Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika Virus (ZIKV) er en ny patogen som er knyttet til fosterutviklingsavvik som microcephaly, øye defekter, og svekket vekst. ZIKV er et RNA-virus i Flaviviridae familien. ZIKV er hovedsakelig overføres av mygg, men kan også spres ved maternal til foster vertikal overføring samt seksuell kontakt. Til dags dato er det ingen pålitelig behandling eller vaksine alternativer tilgjengelige for å beskytte dem som er smittet av viruset. Utviklingen av en reproduserbar, effektiv Zika virus smittsomme cellekultursystem er kritisk for å studere de molekylære mekanismene for ZIKV replikasjon, så vel som legemiddel og vaksineutvikling. I denne forbindelse er en protokoll beskriver en pattedyrcellebasert in vitro Zika virus kultursystem for virusproduksjon og vekst analyse rapportert her. Detaljer på dannelsen av plakk ved Zika virus på en celle monolag og plakk-analyse for måling av viral titer er presentert. Viral genom replikering kinetikkog dobbel-strandet RNA genom replicatory mellom bestemmes. Denne kulturen plattformen ble benyttet for å skjerm mot et bibliotek av et lite sett av cytokiner som resulterer i identifikasjonen av interferon-α (IFN-α), IFN-β og IFN-γ som potente inhibitorer av Zika viral vekst. Oppsummert er en in vitro smittsom Zika viral kultur system og ulike virologiske analyser påvist i denne studien, som har potensiale til å ha stor nytte av forskningsmiljøet i å belyse ytterligere mekanismene for viral patogenese og utviklingen av viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan videre bli vurdert som et forebyggende, etter eksponering profylaktisk og behandlingsalternativ for Zika virusinfeksjoner hos høyrisikogrupper, inkludert infiserte gravide kvinner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zika Virus (ZIKV) er en viktig menneskelig patogen assosiert med microcephaly og dårlig svangerskapsutfall 1,4. ZIKV tilhører settet av medisinsk relevante flaviviruses som kan forårsake nevrologiske defekter som Dengue, West Nile, og St. Louis encefalitt virus. Den viktigste modusen for viral transmisjon er av mygg vektoren Aedes aegypti, og, i tillegg har seksuell overføring også blitt rapportert 5,6. ZIKV har blitt en stor global helse problem på grunn av den voksende geografiske fordelingen av mygg vektoren og dens sterk sammenheng med misdannelser. ZIKV ble først isolert i 1947 fra en sentinel rhesus ape i Zika skogen, ble Uganda og det første mennesket saken rapportert i 1952 7,8. Personer som smittes med ZIKV stede med milde symptomer som feber, utslett, hodepine, konjunktivitt, og muskel / leddsmerter. Infiserte gravide kan overføre ZIKV til fosteret en. ZIKV infeksjon har også vært knyttet til Guillain-Barre syndrom, en perifer nerve auto-immune demyelinering uorden 9.

Den Zika virale genomet består av en positiv fornuft, enkelt-trådet RNA-molekyl som er omtrent 10,8 kilobaser i lengde. Genomet struktur er organisert som 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med ikke-kodende regioner (NCR) flankerer en proteinkodende region 6. En enkelt polyproteinet (3419 aa) er oversatt som er co-og post-translatorisk spaltet opp i 10 mindre peptider. Både 5'NCR og 3'NCR RNA stilk-loop-strukturene spille en avgjørende rolle i begynnelsen av viral genom oversettelse og replikering. De strukturelle komponenter i genomet består av kapsidet, membran, og kappeproteiner. De ikke-strukturelle proteiner som er kritiske for genomreplikasjon.

Foreløpig er Zika virusstammer gruppert i tre hoved genotyper: vestafrikanske, East African og asiatiske 6,10-13. Det er foreslått at den østafrikanske avstamning spre seg til Vest-Afrika og Asia, hvor den senere videre utviklet seg 12. Den asiatiske genotype er ansvarlig for dagens utbrudd i Amerika. Zika virus kan være dyrket i både mygg og pattedyrceller. Primære, dermale fibroblaster umodne dendrittiske celler, kortikale nevrale stamceller og Vero-celler er mottagelige for Zika virusinfeksjon 10,14,15. Både type I og type II interferoner har vist seg å begrense ZIKV vekst i huden fibroblaster 15. Formålet med denne studien er å gi en trinnvis, detaljert protokoll for produksjon og analysering av den asiatiske genotype Zika viral belastning PRVABC59 i en pattedyrcellekultur system og å demonstrere nytten av denne smittsomme kultur system som et rusmiddel utviklingsplattform. Denne ressursen har potensial til å få stor betydning for Zika viral og nevrologisk forskning samfunnet for å ytterligere belyse its mekanismer av viral patogenese og utviklingen av viral virulens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: En skjematisk skisse av arbeidsstrømmen er presentert i figur 1.

1. Cellene

  1. Bruk Vero-celler for Zika virusproduksjon og analyse av virus-replikasjonssyklus.
  2. Fremstille fullstendig vekstmedier inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 enheter / ml), og 10 mM HEPES.
  3. Kultur Vero-celler med det angitte komplett vekstmedium ved 37 ° C med 5% CO2.

2. Zika Virus Produksjon

  1. Høste Vero-celler på 80% celletetthet bruker 0,25% trypsin i T-75 kolbe og telle cellene.
    1. Aspirer media fra T-75 kultur kolbe og skyll cellene med 2 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
    2. Tilsett 2 ml av 0,25% trypsin og inkuber i kolben ved 37 ° C i 5 minutter.
    3. Tilsett 8 ml av seruminneholdende dyrkningsmedium for å inaktivere trypsin. Pipet opp og ned til susPend celler og overføre cellene til en 15 ml tube.
    4. Fjern 10 ul av celler og bland med lik mengde på 0,4% trypanblått. Last den tilberedte mix til cellen telling kammer lysbilde og få levedyktige celler ved hjelp av en automatisert celleteller.
  2. Seed et totalt 7 millioner celler i et volum inn i en T-160-kolbe 30 ml.
  3. Den neste dag, utarbeide en passende mangfold av infeksjon (fra 0,01 til 0,1 MOI) av Zika virusinokulum i en 10 ml serumfritt dyrkningsmedier per flaske.
  4. Fjern brukte media fra T-160 kolbe og tilsett nylaget viral podestoff (10 ml).
  5. Inkuber de inokulerte kolber på 37 ° C med 5% CO2 i 4-6 timer. Spre pode ved å forsiktig vippe kolbene sidelengs på hver time.
  6. Ved avslutningen av inkubasjonen erstatte inokulumet med varme serum-supplert vekstmedium (30 ml) for hver kolbe. Deretter fortsetter viral kultur for neste 96 timer.
  7. Kontroller progresjon av isjon ved å observere opptreden av virale plakk på cellemonolaget ved hjelp av et fasekontrastmikroskop, og ta bilder (figur 2) etter behov ved 40X og 200X forstørrelse.

Figur 2
Figur 2:. Plakk dannes av Zika virus på en monolayer av Vero celler Bright felt bilder av forskjellige forstørrelser viser Zika virale plakk på 48 HPI. Legg merke til tilstedeværelsen av avrundet celle foki på monolaget. (Scale bar = 50 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Feie cellekultursupernatanter ved 96 timers tidspunktet og sentrifuger supernatanten ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C for å fjerne celleavfall.
  2. Fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelletert rusk og transfer to 15 ml rør. Ultrasentrifugering ved 24 000 xg kan utføres for å konsentrere de virale partikler (valgfritt).
  3. Oppbevar virale kultursupernatantene i flere alikvoter ved -80 ° C.

3. Måling Zika virustiter ved plakkassay

  1. Seed naive Vero-celler på 1 x 10 5 celler per brønn i 2 ml volum ved hjelp av en 12-brønns plate.
  2. Dagen etter, forberede 10-fold serielle fortynninger av virus kultursupernatanter samlet inn fra T-160 kolbe bruker serum-frie medier. Fjern de brukte media fra hver brønn og legge 400 mL preparerte podestoff på Vero celler i tre eksemplarer.
  3. Inkuber de inokulerte kolber i 37 ° C med 5% CO2 i 4-6 timer. Spre pode ved å forsiktig vippe platen sidelengs på hver eneste time.
  4. Ved slutten av inkubasjonen erstatte inokulumet med serum supplementert medium (2 ml per brønn).
  5. På 48 timer etter vaksinasjon, telle viral foci ved hjelp av en fase kontrast mikroskop. Beregn viral titer som plakkdannende enheter (PFU) per ml. Se figur 3 for plakkanalyse.
  6. Fest og beis cellene i 4% formaldehyd og 0,1% krystallfiolett løsning utarbeidet i 20% etanol for tydelig visualisering av plakk.

4. Zika Viral Genome Replication analysen

  1. Seed naive Vero-celler på 1 x 10 5 celler per brønn i 2 ml volumer ved hjelp av en 12-brønns plate. Den følgende dag, fremstille viral inokula (MOI på 0,01 og 0,1; 400 ul / brønn) av lav og høy titer ved hjelp av serumfritt medium i tre eksemplarer. For mock infeksjon, bruke serum frie medier (400 ul / brønn) bare.
  2. Gjenta trinnene 03.02 til 03.04.
  3. På 48 og 96-timers tids poeng, samle prøver for RNA og immunocytochemistry (ICC).
    1. For høsting RNA prøver, tar ut mediene, og deretter legge til 400 mL av lysis løsning direkte til hver brønn og samle lysatene.
    2. For ICC, fjerne media og thøne fiksere cellene ved å tilsette 1 ml av methanol til hver brønn og inkuber platen ved 4 ° C i 30 minutter.
    3. Fra cellelysat, isolere total RNA ved hjelp av en RNA isolering kit henhold til produsentens instruksjoner. Kvantifisere RNA ved hjelp av et spektrofotometer.
  4. Utfør en to-trinns revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) for å bestemme ZIKV genomet innhold fra høstet RNA.
    1. For å snu transkribere RNA, først sette opp en 13 mL reaksjon blanding bestående av fem mikrogram av isolert RNA, 1 mL av dNTP (10 mm), og en ul tilfeldig heksamer (250 ng) i et 0,2 ml tube. Inkuber røret ved 65 ° C i 5 minutter og deretter plassere den på is i ett minutt. Deretter tilsett 1 pl av revers transkriptase, 4 ul 5x trådsyntese-buffer, 1 ul av 0,1 M ditiotreitol, og 1 ul RNase-inhibitor til reaksjonsblandingen. Inkuber røret i ytterligere 5 minutter ved 25 ° C, etterfulgt av 60 minutter ved 50 ° C og inactivspiste reaksjonen ved oppvarming til 70 ° C i 15 min.
    2. Utfør qPCR bruker 1 mL av den resulterende cDNA med 12,5 mL av 2x grønt fargestoff super blanding som inneholder DNA polymerase og 1 mL 10 mM individuelle primere spesifikke for Zika virus [Zika virus pan-genotype primere (For: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virus asiatisk genotypen PRVABC59 strekk primere (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3', Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], eller hepatitt C-virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), eller cellulær husholdningsgenet GAPDH (For: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 ', Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') i et 25 pl reaksjonsvolum.
    3. Utføre PCR ved anvendelse av kjøringen betingelsen 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder (40 sykluser) i en real-time PCR system.
    4. Bruk GAPDH uttrykket nivå basert på syklus terskel (Ct) verdi for å normalisere Zika viral genom måling. Beregn delta Ct (ΔCt) verdien av Zika genom sammenlignet med GAPDH og få to ΔCt verdi. Deretter beregner ganger endring ved å ta forholdet mellom normaliserte Zika genom innhold mellom infiserte og ikke-infiserte celler ved angitte tidspunkter. Se figur 4 for ZIKV genom replikering resultater.
  5. Utfør ICC hjelp av metanolfikserte celler.
    1. Vask de fikserte celler tre ganger med 1 x PBS og blokker med ICC blokkeringsbuffer (3% geiteserum, 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 i PBS).
    2. Bruk mus monoklonalt anti-dsRNA-antistoff J2 (1 pg / ml) ved en fortynning på 1: 100 i blokkeringsbuffer og inkuber over natten ved 4 ° C.
    3. Vask cellene med 1 x PBS og legge til sekundært antistoff geit-anti-mus-IgG-594 (1 ug / ml) ved en 1: 1000 fortynning i blokkeringsbuffer og inkuberes i en time ved romtemperatur.
    4. Vask celler med 1x PBS og beis for kjerner som bruker Hoechst fargestoff ogobservere cellene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop ved 100X forstørrelse (figur 4).

5. Screening cytokin Library mot Zika virus infeksjon

  1. Seed naive Vero-celler på 1 x 10 5 celler per brønn ved hjelp av en 12-brønns plate. Når cellene er vedlagt (6 timer etter seeding), legge til hver cytokin ved indikerte konsentrasjoner i biologiske duplikater (2 ml volum / brønn). Inkluder kjøretøy (PBS) alene kontroll.
  2. Ved 12 timer etter behandling, utføre Zika viral infeksjon (MOI på 0,1 i 400 ul per brønn). Inkluder negative kontrollbrønner uten infeksjon (mock).
  3. På fire timer etter infeksjon, erstatte viral podestoff med cytokin behandlet media (2 ml). Inkuber cellene ved 37 ° C i ytterligere 44 timer.
  4. På 48 timer etter infeksjon, telle virale plakk ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og skaffe representative bilder av infiserte celler ved 40X forstørrelse (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En Zika viral belastning (PRVABC59; GenBank tiltredelse antall KU501215) av den asiatiske genotype ble benyttet i denne studien 12. Vero-celler ved 80% konfluens ble anvendt for å undersøke de novo Zika virusinfeksjon. For virusproduksjon og påfølgende virologisk karakterisering, ble en tidlig passasje (P3) Zika virus ansatt. De virale plakk ble observert på den andre dag av infeksjonen. Zika virale progenies frigjøres fra den innledningsvis infiserte celle kan spre seg til nabocellene, noe som resulterer i dannelsen av synlige plakk i monolagskultur (figur 2). Den cytopatiske effekt (CPE) av Zika viral infeksjon er karakterisert ved morfologiske forandringer som avrunding og løsgjøring av celler, så vel som lytiske celledød.

For måling av viral titer, ble virusinneholdende cellefri supernatant høstet fra T-160-kolber kastet 10-fold seriefortynning og lagt inn på monolag av Vero-celler i en 12-brønns plateformat (figur 3). 48 timer etter inokulering tidspunkt ble anvendt som et sluttpunkt for å unngå å telle plakk som oppstår fra sekundær infeksjon. ble valgt til brønnene med 30-100 plakk for telling for å få en nøyaktig titer.

RT-qPCR-analyse ble benyttet for å beregne genomet replikasjon av Zika virus. En pan-genotype primerpar spesielt for høyt konservert ZIKV NS5 regionen ble inkludert 3,16. Zika viral stamme PRVABC59-spesifikke primere basert på den genomiske plasseringen av panne genotypisk primere (sekvensene til primerne er angitt i protokollen avsnitt 4.4.2) ble også testet. Begge de primerparene viste tilsvarende nivåer av følsomhet i amplifisere Zika virusgenom fra infiserte celler (figur 4). Som en negativ kontroll ble hepatitt C-virus-spesifikke primere også testet 17. En betydelig INCRlette i ZIKV virale genom-innholdet ble observert mellom 48 og 96 timers tidspunkter i både lav og høy MOI infiserte celler, noe som tyder på en robust viral infeksjon (figur 4). Under Flavivirus genomreplikasjon, er dobbelt-trådet (ds) RNA-replicatory mellomprodukter som genereres ved dannelsen av basis-paring mellom følelse og anti-sense genomisk RNA. Et antistoff sonde spesielt for å gjenkjenne dsRNA oppdaget virus infiserte celler (figur 4). Viral dsRNA ble lokalisert til cytoplasma foreslå genom replikering avdelinger. Immunocytochemistry farging avdekket utvidelse av virusinfiserte celler i løpet av 48 og 96-timers tidspunkter.

Ved hjelp av den smittsomme Zika virus kultur system, ble et lite bibliotek av cytokiner skjermet for å bestemme antiviral aktivitet (figur 5). Cellene ble forbehandlet med forskjellige cytokiner i 12 timer og deretter infisert med virus Zika. Type I i nterferon, IFN-α, oppviste sterk antiviral aktivitet mot Zika virus i et bredt spekter av testede doser [10 internasjonale enheter (IU), 100 IU og 1000 IE]. IFN-β vist en potent inhiberende effekt i tillegg. Type II IFN-γ også viste anti-Zika viral aktivitet. Cytokiner TNF-α, IL-1 og IL-6 hemmet ikke ZIKV ved de angitte medikamentkonsentrasjoner.

Figur 1
Figur 1:. Generell skisse av Zika virusproduksjon og analyse arbeidsflyt For virusproduksjon, er ZIKV inokulert på Vero-celler i T-160 vevskulturflasker. Ved 48 eller 96 HPI, er den cellefrie virus supernatant høstet og lagret ved -80 ° C for genetisk analyse. Virustiteret er målt ved en begrensende fortynningsanalyse. Den Zika virusinokulum senere brukes til å studere virus replikering kinetikk og screening narkotika forbindelser.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Plaque undersøkelse for å måle Zika virusproduksjon Naive Vero-celler ble anvendt for å måle virustiter. Bright felt bilder viser tettheten av virale plakk på ulike fortynninger (Scale bar = 50 mikrometer). Merk: 1:. 100 fortynning Bildet viser tydelige plakk som kan være nøyaktig telles Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Analyser for å evaluere Zika virusreplikasjon. (A) Grafen viser Zika virus genomisk innhold målt ved RT-qPCR. Både pan-genotype (ZIKV GEN) og PRVABC59-stamme (ZIKV UNI) primere viste lik sensitivitet og spesifisitet. Som ventet fikk hepatitt C virus (HCV) primere ikke forsterke noe produkt. (B) Diagram presenterer Zika virusvekstkinetikk ved de angitte tidspunkter i lave og høye titer infiserte celler sammenlignet med den usmittede mock kontroll. Middelverdier og standardavvik er gitt. (C) Immunocytochemistry analyse for å undersøke virusreplikasjon. Zika virusinfiserte celler ble spesifikt farget med dsRNA-antistoff. Ved 48 HPI, infiserte celler er i noen klynger, mens ved 96 hpi de fleste av cellene blir infisert. Hoechst flekk ble anvendt for visualisering av kjerner (Skala bar = 50 um). BF:. Bright felt bilde Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Interferoner viser potent anti-Zika viral aktivitet (A) Diagram som viser modulering av Zika viral vekst av forskjellige cytokiner sammenlignet med bærerkontroll. Middelverdi og standardavvik er vist i søylediagrammet. Interferoner viste statistisk signifikant inhibering av virusreplikasjon Zika (p-verdi <0,05). (B og C) Fase kontrastbilder av Zika virusinfiserte celler med eller uten cytokin behandling. Virale plakk dannet av infiserte celler kan bli sett på som foci. Merk at interferon-behandlede brønner ikke har virale plakk. Mock kontroll uten ZIKV infeksjon inkludert som negativ kontroll. (Scale bar = 50 mikrometer) Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her blir et strømlinjeformet protokoll for dyrking Zika virus in vitro presentert. Kritiske trinn, blant annet, å identifisere optimale sluttpunkter for å utvide virus kultur, måle titer, og kvantifisere genom replikering ble gitt. Zika virus er en menneskelig patogen, så, mens håndtering av smittestoffer, biosikkerhet prosedyrer skal følges nøye. En ape nyrecellelinje, Vero, ble anvendt for å demonstrere forskjellige virologiske tester. Zika viral replikasjonskinetikk kan være forskjellig i celler av forskjellige vev og arter. Andre cellelinjer kan anvendes som beskrevet tidligere 15. Zika virus er blitt isolert fra hjernevevet av infiserte fostre 3, og er blitt vist å infisere kortikale nevrale stamceller 14. Således kan evaluere patofysiologien av ZIKV infeksjon i neuronale celler tilveiebringe ytterligere celle-spesifikke innsikt. Forskjeller i neurovirulent fenotype av afrikanske og asiatiske genotyper kan bli etterforsketved hjelp av denne smittsomme kultursystem. Den virale produksjon prosedyren som er beskrevet her vil også være nyttig for å generere høy-titer virus mot patogene in vivo studier i ikke-humane primater eller gnagere modellsystemer.

Mens, er denne studien begrenset til bruken av Vero-celler, kan høy titer produserende cellelinjer av menneskelige og mygg opprinnelse skal testes. I løpet av viral produksjon, hvis CPE er observert i kun 10-30% av celler på dag 3, de infiserte celler kan deles i 1: 4 tetthet og dyrking kan fortsettes i ytterligere 4-5 dager. Ved slutten av den 7. dag, kan en fullstendig CPE holdes.

Effektiviteten av ZIKV pan-genotype og stamme-spesifikke primere ble sammenlignet, og fastslått at begge er følsomme i kvantifisere Zika virale genomet i lav og høy titer virusinfiserte celler. Videre er det i denne studien, er et antistoff-basert sonde verifisert for å identifisere infiserte celler. Dette dsRNA-spesifikt antistoff vellykket recognized cytoplasmatiske virale genomer i Zika virusinfiserte celler. Disse optimaliserte reagenser vil være en nyttig ressurs for å dissekere ulike stadier av viral replikasjon som oversettelse, genom replikering, montering og virus morphogenesis.

Denne in vitro infeksiøst cellekultursystem kan anvendes for fremtidige studier ved hjelp av Zika virus-spesifikke sub-genomiske replikoner og infeksiøse virus som genereres fra komplementære DNA (cDNA) kloner. Utvikling av Zika virale infeksjons cDNA-kloner vil akselerere den funksjonelle studier av virusgener, inkludert NS1, og NS4B ved å kombinere genetiske og molekylærbiologiske teknikker. Etablering av Zika virus merket med en fluorescerende eller selvlysende basert reporter gen vil være et verdifullt verktøy i å gjøre ytterligere bruk cellekultur system i high-innhold screening-analyser.

Både type I og type II IFN demonstrert anti-Zika viral aktivitet. IFN-α, IFN-β og IFN-γ kan være ytterligere evaluated i kliniske settinger som et forebyggende, etter eksponering profylaktisk og behandling mot Zika virusinfeksjon og tilhørende sykdommer. Høyrisikogrupper, inkludert gravide positive for Zika virus, kan behandles med interferoner som et første linjen av behandlingen. Interferon-α behandling har vist seg å være trygt for gravide 18,19.

Oppsummert er en smittsom cellekultursystem som kan bli brukt til å undersøke ulike aspekter av Zika viral vekst som er beskrevet og skissert. Protokollen og reagenser som er beskrevet her er viktige ressurser for de som studerer Zika virus og nevrologiske fagmiljøet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Zika Virus Infeksiøs Cell Culture System og<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktisk Effekt av Interferon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter