Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן מתעוררים מקושר ליקויים התפתחותיים בעובר כגון מיקרוצפליה, פגמי עין, וצמיחה לקויה. ZIKV הוא וירוס RNA של המשפחה Flaviviridae. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושים, אבל יכול גם להיות מופץ על ידי אימהי העברה אנכית עוברת וכן מגע מיני. נכון להיום, לא קיימות אופציות טיפול או חיסון אמין זמינות להגן על אלה שהנגיף יחדור. פיתוח מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס לשחזור, יעיל Zika הוא קריטי לחקר המנגנונים המולקולריים של שכפול ZIKV וכן פיתוח תרופות חיסון. בהקשר זה, פרוטוקול המתאר מערכת התרבות יונקים מבוססי תאים במבחנה Zika וירוס לניתוח בייצור ובצמיחה ויראלי מדווח כאן. פרטים על היווצרות הפלאק על ידי וירוס Zika על monolayer תא ורובד assay למדידת כייל הנגיף מוצגים. קינטיקה שכפול הגנום ויראליביניים replicatory הגנום RNA פעמיים תקועים נחושים. פלטפורמה תרבות זו נוצלה למסך נגד ספריה של קבוצה קטנה של ציטוקינים וכתוצאה מכך לזיהוי-α אינטרפרון (IFN-α), IFN-β ו- IFN-γ כמו מעכבים חזקים של גדילת ויראלי Zika. לסיכום, במבחנת מערכת תרבות ויראלית מדבקת Zika מבחני virological שונים הם הפגינו במחקר זה, אשר יש לו את הפוטנציאל למען קהילת המחקר מאוד הבהרה נוספת המנגנונים בפתוגנזה ויראלי ואת האבולוציה של ארסיות ויראלי. אנטי IFN-alpha ניתן להעריך עוד יותר כאמצעי מניעה מניעתי, שלאחר החשיפה, אפשרות טיפול עבור נגיף Zika באוכלוסיות בסיכון גבוה, כולל בנשים הרות שנדבקו במחלה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

וירוס הזיקה (ZIKV) הוא פתוגן אדם חשוב הקשורות מיקרוצפליה והריון עניים ותוצאות 1,4. ZIKV שייך הסט של flaviviruses רלוונטי מבחינה רפואית שיכולה לגרום למומים נוירולוגיות כגון דנגי, קדחת הנילוס המערבי, ווירוסים אנצפליטיס בסנט לואיס. המצב העיקרי של שידור ויראלי הוא על ידי וקטור היתוש Aedes aegypti, ובנוסף, העברה מינית גם דווחה 5,6. ZIKV הפך לנושא בריאות הגלובלי גדול בשל ההתפלגות הגיאוגרפית הנרחב של וקטור יתושי הקשר החזק שלה עם מומים מולדים. ZIKV בודד לראשונה בשנת 1947 מקוף רזוס הזקיף ביער Zika, אוגנדה והתיק הראשון של האדם דווחו בשנת 1952 7,8. אנשים כי להידבק ZIKV הנוכחי עם סימפטומים קלים כגון חום, פריחה, כאבי ראש, דלקת הלחמית, ושרירים / כאבי פרקים. אינפקטד נשים בהריון יכולים לשדר ZIKV לעובר המתפתח 1. Zזיהום IKV גם נקשר תסמונת גיאן-בארה, demyelination אוטואימוניות עצבים היקפיים הפרעת 9.

הגנום הויראלי Zika מורכב במובן החיובי, מולקולת רנ"א חד-גדילי שזה בערך 10.8 kilobases באורך. מבנה הגנום מאורגן כמו 5'NCR-C-PRM-E-ns1-NS2A-NS2B-ns3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, עם אזורים קידוד אי (NCR) איגוף אזור המקודדים חלבונים 6. Polyprotein יחיד (3419 אא) מתורגם כי הוא שיתוף ופוסט translationally ביקע ל -10 פפטידים קטנים. הן 5'NCR ומבני לולאת גזע 3'NCR RNA לשחק תפקיד קריטי תחילתו של תרגום הגנום נגיפי ושכפול. הרכיבים המבניים של הגנום מורכבים של קפסיד, קרום, וחלבוני מעטפה. החלבונים הלא המבניים הם קריטיים עבור שכפול הגנום.

נכון לעכשיו, זני הנגיפים Zika מקובצים לשלוש גנוטיפים עיקריים: אפריקה המערביתבמזרח, אפריקה, ואסיה 6,10-13. הוצע כי שושלת מזרח אפריקה התפשטה במערב אפריקה ואסיה, שם הוא מאוחר יותר התפתח 12. הגנוטיפ אסיה אחראי ההתפרצויות הנוכחיות ביבשת אמריקה. וירוס הזיקה יכול להיות מתורבת בשני יתושים בתאי יונקים. פיברובלסטים עורי ראשיים, תאים דנדריטים בשלים, ובתאים עצביים בקליפת המוח, ותאי Vero חשופים לסכנת הדבקה ויראלית Zika 10,14,15. סוג I וסוג שני II אינטרפרונים הוכחו להגביל את שיעור הגידול ZIKV ב fibroblasts העור 15. המטרות של מחקר זה הן לספק פרוטוקול צעד חכם, מפורט לייצור assaying של PRVABC59 זן ויראלי Zika גנוטיפ אסיאתית מערכת תרבית תאים יונקת וכדי להדגים את התועלת של מערכת התרבות זיהומיות זו כפלטפורמה לפיתוח תרופות. משאב זה הוא בעל פוטנציאל תועלת רב קהילת המחקר ויראלי ונוירולוגיות Zika להבהיר עוד iמנגנוני ts של בפתוגנזה ואבולוציה ויראלי של ארסיות ויראלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: מתאר סכמטי של זרימת העבודה מוצג באיור 1.

1. תאים

  1. השתמש בתאי Vero לייצור וירוס זיקה וניתוח של מחזור שכפול נגיפי.
  2. הכן התקשורת צמיחה מלאה המכילה 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 יחידות / מ"ל), ו -10 מ"מ HEPES.
  3. תרבות תאי Vero עם מדיום הגידול להשלים שצוין על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.

2. הפקת וירוס Zika

  1. קציר תאי Vero ב 80% צפיפות תאים באמצעות טריפסין 0.25% ב בקבוק T-75 לספור את התאים.
    1. לשאוב התקשורת מהבקבוק תרבות T-75 ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל בופר פוספט (PBS).
    2. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25% ו דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסף 8 מ"ל של סרום המכיל מדיום הגידול כדי להשבית טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי susתאים pend ולהעביר את התאים צינור 15 מ"ל.
    4. הסר 10 μl של תאים ומערבבים עם כמות שווה של כחול 0.4% trypan. טען את התערובת המוכנה השקופית הקאמרית ספירת תאים ולקבל תא קיימא ספירה באמצעות דלפק תא אוטומטי.
  2. זרעים סך של 7 מיליון תאים בנפח 30 מ"ל לתוך בקבוק T-160.
  3. למחרת, להכין ריבוי המתאים של זיהום (0.01 כדי 0.1 משרד הפנים) של הבידוד וירוס Zika בתוך התקשורת והתרבות חינם 10 מ"ל סרום לכל בקבוק.
  4. הסר את המדיה בילה מהבקבוק T-160 ולאחר מכן להוסיף את הבידוד ויראלי מוכן טרי (10 מ"ל).
  5. דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית צלוחיות בעדינות הצידה בכל שעה.
  6. בסיום הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת צמיחת סרום בתוספת חמה (30 מיליליטר) עבור כל בקבוק. ואז להמשיך את התרבות הנגיף למשך 96 שעות הקרובות.
  7. בדוק את ההתקדמות בfection על ידי התבוננות במראה של רובד נגיפי על monolayer התא באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולקחת תמונות (איור 2) על פי הצורך בהגדלה 40X ו 200X.

איור 2
איור 2:. הפלאק נוצר על ידי וירוס Zika על monolayer של תאי Vero תמונות שדה מוארות של בהגדלה שונה מראות רובד נגיפי זיקה ב -48 HPI. הערת הנוכחות של מוקדי תאים מעוגלים על monolayer. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. supernatants תרבית תאים קציר בנקודת 96 שעות זמן בצנטריפוגה supernatant XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא.
  2. מוציאים בזהירות את supernatant מבלי פסולת pelleted מטריד והעברת to 15 מ"ל צינורות. Ultracentrifugation ב 24,000 XG יכול להתבצע להתרכז חלקיקים נגיפיים (אופציונלי).
  3. אחסן את supernatants תרבות ויראלי aliquots המרובה ב -80 מעלות צלזיוס.

3. כייל הנגיף Zika מדידת ידי assay פלאק

  1. זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 מ"ל נפח באמצעות צלחת 12-היטב.
  2. למחרת, להכין פי 10 דילולים סידוריים של supernatants התרבות ויראלי שנאסף מבקבוק T-160 באמצעות סרום ללא מדיה. הסר את המדיה בילתה מבאר כל ולהוסיף 400 μl של בידוד מוכן על תאי Vero בשלושה עותקים.
  3. דגירת הצלוחיות המחוסנות ב 37 ° C עם 5% CO 2 עבור 4-6 שעות. מורחים את הבידוד על ידי הטיית הצלחת בעדינות הצידה בכל שעה אחת.
  4. בסוף הדגירה, להחליף את הבידוד עם תקשורת בסרום השלים (2 מיליליטר לכל טוב).
  5. בשעה 48 שעות חיסון פוסט, לספור את מוקדי ויראלי באמצעות contr שלבמיקרוסקופ אס '. חשב את כייל הנגיף כיחידות פלאק ויוצרים (PFU) לכל מ"ל. ראה איור 3 עבור assay פלאק.
  6. תיקון ו להכתים את התאים ב 4% פורמאלדהיד פתרון סגול קריסטל 0.1% מוכנים באתנול 20% להדמיה ברורה של הפלאק.

4. Assay שכפול הגנום ויראלי Zika

  1. זרע נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל היטב 2 כרכים מ"ל באמצעות צלחת 12-היטב. למחרת, להכין inocula ויראלי (משרד הפנים של 0.01 ו -0.1; 400 μl / טוב) של כייל נמוך וגבוה באמצעות תקשורת חופשית בסרום בשלושה עותקים. עבור זיהום מדומה, השתמש תקשורת חופשית בסרום (400 μl / טוב) בלבד.
  2. חזור על השלבים 3.2 כדי 3.4.
  3. בנקודות זמן hr 48 ו -96, לאסוף דגימות עבור רנ"א immunocytochemistry (ICC).
    1. לקבלת דוגמיות RNA קציר, להסיר את המדיה ולאחר מכן להוסיף 400 μl של פתרון תמוגה ישירות היטב כל לאסוף את lysates.
    2. עבור כאל, להסיר את המדיה ואת tתרנגולת לתקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מתנול זה היטב דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. מן lysate התא, לבודד RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA לפי הוראות היצרן. לכמת את RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  4. בצע שעתוק לאחור שני שלבים PCR כמותי (RT-qPCR) כדי לקבוע את תוכן הגנום ZIKV מ- RNA שנקטפו.
    1. להיפוך לתמלל את RNA, הראשון להקים תערובת התגובה 13 μl המורכב של 5 מיקרוגרם של RNA בודד, 1 μl של dNTPs (10 מ"מ), ו 1 μl hexamer אקראי (250 ng) בצינור 0.2 מ"ל. דגירת הצינור ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן למקם אותו על קרח למשך דקה אחת. בהמשך לכך, להוסיף 1 μl של transcriptase הפוכה, 4 μl של חיץ סינתזה גדיל 5x, 1 μl של 0.1 M dithiothreitol, ו 1 μl של מעכב RNase לתערובת התגובה. דגירת הצינור עבור 5 דקות נוספות על 25 מעלות צלזיוס, ואחריו 60 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, inactivאכול את התגובה על ידי חימום עד 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    2. בצע qPCR באמצעות 1 μl של cDNA וכתוצאה מכך עם 12.5 μl של תמהיל סופר צבע ירוק 2x המכיל DNA פולימרז ו 1 μl של פריימרים הפרט 10 מ"מ ספציפיות וירוס זיקה [פריימרים גנוטיפ-פאן וירוס זיקה (עבור: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 " ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), תחל זן PRVABC59 גנוטיפ אסיה וירוס זיקה (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], או וירוס הפטיטיס C (F RTQ JFH: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; R RTQ JFH: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), או GAPDH גן משק הסלולר (עבור: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') בהיקף תגובה 25 μl.
    3. בצע PCR באמצעות התנאי בטווח 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (40 מחזורים) במערכת ה- PCR בזמן אמת.
    4. השתמש רמת הביטוי GAPDH מבוסס על סף מחזור (CT) ערך לנרמל את Zמדידת הגנום ika ויראלי. חישוב הדלתא CT (ΔCt) ערך של הגנום Zika בהשוואה לזו של GAPDH ולקבל את הערך 2 ΔCt. ואז, לחשב את השינוי לקפל על ידי לקיחת היחס בין תוכן הגנום מנורמל זיקה בין תאים נגועים נגועים בנקודות זמן מצוינות. ראה איור 4 עבור תוצאות שכפול הגנום ZIKV.
  5. בצע ICC באמצעות תאים קבוע מתנול.
    1. לשטוף את התאים קבוע שלוש פעמים עם PBS 1x ולחסום עם חיץ חסימת ICC (סרום עיזים 3%, BSA 3%, 0.1% Triton-x 100 ב PBS).
    2. השתמש חד שבטיים העכבר J2 נוגדן אנטי dsRNA (1 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה דילול של 1: 100 בחסימת חיץ דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. שוטפים את התאים עם 1x PBS ולהוסיף אנטי עכבר עז משני נוגדן IgG-594 (1 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה דילול 1: 1,000 במאגר חסימת דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו תאים עם 1x PBS ואת הכתם עבור הגרעינים באמצעות לצבוע Hoechst ולבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלת 100X (איור 4).

5. הקרנת הספרייה ציטוקין מפני הידבקות בווירוסים Zika

  1. זרעים נאיבי תאים Vero ב 1 x 10 5 תאים לכל גם באמצעות צלחת 12-היטב. ברגע שהתאים מצורפים (6 שעות שלאחר זריעה), להוסיף כל ציטוקינים בריכוזים מצוינים כפילויות ביולוגיות (2 מיליליטר נפח / טוב). כלול רכב (PBS) בקר לבד.
  2. לאחר 12 שעות לאחר הטיפול, לבצע זיהום ויראלי זיקה (משרד הפנים של 0.1 ב 400 μl לכל היטב). כלול בארות בקרה שלילית ללא זיהום (מדומה).
  3. ב 4 שעות לאחר הפגיעה, להחליף את הבידוד ויראלי עם התקשורת התייחסו ציטוקינים (2 מ"ל). דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות נוספות.
  4. בשעה 48 לאחר הפגיעה hr, לספור רובד נגיפי באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב ולרכוש תמונות נציג של תאים נגועים ב 40X ההגדלה (איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זן ויראלי זיקה (PRVABC59; KU501215 מספר ההצטרפות GenBank) של גנוטיפ אסיה נוצל במחקר זה 12. תאים Vero ב 80% confluency שימשו חוקרת דה נובו זיהום ויראלי Zika. לייצור ויראלי ואפיון Virological עוקב אחד פרקים מוקדמים (P3) וירוס Zika הועסק. הפלאק ויראלי נצפה ביום השני של זיהום. Progenies ויראלי Zika שוחרר מהתא נגוע בתחילה יכול להתפשט תאים שכנים, אשר לגרום להיווצרות פלאק גלוי על תרבות בשכבה (איור 2). השפעת cytopathic (CPE) של זיהום ויראלי Zika מאופיין שינויים מורפולוגיים כגון עיגול וניתוק של תאים, כמו גם מוות תאי ממס.

למדידת כייל הנגיף, supernatant ללא התא המכיל וירוס שנקטפו מן צלוחיות T-160 היה נתון של 10 folדילול סדרתי ד והוסיף על monolayer של תאים Vero במתכונת צלחת 12-היטב (איור 3). נקודת הזמן 48 שעות לאחר חיסון שימש נקודת הסיום כדי להימנע מספירת הפלאק הנובעים זיהום משני. הבארות עם 30-100 הפלאק נבחרו לספירה להשיג כייל מדויק.

assay RT-qPCR נוצל כדי להעריך את שכפול הגנום של הנגיף Zika. זוג פריימר הפאן-גנוטיפ ספציפי לאזור השמור ביותר ZIKV NS5 נכלל 3,16. פריימרים PRVABC59 ספציפי זן ויראלי Zika המבוסס על מיקומו הגנומי של פריימרים הפאן-גנוטיפ (רצפים של פריימרים ניתנים באזור פרוטוקול 4.4.2) נבדקו גם. שני זוגות פריימר הראו רמות דומות של רגישות הגברת הגנום נגיפי זיקה בין תאים נגועים (איור 4). כביקורת שלילית, פריימרים וירוס ספציפי הפטיטיס C נבחנו גם 17. אינקר משמעותילהקל בתוכן הגנום הנגיפי ZIKV נצפתה בין 48 ו -96 נקודות hr זמן הן התאים נמוך וגבוה משרד הפנים נגוע, דבר המצביע על זיהום ויראלי חזקים (איור 4). במהלך שכפול הגנום Flavivirus, פעמים תקועות (ds) RNA ביניים replicatory נוצרים כתוצאה מהיווצרותם של זיווג בסיס בין תחושה ו- RNA הגנומי אנטי תחושה. תחקיר נוגדן במיוחד עבור dsRNA הכרה זוהה תאים נגועים ויראלי (איור 4). dsRNA הנגיפי היו נקודות אל הציטופלסמה דבר המצביע על תאי שכפול הגנום. מכתים Immunocytochemistry גילה הרחבת תאים נגועים בנגיף במהלך 48 ו -96 נקודות hr הזמן.

באמצעות מערכת התרבות הנגיף מדבק Zika, ספרייה קטנה של ציטוקינים הוקרן לקבוע פעילות אנטי (איור 5). התאים היו טרום שטופלו ציטוקינים שונים במשך 12 שעות ולאחר מכן נגוע בווירוס Zika. אני הייתי סוג nterferon, IFN-α, הציג פעילות אנטי חזק נגד וירוס Zika במגוון רחב של המינונים שנבדקו [10 יחידות בינלאומיות (IU), 100 IU ו -1,000 IU]. IFN-β הפגין השפעה מעכבת חזקה גם כן. השנייה IFN-γ סוג הדגים גם פעילות ויראלית ואנטי-זיקה. ציטוקינים-α TNF, IL-1 ו- IL-6 לא לעכב ZIKV על ריכוזי התרופה המצוין.

איור 1
איור 1:. מתווה כללי של ייצור וירוס Zika ועל העבודה assay עבור ייצור וירוס, ZIKV הוא מחוסן על תאים Vero צלוחיות בתרבית רקמה T-160. בשעה 48 או 96 HPI, supernatant וירוס תא ללא נאסף המאוחסן ב -80 ° C לניתוח במורד הזרם. כייל הנגיף נמדדת על ידי assay דילול מגביל. בידוד וירוס Zika הוא לאחר מכן נעשה שימוש ללימוד קינטיקה שכפול נגיף וסינון תרכובות תרופה.יעד href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. Assay פלאק למדידת הייצור וירוס Zika תאים Vero נאיבי שימשו למדידת כייל הנגיף. תמונות שדה מוארות לתאר את הצפיפות של רובד נגיפי ב דילולים שונים (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). הערה: 1:. תמונת הדילול 100 תערוכות הפלאק ברורה כי ניתן לספור במדויק אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מבחנים להערכת שכפול נגיף Zika. (א) גרף המציג תוכן גנומי וירוס זיקה שהיא נמדדת על ידי RT-qPCR. שני-גנוטיפ פאן (ZIKV GEN) ו-זן PRVABC59 (ZIKV UNI) פריימרים הראה רגישות וסגוליות שווה. כצפוי, הפטיטיס C ויראלי (HCV) פריימרים לא להגביר כל מוצר. (ב) גרף המציג את קינטיקה צמיחת ויראלי Zika בנקודות הזמן שצוינו תאים נגועים כיילו נמוכים וגבוהים בהשוואה לזו של השליטה מדומה הנגועה. ערכים ממוצעים וסטיות תקן מקבלים. (C) assay Immunocytochemistry לחקירת שכפול נגיפי. תאים נגועים בנגיף Zika הוכתמו במיוחד עם נוגדן dsRNA. בשעה 48 HPI, תאים נגועים נמצאים כמה אשכולות, ואילו ב 96 HPI רוב התאים נדבקים. Hoechst כתם שימש הדמיה של גרעינים (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). BF:. תמונת שדה מוארת אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5:. אינטרפרונים להפגין פעילות ויראלית ואנטי-זיקה חזקה (א) גרף המציג אפנון של צמיחה ויראלי Zika ידי ציטוקינים שונים בהשוואה לזו של שליטה ברכב. ערכים ממוצעים וסטיית תקן מוצגים בגרף הבר. אינטרפרונים הראה עיכוב משמעותי סטטיסטי של שכפול נגיף זיקה (ערך p <0.05). (B ו- C) בניגוד שלב תמונות של תאים נגועים בנגיף זיקה עם או ללא טיפול ציטוקינים. הפלאק ויראלי נוצר על ידי תאים נגועים ניתן לראות מוקדים. שים לב בארות שטופלו באינטרפרון אין רובד נגיפי. שליטה מדומה ללא זיהום ZIKV כלל שליטה שלילית. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי להציג גדולגרסה של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן, פרוטוקול יעיל עבור culturing וירוס Zika במבחנה מוצג. צעדים קריטיים כולל, זיהוי נקודות קצה אופטימלית עבור בהרחבת התרבות הנגיף, מדידת כייל, וכימות שכפול הגנום נמסרו. וירוס Zika הוא פתוגן אנושי, כל כך, תוך טיפול חומרים מזהמים, נהלי בטיחות ביולוגיים הם להיות אחריו בקפדנות. שורת תאי קוף כליות, Vero, שמשה הוכחת מבחני virological שונים. קינטיקה שכפול נגיפי זיקה עשוי להיות שונה בתאים של רקמות ומינים שונים. שורות תאים נוספות ניתן להשתמש כפי שתוארו לעיל 15. וירוס Zika כבר מבודד מרקמות המוח של עוברים נגועים 3 ו הוכח להדביק ובתאים עצביים בקליפת המוח 14. לפיכך, הערכת פתופיזיולוגיה של זיהום ZIKV בתאים עצביים יכולה לספק תובנה תא ספציפי נוספות. הבדלים הפנוטיפ neurovirulent ואפריקה גנוטיפים אסיה יכול להיחקרבאמצעות מערכת התרבות זיהומיות זו. תהליך הייצור ויראלי המתואר כאן גם יהיה שימושי להפקת וירוס גבוהה כייל לשם יציאה להשתלמות in vivo פתוגניים במערכות מודל הפרימטים לא אנושיים או מכרסמים.

אמנם, במחקר זה מוגבל השימוש של תאי Vero, גבוה כייל לייצר שורות תאים ממוצא אנושי יתוש יכול להיבדק. במהלך הייצור ויראלי, אם CPE הוא ציין רק 10-30% של תאים ביום 3, התאים הנגועים ניתן לפצל 1: 4 צפיפות culturing יכול להיות נמשך 4-5 ימים נוספים. בסוף היום ה -7, CPE המלא ניתן לצפות.

היעילות של ZIKV הפאן-גנוטיפ פריימרים ספציפי זן הושוותה וקבעה כי הן רגישות בכימותי הגנום נגיפי Zika בתאים נגוע בנגיף כייל נמוכה וגבוהה. יתר על כן, במחקר זה, תחקיר נוגדן מבוסס מאומת לזהות תאים נגועים. dsRNA ספציפי זה נוגדן בהצלחה RECOgnized הגנום הנגיפי ציטופלסמית בתאים הנגועים בנגיף Zika. ריאגנטים מותאמים אלה יהיו משאב שימושי לנתח בשלבים שונים של שכפול נגיפי כגון תרגום, שכפול הגנום, הרכבה ומורפוגנזה virion.

מערכת במבחנה זה תרבית תאי זיהומיות ישימה מחקרים עתידיים באמצעות וירוס ספציפי זיקת replicons תת-גנומי וירוס מדבק המופקת DNA משלים שיבוטים (cDNA). פיתוח שיבוטי cDNA זיהומיות ויראלי Zika יאיץ את המחקר התפקודי של גנים נגיפיים כולל ns1, ו NS4B ידי שילוב טכניקות ביולוגיות גנטיות ומולקולריות. הקמת וירוס Zika מתויג עם גן כתב מבוסס פלורסנט או הזורח תהיה כלי רב ערך בקבלה נוסף להשתמש במערכת תרבית תאי מבחני מיון גבוה תוכן.

גם אני סוג וסוג II IFNs הפגינו פעילות ויראלית ואנטי-זיקה. IFN-α, IFN-β ו- IFN-γ יכולים להיות ev נוסףaluated במסגרות קליניות כמו מניעתי מניעתי, שלאחר חשיפה, וטיפול מפני הידבקות בוירוסים Zika ומחלות הקשורות. קבוצות בסיכון גבוה, כוללים בנשים הרות חיוביות עבור וירוס Zika, יכולות להיות מטופלים עם אינטרפרונים כקו ראשון לטיפול. טיפול אינטרפרון-α הוכח להיות בטוח עבור נשים בהריון 18,19.

לסיכום, מערכת תרבית תאים זיהומיות, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של צמיחה ויראלי Zika מתואר ובקווי מתאר. פרוטוקול ריאגנטים המתואר כאן הם משאבים חשובים למי ללמוד וירוס Zika וקהילת המחקר הנוירולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter