og type II interferoner har vist sig at begrænse ZIKV vækst i hudfibroblaster 15. Formålet med denne undersøgelse er at give en trinvis, detaljeret protokol for produktion og analysering af den asiatiske genotype Zika virusstamme PRVABC59 i et pattedyrs cellekultur-system og til at demonstrere anvendeligheden af ​​denne smittende kultur system som lægemiddeludvikling platform. Denne ressource har potentiale til stor gavn for Zika viral og neurologisk forskning samfund til yderligere at belyse its mekanismer af viral patogenese og udviklingen af ​​viral virulens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: En skematisk oversigt over arbejdsgangen er præsenteret i figur 1.

1. Celler

  1. Brug Vero-celler til Zika virusproduktion og analyse af virale replikationscyklus.
  2. Forbered komplet vækstmedium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (100 enheder / ml), streptomycin (100 enheder / ml) og 10 mM HEPES.
  3. Kultur Vero-celler med den angivne komplet vækstmedium ved 37 ° C med 5% CO2.

2. Zika Virus Production

  1. Høste Vero-celler ved 80% celledensitet anvendelse af 0,25% trypsin i T-75-kolbe og tælle cellerne.
    1. Aspireres mediet fra T-75 dyrkningskolbe og skyl cellerne med 2 ml phosphatbufret saltvand (PBS).
    2. Tilsæt 2 ml 0,25% trypsin og inkuberes kolben ved 37 ° C i 5 min.
    3. Tilsæt 8 ml serum indeholdende vækstmedium til inaktivering af trypsin. Pipette op og ned til susPend celler og overføre cellerne til et 15 ml rør.
    4. Fjern 10 pi celler og blandes med lige så stor mængde 0,4% trypanblåt. Indlæse den forberedte blanding til celletælling kammeret slide og opnå levedygtige celler under anvendelse af en automatiseret celletæller.
  2. Seed i alt 7 millioner celler i en 30 ml volumen i en T-160 kolbe.
  3. Den næste dag, forberede en passende infektionsmultiplicitet (0,01 til 0,1 MOI) på Zika virusinokulum i en 10 ml serumfrit dyrkningsmedium pr kolbe.
  4. Fjern det brugte medier fra T-160-kolbe og derefter tilføje frisk fremstillede virale inokulum (10 ml).
  5. Inkubér podede kolber i 37 ° C med 5% CO2 i 4-6 timer. Spred inokulum ved langsomt at vippe kolberne sidelæns ved hver time.
  6. Ved afslutningen af ​​inkubationen, udskift inokulum med varmt serum-suppleret vækstmedier (30 ml) for hver kolbe. Derefter fortsættes viral kultur for næste 96 timer.
  7. Kontroller progression af iinfektion ved at observere forekomsten af virale plaques på cellemonolaget under anvendelse af et fasekontrastmikroskop og tage billeder (figur 2) efter behov ved 40X og 200X forstørrelse.

Figur 2
Figur 2:. Plaques dannet af Zika virus på et monolag af Vero-celler Bright felt billeder af forskellige forstørrelser viser Zika virale plaques ved 48 hpi. Bemærk tilstedeværelsen af ​​afrundede celle foci på monolaget. (Scale bar = 50 um) Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Harvest cellekultursupernatanter ved 96 timer tidspunkt og centrifugeres supernatanten ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at fjerne cellerester.
  2. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pelleteret vragrester og overførsel to 15 ml rør. Ultracentrifugering ved 24.000 xg kan udføres for at koncentrere de virale partikler (valgfrit).
  3. Opbevar virale kultursupernatanter i flere portioner ved -80 ° C.

3. Måling Zika virustiter ved plakanalyse

  1. Seed naive Vero-celler ved 1 x 10 5 celler pr brønd i 2 ml volumen ved anvendelse af en 12-brønds plade.
  2. Den følgende dag, forberede 10-fold seriefortyndinger af virale kultursupernatanter opsamlet fra de T-160-kolbe under anvendelse af serumfrie medier. Fjern de brugte medier fra hver brønd og tilsæt 400 pi tilberedt inokulum på Vero-celler i tre eksemplarer.
  3. Inkuber de inokulerede kolber i 37 ° C med 5% CO2 i 4-6 timer. Spred inokulum ved langsomt at vippe pladen sidelæns på hver en time.
  4. Ved slutningen af ​​inkubationen, udskift inokulum med serum suppleret medie (2 ml per brønd).
  5. Ved 48 timer efter inokulation, tæller den virale foci ved anvendelse af en fase contrast mikroskop. Beregn virustiteren som plaquedannende enheder (PFU) per ml. Se figur 3 for plaque assay.
  6. Fix og plette cellerne i 4% formaldehyd og 0,1% krystalviolet løsning udarbejdet i 20% ethanol i klar visualisering af plaques.

4. Zika virusgenomet replikationsassay

  1. Seed naive Vero-celler ved 1 x 10 5 celler pr brønd i 2 ml volumener med en 12-brønds plade. Den følgende dag, forberede viral inokula (MOI på 0,01 og 0,1; 400 pl / brønd) med lav og høj titer ved anvendelse af serumfrie medier i tre eksemplarer. For mock infektion, bruge serum frie medier (400 ul / brønd) kun.
  2. Gentag trin 3,2-3,4.
  3. På 48 og 96 timers tidspunkter, indsamle prøver til RNA og immuncytokemi (ICC).
    1. For høst RNA-prøver, fjerne medierne og derefter tilføje 400 pi lysis løsning direkte til hver brønd og indsamle lysaterne.
    2. For ICC, fjern mediet og thøne fikseres cellerne ved tilsætning af 1 ml methanol til hver brønd og inkuberes pladen ved 4 ° C i 30 minutter.
    3. Fra cellelysatet, isolere det totale RNA ved anvendelse af en RNA-isolering kit ifølge producentens anvisninger. Kvantificere RNA under anvendelse af et spektrofotometer.
  4. Udfør en totrins revers transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) til bestemmelse af ZIKV genomet indhold fra høstet RNA.
    1. For at vende transskribere RNA, først oprette en 13 pi reaktionsblanding bestående af 5 ug isoleret RNA, 1 pi dNTP'er (10 mM) og 1 pi tilfældig hexamer (250 ng) i et 0,2 ml rør. Inkubér røret ved 65 ° C i 5 minutter og derefter placere den på is i ét minut. Efterfølgende tilsættes 1 pi af revers transkriptase, 4 pi 5x streng syntese puffer, 1 pi 0,1 M dithiothreitol og 1 pi RNase inhibitor til reaktionsblandingen. Inkubér røret i yderligere 5 minutter ved 25 ° C efterfulgt af 60 minutter ved 50 ° C og inactivspiste reaktionen ved opvarmning til 70 ° C i 15 min.
    2. Udfør qPCR anvendelse af 1 pi af den resulterende cDNA med 12,5 pi 2x grønt farvestof super blanding indeholdende DNA-polymerase og 1 pi 10 mM individuelle primers til Zika virus [Zika virus pan-genotypen primere (for: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virus Asian genotype PRVABC59 strain primere (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], eller hepatitis C-virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), eller cellulær housekeeping-gen GAPDH (for: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') i en 25 pi reaktionsvolumen.
    3. Udfør PCR under anvendelse kørslen betingelse 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 30 sekunder (40 cykler) i en real-time PCR-system.
    4. Brug GAPDH udtryk niveau baseret på tærsklen cyklus (Ct) værdi til at normalisere ZIKA virale genom måling. Beregn delta Ct (ACt) -værdi på Zika genomet sammenlignet med GAPDH og opnå 2 ACt-værdi. Derefter beregner gange ændring ved at tage forholdet af normaliserede Zika genom indhold mellem inficerede og ikke-inficerede celler ved angivne tidspunkter. Se figur 4 for ZIKV genomreplikation resultater.
  5. Udfør ICC hjælp af methanol fikserede celler.
    1. Vask de fikserede celler tre gange med 1x PBS og blokere med ICC blokeringsbuffer (3% gedeserum, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 i PBS).
    2. Brug monoklonalt muse-anti-dsRNA-antistof J2 (1 ug / ml) ved en fortynding på 1: 100 i blokeringspuffer og inkuberes natten over ved 4 ° C.
    3. Vask cellerne med 1 x PBS og tilføj sekundært antistof gede-anti-muse-IgG-594 (1 ug / ml) ved en 1: 1.000 fortynding i blokeringspuffer og inkuberes i en time ved stuetemperatur.
    4. Vask cellerne med 1x PBS og farves for kerner under anvendelse Hoechst farvestof ogobservere cellerne under anvendelse af et fluorescerende mikroskop ved 100X forstørrelse (figur 4).

5. Screening Cytokine Library mod Zika Virus Infektion

  1. Seed naive Vero-celler ved 1 x 10 5 celler pr brønd med en 12-brønds plade. Når cellerne er bundet (6 timer efter podning), tilføje hver cytokin ved angivne koncentrationer i biologiske dubletter (2 ml volumen / brønd). Indbefatter køretøj (PBS) alene kontrol.
  2. Ved 12 timer efter behandling, udføre Zika virusinfektion (MOI på 0,1 i 400 pi per brønd). Medtag negative kontrolbrønde uden infektion (mock).
  3. Ved 4 timer efter infektion, at erstatte den virale inokulum med cytokin behandlede medier (2 ml). Inkuber cellerne ved 37 ° C i yderligere 44 timer.
  4. Ved 48 timer efter infektion, tælle virale plaques ved hjælp et fasekontrastmikroskop og erhverve repræsentative billeder af inficerede celler ved 40X forstørrelse (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En Zika virusstamme (PRVABC59; GenBank accession nummer KU501215) af den asiatiske genotype blev anvendt i denne undersøgelse 12. Vero-celler ved 80% konfluens blev anvendt til at undersøge de novo Zika virusinfektion. For viral produktion og efterfølgende virologisk karakterisering blev en tidlig passage (P3) Zika-virus anvendt. De virale plaques blev observeret på andendagen for infektion. Zika virale afkom frigivet fra den oprindeligt inficerede celle kan sprede sig til naboceller, der resulterer i dannelsen af synlige plaque på monolagskultur (figur 2). Den cytopatiske effekt (CPE) af Zika virusinfektion er kendetegnet ved morfologiske ændringer såsom afrunding og frigørelse af celler såvel som lytisk celledød.

Til måling virale titer blev virusholdige cellefrie supernatant høstet fra T-160 kolber underkastet 10-fold seriefortynding og tilføjet på monolag af Vero-celler i en 12-brønds plade-format (figur 3). 48 timer efter podning tidspunkt blev anvendt som et slutpunkt for at undgå tælle plaques følger af sekundær infektion. Brøndene med 30-100 plaques blev valgt til optælling at opnå en nøjagtig titer.

RT-qPCR assay blev anvendt til at estimere genom replikation af Zika virus. En pan-genotype primerparret specifik for højt konserveret ZIKV NS5 regionen indgik 3,16. Zika virusstamme PRVABC59-specifikke primere baseret på den genomiske placering af pan-genotypiske primere (sekvenser af primere er angivet i protokollen afsnit 4.4.2) blev også testet. Begge primerparrene viste lignende niveauer af følsomhed i amplifikation Zika virale genom fra inficerede celler (Figur 4). Som en negativ kontrol blev hepatitis C-virus-specifikke primere også testet 17. En væsentlig incrlethed i ZIKV virale genom-indhold blev observeret mellem 48 og 96 timer tidspunkter både lav og høj MOI inficerede celler, hvilket antyder en robust virusinfektion (figur 4). Under Flavivirus genom replikation, er dobbeltstrenget (ds) RNA replicatory mellemprodukter genereret ved dannelsen af ​​baseparring mellem sense- og anti-sense-genomisk RNA. Et antistof probe specifikt til genkendelse dsRNA detekterede virusinficerede celler (figur 4). Viral dsRNA blev lokaliseret til cytoplasmaet tyder de genomreplikation rum. Immuncytokemi farvning afslørede udvidelse af virusinficerede celler i løbet af de 48 og 96 timers tidspunkter.

Brug af infektiøse Zika virus dyrkningssystem blev en lille bibliotek af cytokiner screenet for at bestemme antiviral aktivitet (figur 5). Cellerne blev forbehandlet med forskellige cytokiner i 12 timer og derefter inficeret med Zika virus. Type I I nterferon, IFN-α, udviste stærk antiviral aktivitet mod Zika-virus i en bred vifte af afprøvede doser [10 internationale enheder (IE), 100 IE og 1000 IE]. IFN-β vist en potent inhibitorisk virkning samt. Type II IFN-γ også demonstreret anti-Zika viral aktivitet. Cytokiner TNF-α, IL-1 og IL-6 inhiberede ikke ZIKV i de angivne lægemiddelkoncentrationer.

figur 1
Figur 1:. Generel oversigt over Zika virus produktion og analyse workflow For virus produktion, er ZIKV podes på Vero-celler i T-160 vævskulturkolber. Ved 48 eller 96 hpi, er den cellefrie virus supernatant høstet og opbevaret ved -80 ° C i nedstrøms analyse. Virustiter måles ved en begrænsende fortynding assay. Den Zika virusinokulum efterfølgende anvendes til undersøgelse virusreplikation kinetik og screening lægemiddelforbindelser.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Plaque assay til måling Zika virusproduktion Naive Vero celler blev anvendt til måling af virustiteren. Bright felt billeder skildrer tætheden af ​​virale plaques ved forskellige fortyndinger (Scale bar = 50 pm). Bemærk: 1:. 100 fortynding billede viser tydelige plaques, der kan præcist tælles Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Assays til evaluering Zika virusreplikation. (A) Graf viser Zika virus genomisk indhold målt ved RT-qPCR. Både pan-genotype (ZIKV GEN) og PRVABC59-stamme (ZIKV UNI) primere viste lige så stor følsomhed og specificitet. Som forventet havde hepatitis C virus (HCV) primere ikke amplificerer et produkt. (B) Graf præsenterer Zika virale vækstkinetik ved de angivne tidspunkter i lave og høje titer inficerede celler sammenlignet med den for ikke-inficerede mock kontrol. Middelværdier og standardafvigelser er angivet. (C) Immuncytokemi assay til undersøgelse af viral replikation. Zika virusinficerede celler blev specifikt farvet med dsRNA antistof. Ved 48 hpi, inficerede celler er i nogle klynger, hvorimod ved 96 hpi fleste af cellerne er inficeret. Hoechst farve blev anvendt til visualisering af kerner (Scale bar = 50 um). BF:. Bright field billede Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Interferoner demonstrere kraftig anti-Zika viral aktivitet (A) Graf, der viser modulation af Zika viral vækst ved forskellige cytokiner sammenlignet med vehikelkontrol. Middelværdier og standardafvigelser er vist i søjlediagrammet. Interferoner viste statistisk signifikant inhibering af Zika virusreplikation (p-værdi <0,05). (B og C) fasekontrast billeder af Zika virusinficerede celler med eller uden cytokin behandling. Virale plaques dannet af inficerede celler kan ses som foci. Bemærk, at interferon-behandlede brønde ikke har virale plaques. Mock kontrol uden ZIKV infektion indbefattet som negativ kontrol. (Scale bar = 50 um) Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her er en strømlinet protokol til dyrkning Zika-virus in vitro præsenteret. Kritiske trin, herunder, identificere optimale slutpunkter for at udvide virus kultur, måling titer, og kvantificere genom replikation blev leveret. Zika-virus er et humant patogen, så, mens håndtering smitstoffer, biosikkerhed procedurer der følges nøje. En abe nyre cellelinje, Vero, blev anvendt til at påvise forskellige virologiske assays. Zika viral replikation kinetik kan variere i celler af forskellige væv og arter. Yderligere cellelinier kan anvendes som tidligere 15 beskrevet. Zika virus er blevet isoleret fra hjernevæv fra inficerede fostre 3 og har vist sig at inficere corticale neurale progenitorceller 14. Således kan evaluere patofysiologien af ​​ZIKV infektion i neuronale celler tilvejebringer yderligere cellespecifikke indsigt. Forskelle i neurovirulent fænotype af afrikanske og asiatiske genotyper kan undersøgesved hjælp af dette infektiøse kultursystem. Den virale produktion, som beskrives her vil også være nyttige til frembringelse af høj-titer virus dybt in vivo patogene undersøgelser i ikke-humane primat eller gnaver modelsystemer.

Imens er denne undersøgelse begrænset til brugen af ​​Vero-celler, kan høj-titer producerende cellelinjer af humane og myg oprindelser testes. Under viral produktion, hvis CPE observeres i kun 10-30% af cellerne på dag 3, de inficerede celler kan opdeles i 1: 4 tæthed og dyrkning kan fortsættes i yderligere 4-5 dage. Ved slutningen af det 7. dag, kan en komplet CPE observeres.

Effektiviteten af ​​ZIKV pan-genotype og stamme-specifikke primere blev sammenlignet, og bestemt, at begge er følsomme i kvantificering Zika virale genom i lav og høj titer virusinficerede celler. Endvidere i denne undersøgelse, er et antistof-baseret probe bekræftet at identificere inficerede celler. Dette dsRNA-specifikt antistof succes recognized cytoplasmatiske virusgenomer i Zika virusinficerede celler. Disse optimerede reagenser vil være en nyttig ressource til at dissekere forskellige stadier af viral replikation, såsom oversættelse, genom replikation, montage og virionmorfogenese.

Dette in vitro smitsomme cellekultursystem gælder for fremtidige undersøgelser bruger Zika virus-specifikke sub-genomiske replikoner og infektiøs virus genereret fra komplementær DNA (cDNA) kloner. Udvikling af Zika virale infektiøse cDNA-kloner vil fremskynde den funktionelle undersøgelse af virale gener, herunder NS1, og NS4B ved at kombinere genetiske og molekylærbiologiske teknikker. Etablering af Zika-virus mærket med et fluorescerende eller selvlysende baseret reportergen ville være et værdifuldt redskab til at gøre yderligere brug cellekultur-system i høj indhold screening-assays.

Både type I og type II IFN'er demonstrerede anti-Zika viral aktivitet. IFN-α, IFN-β og IFN-γ kan yderligere evaluated i kliniske indstillinger som en profylaktisk, post-eksponering profylaktisk og behandling mod Zika virus infektion og associerede sygdomme. Højrisiko-grupper, herunder gravide kvinder er positive for Zika-virus, kan behandles med interferon som et første linje af behandlingen. Interferon-α behandling har vist sig at være sikkert for gravide kvinder 18,19.

Sammenfattende er en smitsom cellekultursystem, der kan anvendes til at undersøge forskellige aspekter af Zika virusvækst beskrevet og skitseret. Protokollen og reagenser, der er beskrevet her, er vigtige midler til dem, der studerer Zika-virus og den neurologiske forskningsverdenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Zika Virus Infektiøs Cell Culture System og<em&gt; In vitro</em&gt; Profylaktiske virkning af interferoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter