Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Zika Virus (ZIKV) er en ny patogen som er knyttet til fosterutviklingsavvik som microcephaly, øye defekter, og svekket vekst. ZIKV er et RNA-virus i Flaviviridae familien. ZIKV er hovedsakelig overføres av mygg, men kan også spres ved maternal til foster vertikal overføring samt seksuell kontakt. Til dags dato er det ingen pålitelig behandling eller vaksine alternativer tilgjengelige for å beskytte dem som er smittet av viruset. Utviklingen av en reproduserbar, effektiv Zika virus smittsomme cellekultursystem er kritisk for å studere de molekylære mekanismene for ZIKV replikasjon, så vel som legemiddel og vaksineutvikling. I denne forbindelse er en protokoll beskriver en pattedyrcellebasert in vitro Zika virus kultursystem for virusproduksjon og vekst analyse rapportert her. Detaljer på dannelsen av plakk ved Zika virus på en celle monolag og plakk-analyse for måling av viral titer er presentert. Viral genom replikering kinetikkog dobbel-strandet RNA genom replicatory mellom bestemmes. Denne kulturen plattformen ble benyttet for å skjerm mot et bibliotek av et lite sett av cytokiner som resulterer i identifikasjonen av interferon-α (IFN-α), IFN-β og IFN-γ som potente inhibitorer av Zika viral vekst. Oppsummert er en in vitro smittsom Zika viral kultur system og ulike virologiske analyser påvist i denne studien, som har potensiale til å ha stor nytte av forskningsmiljøet i å belyse ytterligere mekanismene for viral patogenese og utviklingen av viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan videre bli vurdert som et forebyggende, etter eksponering profylaktisk og behandlingsalternativ for Zika virusinfeksjoner hos høyrisikogrupper, inkludert infiserte gravide kvinner.
Zika Virus (ZIKV) er en viktig menneskelig patogen assosiert med microcephaly og dårlig svangerskapsutfall 1,4. ZIKV tilhører settet av medisinsk relevante flaviviruses som kan forårsake nevrologiske defekter som Dengue, West Nile, og St. Louis encefalitt virus. Den viktigste modusen for viral transmisjon er av mygg vektoren Aedes aegypti, og, i tillegg har seksuell overføring også blitt rapportert 5,6. ZIKV har blitt en stor global helse problem på grunn av den voksende geografiske fordelingen av mygg vektoren og dens sterk sammenheng med misdannelser. ZIKV ble først isolert i 1947 fra en sentinel rhesus ape i Zika skogen, ble Uganda og det første mennesket saken rapportert i 1952 7,8. Personer som smittes med ZIKV stede med milde symptomer som feber, utslett, hodepine, konjunktivitt, og muskel / leddsmerter. Infiserte gravide kan overføre ZIKV til fosteret en. ZIKV infeksjon har også vært knyttet til Guillain-Barre syndrom, en perifer nerve auto-immune demyelinering uorden 9.
Den Zika virale genomet består av en positiv fornuft, enkelt-trådet RNA-molekyl som er omtrent 10,8 kilobaser i lengde. Genomet struktur er organisert som 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med ikke-kodende regioner (NCR) flankerer en proteinkodende region 6. En enkelt polyproteinet (3419 aa) er oversatt som er co-og post-translatorisk spaltet opp i 10 mindre peptider. Både 5'NCR og 3'NCR RNA stilk-loop-strukturene spille en avgjørende rolle i begynnelsen av viral genom oversettelse og replikering. De strukturelle komponenter i genomet består av kapsidet, membran, og kappeproteiner. De ikke-strukturelle proteiner som er kritiske for genomreplikasjon.
Foreløpig er Zika virusstammer gruppert i tre hoved genotyper: vestafrikanske, East African og asiatiske 6,10-13. Det er foreslått at den østafrikanske avstamning spre seg til Vest-Afrika og Asia, hvor den senere videre utviklet seg 12. Den asiatiske genotype er ansvarlig for dagens utbrudd i Amerika. Zika virus kan være dyrket i både mygg og pattedyrceller. Primære, dermale fibroblaster umodne dendrittiske celler, kortikale nevrale stamceller og Vero-celler er mottagelige for Zika virusinfeksjon 10,14,15. Både type I og type II interferoner har vist seg å begrense ZIKV vekst i huden fibroblaster 15. Formålet med denne studien er å gi en trinnvis, detaljert protokoll for produksjon og analysering av den asiatiske genotype Zika viral belastning PRVABC59 i en pattedyrcellekultur system og å demonstrere nytten av denne smittsomme kultur system som et rusmiddel utviklingsplattform. Denne ressursen har potensial til å få stor betydning for Zika viral og nevrologisk forskning samfunnet for å ytterligere belyse its mekanismer av viral patogenese og utviklingen av viral virulens.
Her blir et strømlinjeformet protokoll for dyrking Zika virus in vitro presentert. Kritiske trinn, blant annet, å identifisere optimale sluttpunkter for å utvide virus kultur, måle titer, og kvantifisere genom replikering ble gitt. Zika virus er en menneskelig patogen, så, mens håndtering av smittestoffer, biosikkerhet prosedyrer skal følges nøye. En ape nyrecellelinje, Vero, ble anvendt for å demonstrere forskjellige virologiske tester. Zika viral replikasjonskinetikk kan være forskjellig i celler av…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |