Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zika Virus Infectious cellodlingssystem och doi: 10.3791/54767 Published: August 23, 2016

Abstract

Zika Virus (ZIKV) är en framväxande patogen som är kopplad till fosterutvecklings störningar såsom mikrocefali, ögonskador och försämrad tillväxt. ZIKV är ett RNA-virus av Flaviviridae-familjen. ZIKV huvudsak överförs av myggor, men kan också spridas genom moderns till foster vertikal överföring samt sexuell kontakt. Hittills finns det inga tillförlitliga behandling eller vaccin alternativ för att skydda dem smittats av viruset. Utvecklingen av en reproducerbar, effektiv Zika virus smittcellodlingssystem är avgörande för att studera de molekylära mekanismerna för ZIKV replikering samt läkemedel och vaccinutveckling. I detta avseende, är ett protokoll som beskriver en däggdjurscell-baserade in vitro Zika virus odlingssystem för viral produktion och tillväxtanalys redovisas här. Detaljer om bildandet av plack från Zika virus på en cell monolager och plackanalys för att mäta viral titer presenteras. Viral genomreplikation kinetikoch dubbelsträngade RNA-genomet replicatory intermediärer bestäms. Denna kultur plattform användes för att skärmen mot ett bibliotek av en liten uppsättning av cytokiner som resulterar i identifiering av interferon-α (IFN-α), IFN-β och IFN-γ som potenta inhibitorer av Zika virustillväxt. Sammanfattningsvis är ett in vitro smittsam Zika virusodlingssystemet och olika virologiska analyser visade i denna studie, som har potential att kraftigt gynna forskarvärlden i ytterligare klarlägga mekanismerna för viral patogenes och utvecklingen av viral virulens. Antiviral IFN-alfa kan vidare utvärderas som en profylaktisk, efter exponering profylaktisk och behandlingsalternativ för Zika virusinfektioner i högriskgrupper, inklusive infekterade gravida kvinnor.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zika Virus (ZIKV) är en viktig mänsklig patogen i samband med mikrocefali och dålig pregnancyutfall 1,4. ZIKV tillhör uppsättningen av medicinskt relevanta flavivirus som kan orsaka neurologiska defekter såsom Dengue, West Nile och St. Louis encefalitvirus. Det viktigaste sättet för virusöverföring är av mygga vektor Aedes aegypti, och dessutom har sexuell överföring också rapporterats 5,6. ZIKV har blivit en stor global hälsofråga på grund av den växande geografiska fördelningen av mygga vektor och dess stark korrelation med fosterskador. ZIKV isolerades först 1947 från en vaktpost rhesusapa i Zika skogen, var Uganda och den första mänskliga fallet rapporterades 1952 7,8. Individer som blir infekterade med ZIKV närvarande med milda symtom som feber, hudutslag, huvudvärk, konjunktivit, och muskel / ledvärk. Smittade gravida kvinnor kan överföra ZIKV till fostret 1. ZIKV infektion har också varit knuten till Guillain-Barrés syndrom, en perifer nerv autoimmun demyelinisering störning 9.

Den Zika virala genomet består av en positiv känsla, enkelsträngad RNA-molekyl som är omkring 10,8 kilobaser i längd. Genomet struktur är organiserad som 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, med icke-kodande regioner (NCR) som flankerar en proteinkodande region 6. En enda polyprotein (3419 aa) översätts som är sam- och post-translationellt klyvs till 10 mindre peptider. Både 5'NCR och 3'NCR RNA stam-slingstrukturer spelar en viktig del i inledningen av virala genomet översättning och replikering. De strukturella komponenterna i genomet består av de kapsid, membran, och höljesproteiner. De icke-strukturella proteinerna är kritiska för genomreplikation.

För närvarande är Zika virusstammar delas in i tre huvud genotyper: Västafrikanska, Östafrikanska och asiatiska 6,10-13. Det har föreslagits att den östafrikanska härstamning spridit sig till Västafrika och Asien, där den senare utvecklats 12 ytterligare. Den asiatiska genotyp är ansvarig för den aktuella utbrott i Amerika. Zika virus kan odlas i både mygga och däggdjursceller. Primära dermala fibroblaster, omogna dendritiska celler, kortikala neurala stamceller, och Vero-celler är känsliga för Zika virusinfektion 10,14,15. Både typ I- och typ Il-interferoner har visat sig begränsa ZIKV tillväxt i hudfibroblaster 15. Målen för denna studie är att ge en stegvis, detaljerat protokoll för produktion och testmetoder av den asiatiska genotyp Zika virusstam PRVABC59 i en däggdjurscellodlingssystem och för att demonstrera nyttan av denna smitt odlingssystem som en drog utvecklingsplattform. Denna resurs har potential att kraftigt gynna Zika virus och neurologisk forskning samfundet att ytterligare belysa its mekanismer för viral patogenes och utvecklingen av viral virulens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Notera: En schematisk skiss av arbetsflödet presenteras i Figur 1.

1. Celler

  1. Använd Vero-celler för Zika virusproduktion och analys av virusreplikationscykeln.
  2. Förbereda komplett tillväxtmedium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, penicillin (100 enheter / ml), streptomycin (100 enheter / ml), och 10 mM HEPES.
  3. Kultur Vero-celler med den angivna komplett tillväxtmedium vid 37 ° C med 5% CO2.

2. Zika virusproduktion

  1. Skörda Vero-celler vid 80% celldensitet med användning av 0,25% trypsin i T-75-kolv och räkna cellerna.
    1. Aspirera media från T-75 odlingskolv och skölj cellerna med 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. Tillsätt 2 ml av 0,25% trypsin och inkubera kolven vid 37 ° C under 5 min.
    3. Tillsätt 8 ml serum innehållande odlingsmedium för att inaktivera trypsin. Pipett upp och ner till suspend celler och överföra cellerna till ett 15 ml rör.
    4. Avlägsna 10 pl celler och blanda med lika mängd av 0,4% trypanblått. Ladda den förberedda blandningen till cell räknekammaren slide och erhålla viabla cellräkningar med hjälp av en automatiserad cellräknare.
  2. Frö totalt 7 miljoner celler i en 30 ml volym i en T-160-kolv.
  3. Nästa dag, förbereda en lämplig infektionsmultiplicitet (0,01 till 0,1 MOI) av Zika virus inokulum i en 10 ml serumfritt odlingsmedium per flaska.
  4. Ta det använda media från T-160-kolv och tillsätt sedan nyberedda virala inokulum (10 ml).
  5. Inkubera ympade kolvarna i 37 ° C med 5% CO2 under 4-6 timmar. Sprid inokulatet genom att sakta vända flaskorna i sidled vid varje timme.
  6. Vid slutförandet av inkubationen ersätta inokulatet med varmt serum kompletterat tillväxtmedia (30 ml) för varje kolv. Fortsätt sedan det virala kultur för nästa 96 h.
  7. Kontrollera progressionen av ifection genom att observera uppträdandet av virala plack på cellmonoskiktet med användning av ett faskontrastmikroskop och ta bilder (figur 2) som behövs på 40X och 200X förstoring.

figur 2
Figur 2:. Plack bildas av Zika virus på ett monolager av Vero-celler Ljusa fält bilder av olika förstoringar visar Zika virala plack på 48 HPI. Notera förekomsten av rundade cell fokus på monolager. (Skala bar = 50 pm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Harvest cellkultursupematanter vid 96 h tidpunkt och centrifugera supernatanten vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C för att avlägsna celldebris.
  2. Försiktigt bort supernatanten utan att störa pellet skräp och överförings to 15 ml rör. Ultracentrifugering vid 24.000 xg kan utföras för att koncentrera viruspartiklar (tillval).
  3. Lagra de virala odlingssupernatanter i flera alikvoter vid -80 ° C.

3. Mätning Zika Virus titer genom plackanalys

  1. Seed naiva Vero-celler vid 1 x 10 5 celler per brunn i 2 ml volym med hjälp av en 12-brunnar.
  2. Följande dag, förbereda 10-faldiga seriespädningar av virus odlingssupernatanter som samlats in från de T-160-kolv med användning av serumfria medier. Ta bort de förbrukade media från varje brunn och tillsätt 400 pl av beredd inokulum på Vero-celler i tre exemplar.
  3. Inkubera ympade kolvarna i 37 ° C med 5% CO2 under 4-6 timmar. Sprid inokulatet genom att försiktigt luta plattan i sidled vid varje timme.
  4. Vid slutet av inkubationen ersätta ympen med serum kompletterade media (2 ml per brunn).
  5. Vid 48 h efter inokulering, räkna det virala foci med användning av en fas contrast mikroskop. Beräkna den virala titern som plackbildande enheter (PFU) per ml. Se figur 3 för plackanalys.
  6. Fixa och färga cellerna i 4% formaldehyd och 0,1% kristallviolettlösning som framställts i 20% etanol för tydlig visualisering av plack.

4. Zika Viral Genome Replication Assay

  1. Utsädes naiva Vero-celler vid 1 x 10 5 celler per brunn i 2 ml volymer med användning av en 12-brunnars platta. Följande dag, förbereda viral inokula (MOI på 0,01 och 0,1; 400 | il / brunn) med låg och hög titer med användning av serumfritt medium i tre exemplar. För mock infektion, använda serumfritt medium (400 pl / brunn) endast.
  2. Upprepa steg från 3,2 till 3,4.
  3. Vid 48 och 96 tim tidpunkter, samla proverna för RNA och immunocytokemi (ICC).
    1. För skörd RNA-prover, ta bort media och sedan lägga till 400 pl lyseringslösning direkt till varje brunn och samla lysaten.
    2. För ICC, ta bort media och thöna fixera cellerna genom tillsats av 1 ml metanol till varje brunn och inkubera plattan vid 4 ° C under 30 min.
    3. Från cellysatet, isolera totalt RNA med användning av ett RNA-isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner. Kvantifiera RNA med hjälp av en spektrofotometer.
  4. Utför en två-stegs omvänd transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) för att bestämma ZIKV genomet innehåll från skördade RNA.
    1. För att vända transkribera RNA, först ställa in en 13 pl reaktionsblandning bestående av 5 mikrogram av isolerad RNA, 1 pl dNTP (10 mM) och 1 pl slumpmässig hexamer (250 ng) i en 0,2 ml rör. Inkubera röret vid 65 ° C under 5 min och sedan placera den på is under en minut. Därefter, tillsätt 1 | j, l av omvänt transkriptas, 4 | il av 5x strängsyntes-buffert, 1 | il av 0,1 M ditiotreitol och 1 pl av RNas-inhibitor till reaktionsblandningen. Inkubera röret under ytterligare 5 min vid 25 ° C, följt av 60 min vid 50 ° C och inactivåt reaktionen genom upphettning till 70 ° C under 15 min.
    2. Utföra qPCR användning av 1 | il av den resulterande cDNA med 12,5 pl av 2x grönt färgämne väldiga blandning innehållande DNA-polymeras och 1 | il av 10 mM enskilda primrar som är specifika för Zika virus [Zika virus pan-genotyp primers (For: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virus Asian genotyp PRVABC59 stam primers (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], eller hepatit C-virus (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), eller cellulär housekeepinggen GAPDH (För: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') i en 25 | il reaktionsvolym.
    3. Utföra PCR med användning av körningen villkoret 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 30 sek (40 cykler) i ett realtids-PCR-system.
    4. Använd GAPDH uttryck nivå baserat på cykel tröskeln (Ct) värde att normalisera Zika viralt genom mätning. Beräkna delta Ct (ΔCt) värde på Zika genomet jämfört med den för GAPDH och erhålla två ΔCt värdet. Därefter, beräkna faldsförändringen genom att ta förhållandet av normaliserade Zika genomet halter mellan infekterade och oinfekterade celler vid angivna tidpunkter. Se Figur 4 för ZIKV genomreplikation resultat.
  5. Utföra ICC med användning av de metanolfixerade celler.
    1. Tvätta de fixerade cellerna tre gånger med 1 x PBS och blockera med ICC blockeringsbuffert (3% getserum, 3% BSA, 0,1% Triton-x 100 i PBS).
    2. Använda mus-monoklonal anti-dsRNA-antikropp J2 (1 | ig / ml) vid en utspädning av 1: 100 i blockeringsbuffert och inkubera över natten vid 4 ° C.
    3. Tvätta cellerna med 1 x PBS och tillsätt sekundär antikropp av get-anti-mus-IgG-594 (1 | ig / ml) vid en 1: 1000 utspädning i blockeringsbuffert och inkubera under en timme vid rumstemperatur.
    4. Tvätta cellerna med 1 x PBS och bets för kärnor som använder Hoechst färgämne ochobservera cellerna med användning av ett fluorescerande mikroskop vid 100 gångers förstoring (fig 4).

5. Screening Cytokine Library mot Zika virusinfektion

  1. Seed naiva Vero-celler vid 1 x 10 5 celler per brunn med en 12-brunnar. När cellerna är fästa (6 h efter sådd), lägga till varje cytokin vid angivna koncentrationer i biologiska dubbletter (2 ml volym / brunn). Inkludera fordon (PBS) ensam kontroll.
  2. Vid 12 h efter behandling, utför Zika virusinfektion (MOI av 0,1 i 400 | il per brunn). Inkludera negativa kontrollbrunnar utan infektion (mock).
  3. Vid 4 timmar efter infektion, ersätter den virala inokulum med cytokin behandlade media (2 ml). Inkubera cellerna vid 37 ° C under ytterligare 44 timmar.
  4. Vid 48 h efter infektion, räkna virala plack med användning av ett faskontrastmikroskop och förvärva representativa bilder av infekterade celler vid 40X förstoring (Figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En Zika virusstam (PRVABC59; GenBank accessionsnummer KU501215) av den asiatiska genotypen utnyttjades i denna studie 12. Vero-celler vid 80% konfluens användes för att undersöka de novo Zika virusinfektion. För viral produktion och efterföljande virologiska karakterisering, var en tidig passage (P3) Zika virus används. De virala plack observerades på den andra dagen för infektion. Zika virala avkommor som frigörs från den initialt infekterade cellen kan sprida sig till angränsande celler, vilket resulterar i bildningen av synliga plack på monolagerkultur (figur 2). Den cytopatiska effekten (CPE) av Zika virusinfektion kännetecknas av morfologiska förändringar såsom avrundning och lösgörande av celler samt lytisk celldöd.

För mätning av virustiter ades virusinnehållande cellfria supernatanten skördas från T-160-kolvar utsattes för 10-fold seriespädning och läggas på monolager av Vero-celler i en 12-brunnar format (Figur 3). Den 48 h efter inokulering tidpunkt användes som slutpunkt för att undvika att räkna placken till följd av sekundär infektion. Brunnarna med 30-100 plack valdes för räkning för att erhålla en noggrann titer.

RT-qPCR analys användes för att uppskatta genomet replikering av Zika virus. En pan-genotyp primerpar specifikt för den mycket konserverade ZIKV NS5-regionen ingick 3,16. Zika viral stam PRVABC59 specifika primrar baserade på den genomiska placeringen av pan-genotypiska primers (sekvenser av primrarna ges i protokollsektionen 4.4.2) testades också. Båda primerparen visade liknande nivåer av känslighet i att förstärka Zika virala genomet från infekterade celler (Figur 4). Som en negativ kontroll, var hepatit C-virusspecifika primrar testades även 17. En betydande incrlätthet i den ZIKV virala genomet innehåll observerades mellan 48 och 96 h tidpunkter både i låga och höga MOI-infekterade celler, vilket tyder på en robust virusinfektion (Figur 4). Under Flavivirus genomreplikation, är dubbelsträngat (ds) RNA replicatory mellanprodukter som genereras genom bildning av basparning mellan sens- och antisens-genomiskt RNA. En antikropp sond specifikt för att erkänna dsRNA upptäckt virusinfekterade celler (Figur 4). Viral dsRNA var lokaliserade till cytoplasman tyder de genomet replikering facken. Immunocytokemi färgning avslöjade expansion av virusinfekterade celler under 48 och 96 timmar tidpunkter.

Använda smitt Zika virus odlingssystem, var ett litet bibliotek av cytokiner screenas för att bestämma antiviral aktivitet (Figur 5). Cellerna förbehandlas med olika cytokiner under 12 h och sedan infekterade med Zika virus. Typ I i nterferon, IFN-α, uppvisade stark antiviral aktivitet mot Zika virus i ett brett spektrum av testade doserna [10 internationella enheter (IE), 100 IE och 1000 IE]. IFN-β visat en potent inhiberande effekt också. Typ II IFN-γ visade också anti-Zika viral aktivitet. Cytokinerna TNF-α, IL-1 och IL-6 hämmade inte ZIKV vid de angivna läkemedelskoncentrationerna.

Figur 1
Figur 1:. Allmän beskrivning av Zika virusproduktion och analys arbetsflöde för virusproduktion är ZIKV ympas på Vero-celler i T-160 vävnadsodlingskolvar. Vid 48 eller 96 hpi är den cellfria virus supernatant skördades och lagrades vid -80 ° C under nedströms analys. Virustiter mäts genom en begränsande spädningsanalys. Den Zika virus inokulum därefter används för att studera virusreplikation kinetik och screening läkemedelssubstanser.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Plack analys för att mäta Zika virusproduktion Naiva Vero-celler användes för mätning av virustiter. Ljusa fält bilder visar tätheten av virala plack på olika utspädningar (Skala bar = 50 pm). Obs! 1:. 100 utspädning Bilden visar tydliga plack som exakt kan räknas Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Analyser för att utvärdera Zika virusreplikation. (A) Diagrammet visar Zika virus genom innehåll mätt med RT-qPCR. Både pan-genotyp (ZIKV GEN) och PRVABC59-stam (ZIKV UNI) primers visade samma känslighet och specificitet. Som väntat, gjorde hepatit C-virus (HCV) primrar amplifierar inte någon produkt. (B) Diagram presenterar Zika virala tillväxt kinetik vid de angivna tidpunkterna i låga och höga titer infekterade celler jämfört med den hos den icke-infekterade imiterad kontroll. Medelvärden och standardavvikelser anges. (C) Immuncytokemi analys för att undersöka virusreplikation. Zika virusinfekterade celler specifikt färgades med dsRNA antikropp. Vid 48 hpi, infekterade cellerna är i några kluster, medan vid 96 hpi de flesta av cellerna är infekterade. Hoechst fläcken användes för visualisering av kärnor (Skalstreck = 50 | im). BF:. Ljusfält bild Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Interferoner visar potent anti-Zika viral aktivitet (A) Diagram som visar modulering av Zika virustillväxt genom olika cytokiner jämfört med den för kontrollen över fordonet. Medelvärden och standardavvikelse visas i stapeldiagrammet. Interferoner visade statistiskt signifikant hämning av Zika virusreplikation (p-värde <0,05). (B och C) faskontrast bilder av Zika virusinfekterade celler med eller utan cytokin-behandling. Virala plack som bildas av infekterade celler kan ses som foci. Observera att interferonbehandlade brunnar inte har virala plack. Mock kontroll utan ZIKV infektion inkluderas som negativ kontroll. (Skala bar = 50 pm) Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här är en strömlinjeformad protokoll för odling Zika virus in vitro presenteras. Kritiska steg inklusive identifiera optimala slutpunkter för att expandera virusodling, mäta titer, och kvantifiera genom replikering tillhandahölls. Zika virus är en human patogen, så vid hantering smittämnen, biosäkerhet förfaranden som måste följas. En apa njurcellinjen, Vero, användes för att demonstrera olika virologiska analyser. Zika viral replikering kinetik kan skilja sig i celler i olika vävnader och arter. Ytterligare cellinjer kan användas såsom beskrivits tidigare 15. Zika virus har isolerats från hjärnvävnad från infekterade foster 3 och har visat sig infektera kortikala neurala stamceller 14. Sålunda kan en utvärdering av patofysiologin för ZIKV infektion i neuronala celler ger ytterligare cellspecifika insikter. Skillnader i neurovirulenta fenotypen av afrikanska och asiatiska genotyper kan undersökasmed hjälp av denna smittsamma odlingssystem. Den virala produktionen förfarande som beskrivs här kommer också att vara användbar för att generera hög titer virus mot in vivo patogena studier i system icke-mänskliga primater eller gnagare modell.

Medan denna studie begränsad till användningen av Vero-celler, kan hög titer producerande cellinjer av humana och mygga ursprung testas. Under viral produktion, om CPE observeras i endast 10-30% av cellerna på dag 3, de infekterade celler kan delas i 1: 4 densitet och odling kan fortsättas under ytterligare 4-5 dagar. Vid slutet av 7: e dagen, kan observeras en fullständig CPE.

Effektiviteten i ZIKV pan-genotyp och stamspecifika primers jämfördes och fastställt att båda är känsliga kvantifiera Zika virala genomet i låg och hög titer virusinfekterade celler. Vidare i denna studie, är en antikroppsbaserad sond verifieras för att identifiera infekterade celler. Detta dsRNA-specifika antikroppen med framgång recognized cytoplasmatiska virala genom i Zika virusinfekterade celler. Dessa optimerade reagenser kommer att bli en användbar resurs för att dissekera olika stadier av virusreplikation som översättning, genomreplikation, montering och virion morfogenes.

Detta in vitro smittcellodlingssystem är tillämpligt på framtida studier med Zika virusspecifika underiska replikoner och smittsamt virus som genereras från komplementärt DNA (cDNA) kloner. Utveckling av Zika virala infektiösa cDNA-kloner kommer att påskynda den funktionella studier av virusgener inklusive NS1, och NS4B genom att kombinera genetiska och molekylärbiologiska tekniker. Etablering av Zika virus märkta med en fluorescerande eller luminescerande baserad reportergen skulle vara ett värdefullt verktyg för att göra ytterligare använda cellodlingssystem i hög innehållsscreeningsanalyser.

Både typ I och typ II IFN visade anti-Zika viral aktivitet. IFN-α, IFN-β och IFN-γ kan vidare evaluated i kliniska inställningar som en profylaktisk, efter exponering profylaktisk och behandling mot Zika-virusinfektion och associerade sjukdomar. Högriskgrupper, inklusive gravida kvinnor positiva för Zika virus, kan behandlas med interferoner som en förstahandsbehandling. Interferon-α behandling har visat sig vara säkert för gravida kvinnor 18,19.

Sammanfattningsvis är en infektiös cellkultursystem som kan användas för att undersöka olika aspekter av Zika virustillväxt beskrivs och beskrivs. Protokollet och reagens som beskrivs här är viktiga resurser för dem som studerar Zika virus och neurologiska forskarsamhället.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315, (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374, (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65, (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17, (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152, (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46, (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19, (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2, (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14, (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22, (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20, (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87, (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28, (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36, (11), 1715-1718 (2002).
Zika Virus Infectious cellodlingssystem och<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylaktiska effekten av interferoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).More

Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter