Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em> In Vitro</em> Profylaktisk Effekt av Interferon
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) er en ny patogen som er knyttet til fosterutviklingsavvik som microcephaly, øye defekter, og svekket vekst. ZIKV er et RNA-virus i Flaviviridae familien. ZIKV er hovedsakelig overføres av mygg, men kan også spres ved maternal til foster vertikal overføring samt seksuell kontakt. Til dags dato er det ingen pålitelig behandling eller vaksine alternativer tilgjengelige for å beskytte dem som er smittet av viruset. Utviklingen av en reproduserbar, effektiv Zika virus smittsomme cellekultursystem er kritisk for å studere de molekylære mekanismene for ZIKV replikasjon, så vel som legemiddel og vaksineutvikling. I denne forbindelse er en protokoll beskriver en pattedyrcellebasert in vitro Zika virus kultursystem for virusproduksjon og vekst analyse rapportert her. Detaljer på dannelsen av plakk ved Zika virus på en celle monolag og plakk-analyse for måling av viral titer er presentert. Viral genom replikering kinetikkog dobbel-strandet RNA genom replicatory mellom bestemmes. Denne kulturen plattformen ble benyttet for å skjerm mot et bibliotek av et lite sett av cytokiner som resulterer i identifikasjonen av interferon-α (IFN-α), IFN-β og IFN-γ som potente inhibitorer av Zika viral vekst. Oppsummert er en in vitro smittsom Zika viral kultur system og ulike virologiske analyser påvist i denne studien, som har potensiale til å ha stor nytte av forskningsmiljøet i å belyse ytterligere mekanismene for viral patogenese og utviklingen av viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan videre bli vurdert som et forebyggende, etter eksponering profylaktisk og behandlingsalternativ for Zika virusinfeksjoner hos høyrisikogrupper, inkludert infiserte gravide kvinner.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) er en viktig menneskelig patogen assosiert med microcephaly og dårlig svangerskapsutfall 1,4. ZIKV tilhører settet av medisinsk relevante flaviviruses som kan forårsake nevrologiske defekter som Dengue, West Nile, og St. Louis encefalitt virus. Den viktigste modusen for viral transmisjon er av mygg vektoren Aedes aegypti, og, i tillegg har seksuell overføring også blitt rapportert 5,6. ZIKV har blitt en stor global helse problem på grunn av den voksende geografiske fordelingen av mygg vektoren og dens sterk sammenheng med misdannelser. ZIKV ble først isolert i 1947 fra en sentinel rhesus ape i Zika skogen, ble Uganda og det første mennesket saken rapportert i 1952 7,8. Personer som smittes med ZIKV stede med milde symptomer som feber, utslett, hodepine, konjunktivitt, og muskel / leddsmerter. Infiserte gravide kan overføre ZIKV til fosteret en. ZIKV infeksjon har også vært knyttet til Guillain-Barre syndrom, en perifer nerve auto-immune demyelinering uorden 9.
Den Zika virale genomet består av en positiv fornuft, enkelt-trådet RNA-molekyl som er omtrent 10,8 kilobaser i lengde. Genomet struktur er organisert som 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med ikke-kodende regioner (NCR) flankerer en proteinkodende region 6. En enkelt polyproteinet (3419 aa) er oversatt som er co-og post-translatorisk spaltet opp i 10 mindre peptider. Både 5'NCR og 3'NCR RNA stilk-loop-strukturene spille en avgjørende rolle i begynnelsen av viral genom oversettelse og replikering. De strukturelle komponenter i genomet består av kapsidet, membran, og kappeproteiner. De ikke-strukturelle proteiner som er kritiske for genomreplikasjon.
Foreløpig er Zika virusstammer gruppert i tre hoved genotyper: vestafrikanske, East African og asiatiske 6,10-13. Det er foreslått at den østafrikanske avstamning spre seg til Vest-Afrika og Asia, hvor den senere videre utviklet seg 12. Den asiatiske genotype er ansvarlig for dagens utbrudd i Amerika. Zika virus kan være dyrket i både mygg og pattedyrceller. Primære, dermale fibroblaster umodne dendrittiske celler, kortikale nevrale stamceller og Vero-celler er mottagelige for Zika virusinfeksjon 10,14,15. Både type I og type II interferoner har vist seg å begrense ZIKV vekst i huden fibroblaster 15. Formålet med denne studien er å gi en trinnvis, detaljert protokoll for produksjon og analysering av den asiatiske genotype Zika viral belastning PRVABC59 i en pattedyrcellekultur system og å demonstrere nytten av denne smittsomme kultur system som et rusmiddel utviklingsplattform. Denne ressursen har potensial til å få stor betydning for Zika viral og nevrologisk forskning samfunnet for å ytterligere belyse its mekanismer av viral patogenese og utviklingen av viral virulens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her blir et strømlinjeformet protokoll for dyrking Zika virus in vitro presentert. Kritiske trinn, blant annet, å identifisere optimale sluttpunkter for å utvide virus kultur, måle titer, og kvantifisere genom replikering ble gitt. Zika virus er en menneskelig patogen, så, mens håndtering av smittestoffer, biosikkerhet prosedyrer skal følges nøye. En ape nyrecellelinje, Vero, ble anvendt for å demonstrere forskjellige virologiske tester. Zika viral replikasjonskinetikk kan være forskjellig i celler av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
