Summary
Dieses Protokoll / Manuskript beschreibt einen optimierten Prozess für die Herstellung von Sporopollenin exine Kapseln (SECs) von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs.
Abstract
Mikrokapseln, die aus pflanzlicher Basis Sporen oder Pollen bieten eine robuste Plattform für ein breites Spektrum von Mikroverkapselung Anwendungen. Sporopollenin exine Kapseln (SECs) erhält, wenn Sporen und Pollen verarbeitet werden, um die interne sporoplasmic Inhalte zu entfernen. Die resultierenden hohlen Mikrokapseln mit einem hohen Grad an Micromeritic Einheitlichkeit aufweisen und komplizierte mikrostrukturellen Eigenschaften auf die besonderen Pflanzenarten im Zusammenhang behalten. Hier zeigen wir einen optimierten Prozess für die Herstellung von SECs von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs. Die aktuelle SEC Isolierungsverfahren wurde in SEC Isolations kürzlich optimiert, um signifikant die Verarbeitungsanforderungen zu reduzieren, die konventionell verwendet werden, und die Produktion von intakten Mikrokapseln zu gewährleisten. Natürliche L. clavatum Sporen werden mit Aceton entfettet, mit Phosphorsäure behandelt und extensiv sporoplasmi zu entfernen gewaschenc Inhalt. Nach Aceton Entfettung, alle sporoplasmic einen einzigen Schritt Verarbeitung 85% unter Verwendung von Phosphorsäure gezeigt Inhalte zu entfernen ist. Durch die Begrenzung der Säurebearbeitungszeit auf 30 Stunden, ist es möglich, saubere SECs zu isolieren und SEC Fracturing vermeiden, die gezeigt worden ist, mit einer verlängerten Verarbeitungszeit auftreten. Ausgiebiges Waschen mit Wasser, verdünnte Säuren, verdünnte Basen und Lösungsmittel sichergestellt, dass alle sporoplasmic Material und chemische Rückstände ausreichend entfernt werden. Die Vakuumbeladungstechnik wird verwendet, um ein Modellprotein (Rinderserumalbumin) als repräsentative hydrophile Verbindung zu laden. Vakuumbelastung stellt eine einfache Technik verschiedene Verbindungen ohne die Notwendigkeit einer scharfen Lösungsmittel oder unerwünschte Chemikalien zu laden, die oft in anderen Mikroverkapselung Protokolle erforderlich sind. Auf der Grundlage dieser Isolation und Belastungsprotokollen bieten SECs ein vielversprechendes Material für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Mikroverkapselung-Anwendungen, wie Therapeutika, Lebensmittel, Kosmetika und Körperpflege proddukten.
Introduction
Es gibt großes Interesse an natürlichen Pflanzenbasis Kapseln aus Pflanzensporen und Pollen für die Verwendung in der Mikroverkapselung Anwendungen erhalten. 1-15 In der Natur, Sporen und Pollen Schutz für empfindliche genetische Materialien gegen raue Umgebungsbedingungen. Die Grundstruktur der Pflanzensporen und Pollen umfasst typischerweise eine äußere Hüllschicht (exine), eine innere Mantelschicht (intine) und die interne zytoplasmatische Material. Die exine besteht aus einem chemisch robust Biopolymer 1,9,10,13,16 bezeichnet als Sporopollenin und die intine besteht hauptsächlich aus cellulosischen Materialien besteht. 16-18 leeren Kapseln kann nach verschiedenen Verfahren zur Entfernung von 7,9 cytoplasmatische Material isoliert werden , Proteine und die intine Schicht. 2,12,16 Diese Sporopollenin exine Kapseln (SECs) eine überzeugende Alternative zu synthetischen Vergussmassen bieten aufgrund ihrer engen Größenverteilung und eine einheitliche Morphologie. 7,9,13,19,20 dieEntwicklung von standardisierten Prozessen SECs aus verschiedenen Pflanzenarten, wie Lycopodium clavatum zu erhalten, öffnet sich das Potential für eine breite Palette von Mikroverkapselung Anwendungen auf den Gebieten der Arzneimittelabgabe, Nahrungsmittel und Kosmetika. 6,10-13,21
Um SECs zu erhalten, zytoplasmatische Inhalte zu entfernen , Sporen und Pollen mit organischen Lösungsmitteln und unter Rückfluß erhitzt in alkalischen Lösungen behandelt Forscher zuerst. 22-25 jedoch wurde die verbleibende Kapselstruktur des Cellulose intine Schicht enthalten noch bestimmt. Um diese zu entfernen, erkundeten die Forscher die Verwendung von längeren saure Hydrolyse Verarbeitung Salzsäure, heißer Schwefelsäure oder heiße Phosphorsäure über mehrere Tage mit, 22-25 mit Phosphorsäure die bevorzugte Methode der SEC intine Entfernung zu werden. 2 jedoch laufend Forschung in den letzten Jahren hat gezeigt, dass verschiedene Sporen und Pollen haben unterschiedliche Grade der Widerstandsfähigkeit gegenüber der harten Verarbeitung michthoden verwendet. 26,27 Einige Sporen und Pollen vollständig abgebaut sind und alle strukturelle Integrität in stark alkalischen Lösungen zu verlieren, oder stark in stark sauren Lösungen beschädigt werden. 16 Die Variabilität in SEC als Reaktion auf die Behandlungsbedingungen ist aufgrund subtile Variationen in der chemischen Struktur und Morphologie des exine Sporopollenin exine Material zwischen den Arten. 28 Aufgrund der Variabilität in der Robustheit Sporopollenin exine Kapseln (Sekunden), ist es notwendig , die Verarbeitungsbedingungen für die einzelnen Arten von sporen und Pollen zu optimieren.
Pflanzensporen aus der Spezies L. clavatum haben die am häufigsten untersuchten einzelne Quelle von SECs werden. Es wird vorgeschlagen , dass dies in erster Linie wegen seiner breiten Verfügbarkeit ist, niedrige Kosten, Monodispersität und chemische Robustheit 9,29 Die Sporen leicht geerntet werden können und enthalten sporoplasmic Inhalte in Form von Gruppen von 1 -. 2 um Zellorganellen und biomolecules. 11 L. clavatum Sporen wurden als natürliches Pulverschmiermittel, 30,31 Basis für Kosmetika, 30 und in der Kräutermedizin 32-36 für eine breite Palette von therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Die SECs von L. erhalten clavatum wurden zur Verkapselung gezeigt werden , widerstandsfähiger Verarbeitung als SECs aus anderen Arten von Sporen und Pollen. 2 Nach der Bearbeitung wurden die resultierenden SECs worden ihre komplizierten microridge Strukturen und hohe morphologische Homogenität gezeigt zu halten , während eine große innere Hohlraum bereitstellt. 7 Studien zeigen , dass L. clavatum SECs kann zur Verkapselung von Arzneimitteln, Impfstoffen 10,13, 11 - Proteine, 7,14 Zellen, 8 Öle, 5-7,9 und Nahrungsergänzungsmittel. 5,15 Beobachteter SEC Ladewirkungsgrade sind relativ hoch im Vergleich zu herkömmlichen verwendet werden , Verkapselungsmaterialien. 7 Es gibt auch eine Reihe von Vorteilen berichtetDas am häufigsten verwendete SEC Extraktionsverfahren für L. SEC Einkapselung wie die Fähigkeit , Geschmack zu maskieren, 6,10 und einen gewissen Grad an natürlicher Schutz gegen Oxidation zu sorgen. 12 in den vorliegenden Studien, clavatum basiert auf vier Hauptschritte. Schritt eins ist Lösungsmittel Rückflußkochen in Aceton bis zu 12 Stunden bei 50 ° C , um die Sporen zu entfetten. 11 Schritt zwei alkalisch Rückfluß in 6% Kaliumhydroxid für bis zu 12 h bei 120 ° C zytoplasmatischen und proteinöse Materialien zu entfernen. 11 Stufe drei ist Säure Rückfluss in 85% iger Phosphorsäure für bis zu 7 Tage bei 180 ° C , um die Cellulose - intine Material zu entfernen. 11 Schritt vier ist ein umfassendes Waschvorgang Wasser, Lösungsmittel, Säuren und Basen alle verbleibenden nicht exine Material zu entfernen und chemische Rückstände.
Die Hauptziele der SEC-Extraktion in Bezug auf Verkapselungsanwendungen sind Kapseln zu produzieren, die leeren zytoplasmatischer Material, frei from potenziell allergene Proteine und morphologisch intakt. 2,37 jedoch von einem industriellen Fertigungs Sicht ist es auch wichtig ist , weitere wirtschaftliche und ökologische Faktoren wie Energieeffizienz, Produktionsdauer, Sicherheit, und die daraus resultierenden Abfall zu betrachten. Im Hinblick auf die Energieeffizienz, sowohl bei hohen Temperaturen und lange Bearbeitungszeiten beeinflussen die Produktionskosten sowie Umweltbelastung. Produktionsdauer und Laufzeit sind wichtige Faktoren, die die Verarbeitung der Rentabilität. Besonders besorgniserregend ist , dass Hochtemperatur - Sicherheitsfragen Phosphorsäure Verarbeitung erhöht und wird in korrosiven Skalierung führen bekannt , die in die Instandhaltung der Infrastruktur und Verzögerungen bei der Batch - Laufzeiten zu einem signifikanten Anstieg führt. 38-40 Wo es möglich ist , die Minimierung der Anzahl der erforderlichen Schritte führen kann deutlich den produzierten Abfall zu reduzieren. Jedoch verwendet das allgemein vierstufigen Prozess von L. clavatum SEC Extraktion hat einfach evolved aus Jahrzehnten der Forschung und hat wenig tatsächlichen Prozessoptimierung hatte. Vor kurzem Mundargi et al., Machte 41 einen wesentlichen Beitrag zu den laufenden Arbeiten in diesem Bereich durch die systematische Auswertung und eines der am häufigsten berichteten SEC Extraktionstechniken zu optimieren.
Im ersten Abschnitt dieser Studie: Sporen Entfettung wird 6 h bei 50 ° C unter Verwendung von Aceton-Verarbeitung gezeigt; sporoplasm und intine Abschiebungsverfahren demonstriert für 30 Stunden bei 70 ° C 85% ige Phosphorsäure Verarbeitung verwendet wird; ausgiebiges Waschen mit Wasser, Lösemittel, Säure und Base wird verwendet, um die Entfernung von restlichem sporoplasmic Inhalte zu zeigen; und SEC Trocknung wird gezeigt, unter Verwendung von Konvektion Trocknen und Vakuumofentrocknung. Im dritten Abschnitt wird SEC Vakuumlade Vakuum Laden eines Modellproteins demonstrierte Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA), gefolgt von BSA-geladen-SEC Waschen und Lyophilisieren. Im vierten Abschnitt wird die determination des Wirkungsgrades BSA Verkapselung Zentrifugation demonstrierte Verwendung Sondenbeschallung und UV / Vis-Spektrometrie.
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Protocol
1. Extraktion von Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) von L. clavatum Spores
Hinweis: Der Extraktionsprozess SEC beinhaltet ein entflammbares Pulver (L. clavatum), heiße ätzende Säuren und brennbare Lösungsmittel, also richtige persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gesichtsmaske, Handschuhe, Kittel) genehmigte Risikobewertung auf Nutzung und Entsorgung Chemikalien von autorisiertem Laborpersonal ist von wesentlicher Bedeutung.
- Spore Entfettung
- Bereiten Sie eine Reflux - Set-up in einem Abzug durch einen Glaskühler, Wasserzirkulationssystem, und Wasserbad (Abbildung 1).
- Man wiegt 100 g L. clavatum Sporen ohne Staubbildung und weg von jeder Zündquelle.
Hinweis: Die hier verwendeten Sporen im Handel erhalten wurden (siehe Materialliste). - Transfer Sporen langsam zu einer 1 L Polytetrafluorethylen (PTFE) Rundkolben mit einem magnetischen Rührstab.
- In 500 ml Aceton zu den Sporen in derPTFE-Kolben und schüttelt den Kolben sanft um eine homogene Suspension zu bilden.
- Setzen Sie den PTFE-Kolben im Wasserbad Satz bei 50 ° C und eine Verbindung zum Rückflußkühler.
- Führen Sie unter Rückfluß in Aceton für 6 Stunden mit 200 Umdrehungen pro Minute gerührt und dann lassen bei RT abkühlen.
- Filtern Sie die Suspension mit Filterpapier unter Vakuum und sammeln die entfettet Sporen in großen (15 cm Durchmesser) Petrischalen aus Glas.
- Trocknen der Sporen bei Raumtemperatur (fume hood) durch Abdecken mit Aluminiumfolie mit Löchern für die Lösungsmittelverdampfung.
- Acidolyse
- Bereiten Sie 85% (v / v) Phosphorsäure mit entsalztem Wasser (DI) und übertragen entfettet trockenen Sporen in einen 1 l PTFE-Kolben.
- Hinzufügen 500 ml Phosphorsäure (85% v / v) zu den entfetteten Sporen.
- Setzen Sie den PTFE-Kolben in einem Wasserbad Satz bei 70 ° C und eine Verbindung zum Rückflußkühler.
- Führen leichtem Rückfluß (70 ° C) in Phosphorsäure für 30 h und dann lassenbei Raumtemperatur kühlen.
- Verdünnen Sie die Suspension von 500 ml warmem DI Wasser und die SECs durch Vakuumfiltration mit Filterpapier sammeln.
- Übertragen Sie die SECs in einen 3 L Becherglas eine Reihe von Waschungen durchzuführen.
- SEC Waschen
- Legen Sie die 3 L Becherglas enthält SECs in einem Abzug.
- Hinzufügen 800 ml heißem (50 ° C) DI Wasser zu den SECs unter leichtem Rühren für 10 min.
- Filtern Sie die Suspension durch mit Filterpapier und eine Vakuumfiltration Set-up.
- Sammeln Sie die SECs in einem sauberen 3 L Becherglas.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1. bis 1.3.4. fünf Mal.
- Hinzufügen 600 ml heißem (45 ° C) Aceton zu dem SECs unter leichtem Rühren für 10 min.
- Sammeln Sie die SECs durch Filtration unter Vakuum und übertragen Sie die SECs auf eine saubere 3 L Becherglas.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. unter Verwendung von 600 ml heißem (50 ° C) 2 M Chlorwasserstoffsäure.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 600 ml hot (50 ° C) 2 M Natriumhydroxid.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 und 1.3.4 achtmal.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. unter Verwendung von 600 ml heißem (45 ° C) Aceton.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 600 ml heißem (45 ° C) Ethanol.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 800 ml heißem (50 ° C) DI-Wasser.
- Übertragen Sie die sauber SECs bis sechs große Petrischalen aus Glas und trocken in einem Abzug bei RT für 24 Stunden alle Wassergehalt zu entfernen.
- Trocknen Sie die SECs in einem Vakuumofen bei 60 ° C und 1 mbar Vakuum 10 h oder bis zur Gewichtskonstanz.
- Sammeln Sie die getrockneten SECs und Transfer in eine Polypropylenflasche.
- Bewahren Sie die SECs in einem trockenen Schrank.
2. Charakterisierung von SECs
- Führen Sie rasterelektronenmikroskopische Analyse 41 in verschiedenen Stadien Sporen und SECs verwenden.
- Führen Elementaranalyse 41 in verschiedenen Stadien Sporen und SECs verwenden. Dry alle Proben bei 60 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Elementaranalyse und Berechnung des Proteingehalts unter Verwendung Prozent Stickstoff mit einem Multiplikationsfaktor von 6,25. 11 Ergebnisse erhalten für jede Probe drei Messungen verwendet wird .
- Führen Sie Micromeritic Eigenschaften Analyse ein dynamisches Bild Particle Analyzer verwendet wird . 41
- Scannen nicht verarbeiteten, verarbeitet und FITC-BSA-loaded SECs konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie. 41
3. Biomakromoleküls Encapsulation von Vakuum-Loading-Technik
- Bereiten 1,2 ml 125 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung unter Verwendung von DI-Wasser und in ein 50 ml Polypropylenröhrchen.
- Man wiegt 150 mg SECs und Transfer zum BSA-Lösung.
- Vortexen das Röhrchen für 10 min eine homogene Lösung zu bilden.
- Decken Sie die Röhrchen mit Filterpapier.
- Übertragen Sie das Rohr zu einem Gefriertrockner Kolben und trocken für 4 Stunden mit Vakuum bei 1 mbar.
- Führen Sie die Schritte 3.1bis 3,5. für drei unabhängige Chargen.
- Sammeln Sie die BSA-beladenen SECs und entfernen Sie die Agglomerate mit einem Mörser und Stößel.
- Übertragen Sie die BSA-loaded SECs auf eine 50-ml-Röhrchen und 2 ml DI-Wasser, um den Rest BSA zu entfernen.
- Sammeln Sie die SECs durch Zentrifugation bei 4704 × g für 5 min und den Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie die Wäsche mit VE-Wasser einmal.
- Decken Sie die Röhrchen mit BSA-beladenen SECs mit Filterpapier.
- Übertragen Sie die SECs zu einem Gefrierschrank (-20 ° C) und einfrieren für 1 Stunde.
- Frieren Sie trocknen die SECs für 24 Stunden und Speicher in einem Gefrierschrank bis zur weiteren Charakterisierung.
- Bereiten Sie die Placebo SECs ohne BSA dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 3.1 verwenden. bis 3.13.
- Bereiten Sie die FITC-BSA loaded SECs 3.1 das gleiche Verfahren wie in Schritten. bis 3.13.
4. Bestimmung der Umhüllungs-Effektivität
- Wiegen 5 mg BSA-loaded SECs in 2 ml Polypropylenröhrchen.
- In 1,4 ml Phosphate gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) und Vortex für 5 min.
- Sonde beschallen die Suspension bei 40% Amplitude für 3 Zyklen von 10 sec.
- Filtern Sie die Lösung mit einem 0,45 um-Polyethersulfon (PES) Filter.
- Führen die gleiche Prozedur wie in den Schritten 4.1. bis 4.4. mit Placebo SECs.
- Messen Sie die Absorption bei 280 nm mit Placebo als Rohling.
- Quantifizierung der Menge an BSA verkapselt eine BSA - Standardkurve unter Verwendung von (200 bis 1.000 & mgr; g / ml) in PBS. 42
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Representative Results
Schlanke Extraktionsverfahren für Sporopollenin Exine Kapseln
Die L. clavatum SEC Extraktion wurde durch drei Hauptschritte erzielt: (1) Entfettung mit Aceton; (2) Acidolyse mit Phosphorsäure 85% (v / v); und (3) Umfangreiche SEC Waschen unter Verwendung von Lösungsmitteln. Die Strömung des rationalisierte SEC Extraktionsprozess in Abbildung 1 A dargestellt wird . - Ich Kurz gesagt beinhaltet das Verfahren einen Entfettungsschritt mit Aceton unter Rückfluß für 6 Stunden bei 50 ° C und die entfettet Sporen wurden dann über Nacht in einem Abzug getrocknet Rest zu entfernen Aceton. unter Verwendung von Phosphorsäure für 30 h Die entfettet Sporen wurden Acidolyse unterworfen. Während Acidolyse die Mehrzahl der sporoplasmic Materialien werden gelöst und dann während des Vakuumfiltrationsschritt entfernt. Um Rest sporoplasmic Materialien eine umfangreiche Reihe von Waschschritten unter Verwendung von Lösungsmitteln zu entfernen, Säure, Base und Wasser durchgeführt wird. Die SECs wurden zunächst für 24 h bei RT getrocknet und weiter bei 60 ° C getrocknet und 1 mbar Vakuum 10 h Restlösemittel und Feuchtigkeit zu entfernen.
Wie in Abbildung 1 gezeigt, alle Extraktion SEC Schritte wurden in einem Abzug mit einer Gefahr Ankündigung durchgeführt. Während SEC Extraktion wird ca. 70% Masseverlust beobachtet aufgrund der Entfernung von sporoplasmic Materialien und unsere Daten steht im Einklang mit bestehenden Berichten der Produktion von sauberen und intakten SECs. 7, 19,20,29 Die optimierten Prozess von der anfänglichen Entfettung Schritt bis zum Endprodukt wird in etwa 5 Tage und das Verfahren mit den entsprechenden Sicherheitskontrollen können einfach skaliert bis zu 1 kg Labormaßstab Charge abgeschlossen.
Encapsulation Schritte SECs präsentiert in Abbildung 1 J Verwendung - M, das sind vorteilhaft , da auf einfachen Schritten ohne involving harte organische Lösungsmittel oder mechanische Scherkräfte erfordern. 7 Unsere Verkapselung Experimente beinhalten 150 mg SECs und eine Beladung ausreichend Lösungsvolumen durch die SECs für die Aufnahme. Die Beladung in diesen SECs wird durch Verbindung Löslichkeit in ausgewählten wässrigen oder organischen Lösungsmitteln beschränkt und Belastung kann durch eine der drei Lade Methoden erreicht werden: passive, Kompressions- und Vakuumbelastung. Jedoch stellt Vakuumbelastung relativ höhere Verkapselung von Verbindungen. 7, 19,20
Die physikalisch - chemischen Charakterisierungen von Sporopollenin Exine Kapseln
Um die Sauberkeit der SECs erzeugt bestimmen , indem die optimierten Prozess in Abbildung 1 dargestellt verwendet, die Oberfläche und Querschnittsmorphologie, Micromeritic Eigenschaften und elementare Zusammensetzung wurden in den verschiedenen Phasen des SEC - Extraktionsverfahren untersucht. Wie gezeigt inFigur 2 zeigen die REM - Aufnahmen intakten Sporen mit einer einzigartigen Mikrostruktur, und vor der Verarbeitung im Mikrometermaßstab sporoplasmic Organellen wurden in dem Querschnittsbild beobachtet. Mit Spore Entfettung und Alkalibehandlung keine morphologischen und strukturellen Veränderungen wurden neben dem Aufreißen der sporoplasmic Organellen beobachtet.
Figur 3 zeigt REM - Aufnahmen von SECs nach Acidolyse Phosphorsäure zu verschiedenen Zeitpunkten von 5 h bis 30 h unter Verwendung. Diese Ergebnisse unterstützen, die für bis zu 30 Stunden Acidolyse bietet intakt und sauber SECs ohne sporoplasmic Materialien. Um 29 Restproteinhaltiges Material, CHN - Elementaranalyse zur Bestätigung wurde durchgeführt , und die Daten werden in Abbildung 4 Diese Ergebnisse liefern einen Leitfaden für die Auswahl der besten Verarbeitungsbedingungen zu erreichen , sauber und intakt SECs präsentiert. Im Fall von entfetteten und Alkali behandelt SECs keine wesentliche proteinischenMaterialabtrag beobachtet. Jedoch mit Acidolyse unter Verwendung von Phosphorsäure, die Mehrzahl von proteinhaltigen Materialien wird in 30 Stunden entfernt, und keine weitere Reduktion wird mit zunehmender Prozesszeit bis zu 120 Stunden beobachtet. Die elementare Daten mit früheren Berichten über erweiterte Verarbeitung von SECs 7,11 und mit kommerziellen SECs konsistent.
Micromeritic Eigenschaften wurden durch dynamische Bildpartikelanalyse (DIPA) analysiert und die Ergebnisse sind in Abbildung 5 Diese Ergebnisse unterstützen die einheitliche Größenverteilung von SECs nach Acidolyse präsentiert für bis zu 30 Stunden, mit einer Größe von 31,0 ± 2,2 & mgr; m. Im Gegensatz dazu nimmt strukturelle Integrität SEC mit längerer Acidolyse und beginnt deutliche Fragmentierung der SECs über 30 Stunden Behandlungsdauer zu verursachen.
Abbildung 6 zeigt die SEM und DIPA Daten für SECs hergestellt mit nur Acidolyse Proarbeitung für 30 Stunden unter Verwendung von Phosphorsäure. Diese Ergebnisse bestätigen, dass nach dem Entfettungsschritt, Acidolyse produziert saubere und intakte SECs mit einer einheitlichen Größenverteilung von 32,5 ± 2,7 & mgr; m. Acidolyse-only SECs haben eine Restproteingehalt von nur 0,15 ± 0,0%, bestimmt in Bezug auf% Stickstoffgehalt, 11 , die mit SECs vergleichbar ist , hergestellt durch Alkali und Acidolyse Behandlung wie oben und mit früheren Berichten beschrieben hat . 7
Die Mikroverkapselung mit Sporopollenin Exine Kapseln
Um die Verwendung von L. nachweisen clavatum SECs mit dem Acidolyse-only - Verfahren hergestellt, Mikroverkapselung Experimente wurden unter Verwendung von BSA als Modellprotein durchgeführt. Die Beladung in SECs wurde unter Verwendung einer Vakuumbeladungstechnik unter Verwendung von 150 mg SECs und 1,2 ml 125 mg / ml BSA erreicht. Figur 7 zeigt die CLSM imAlter SECs vor und nach der Acidolyse-only-Verarbeitung und mit FITC-BSA-Kapselung. Die Daten zeigen, dass unbehandelte SECs weisen Autofluoreszenz aufgrund des Vorhandenseins von sporoplasm Bestandteile innerhalb der Spore Höhle. Doch nach Acidolyse-only-Verarbeitung, alle sporoplasmic Inhalte ergeben sich in einem leeren inneren Hohlraum entfernt. Es fällt auf , nach der Einkapselung von FITC-BSA wird grüne Fluoreszenz im Inneren des SECs beobachtet, in SECs die Einkapselung des Modellproteins bestätigt. 19,20,41
Ferner wurden durchgeführt , um die morphologischen Veränderungen und Micromeritic Eigenschaften von BSA belasteten SECs, SEM und DIPA - Analyse untersucht , und die Daten in Abbildung 8 dargestellt. Die SEM - Bilder der Anwesenheit von intakten und sauber microridges nach BSA - Beladung zu bestätigen. Darüber hinaus wurden im Durchmesser, Kreisförmigkeit, und das Seitenverhältnis nach dem Laden in BSA SECs keine wesentlichen Veränderungen beobachtet. Diese Daten sind consistent mit früheren Berichten über die Verkapselung von Wirkstoffen mit SECs. 7.10
Zur Quantifizierung wurde die Menge an verkapseltem BSA, BSA 5 mg BSA-beladenen SECs extrahiert, und die Daten sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Daten zeigen , 0,170 ± 0,01 g BSA - Beladung pro Gramm SECs. Insgesamt bestätigen die REM - Aufnahme, DIPA, CLSM und Quantifizierung von BSA durch Spektralanalyse, die erfolgreiche Verkapselung von BSA in L. clavatum SECs und morphologische Stabilität SEC.
Abbildung 1. Optimiertes Extraktionsverfahren für L. clavatum Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). (A) unbehandelte Sporen. (B) Spore Entfettung mit einem Rückfluss Set-up bei 50 ° C für 6 Stunden. (C) Lösemittelfiltration und sammeln Ionen von entfetteten Sporen. (D) Trocknen des entfetteten Sporen bei Raumtemperatur. (E) Spore Acidolyse in Kolben PTFE 85% (v / v) Phosphorsäure bei 70 ° C für 30 Stunden verwendet wird . (F) Säure Filtration unter Verwendung von Vakuumfiltration set-up. (G) SEC Waschen eine Reihe von Wasser, Säure, Base und Lösungsmittel Waschschritte. (H) SEC Trocknung Vakuumofen bei 60 ° C und 1 mbar Vakuum für 10 h. (I) intakt, sauber und SECs als Endprodukt getrocknet. (J) Mischen von SECs und BSA - Lösung. (K) Homogenisieren von SECs und BSA - Lösung. (L) Vakuum - Laden von BSA in SECs. (M) BSA-loaded SECs. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopische Analyse von L. clavatum Spores während verschiedener Phasen der Pre-Säure - Behandlung. (A) Unbehandelte Sporen zeigt sporoplasmic Zellorganellen und Biomolekülen. (B) Aceton behandelt Sporen sporoplasmic Inhalt gestört zeigt. (C) & (D) Alkali behandelt Sporen Entfernung von sporoplasmic Inhalte zeigt und faltig interne cellulosischen intine Schicht. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Rasterelektronenmikroskopische Analyse von L. clavatum Spores während verschiedener Phasen der SäureBehandlung 5-30 hr (A - D). Beziehungsweise, 5, 10, 20 und 30 h Säure behandelt Sporen intakte externe Mikrostruktur und sauberen inneren Hohlraum zeigt. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Proteingehalt von Sporen und Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). Der Proteingehalt nach verschiedenen Stadien der Behandlung. Daten repräsentiert ist ein Durchschnitt von Dreifachmessungen mit einer Standardabweichung (n = 3). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version o anzuzeigenf dieser Figur.
Abbildung 5. Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) von Sporen und Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) in verschiedenen Stadien der Behandlung Spalten (A - C). Sind jeweils vorgeSäureBehandlung, Säurebehandlung, und intakte SECs. Plots sind repräsentative graphische Darstellungen von SEC Durchmesser, Zirkularität, Seitenverhältnis und Kantengradient. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) von 30 h Acidolysis-only Sporopollenin Exine Kapseln (Sekunden). (A) SECs intakte externe Mikrostruktur und sauberen inneren Hohlraum zeigt. (B) Repräsentative graphische Darstellungen von SEC Durchmesser, Kreisförmigkeit und Seitenverhältnis. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) Analyse von Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) vor und nach der Behandlung und BSA Encapsulation. Die erste Reihe zeigt unbehandelten Sporen sporoplasmic zelluläre Organell und Biomolekül Autofluoreszenz zeigt. Die zweite Reihe zeigt 30 Stunden Acidolyse-only SECs mit einem leeren inneren Hohlraum. Die dritte Reihe zeigt FITC-BSA geladenin 30 Stunden Acidolyse-only SECs. (Maßstabsbalken sind 10 & mgr; m). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) Charakterisierung von BSA-beladenen Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). (A) REM - Aufnahmen von BSA-loaded SECs. (B) Repräsentative graphische Darstellungen von BSA-beladenen SEC Durchmesser, Zirkularität, Seitenverhältnis und Kantengradient. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Verkapselung von Rinderserumalbumin (BSA) in unbehandeltem Spores und SECs. Volumen der BSA-Lösung für die Beladung pro 150 mg Charge von "unbehandelte Sporen" oder "SECs 'verwendet. Daten repräsentiert ist ein Durchschnitt von dreifachen Chargen mit Standardabweichung (n = 3). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten.
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Discussion
In dieser Arbeit wird eine systematische Analyse der SEC - Extraktion aus L. clavatum Sporen präsentiert und dieser Bericht zeigt , dass es möglich ist , eine höhere Qualität Kapseln zu produzieren , während auch eine deutliche Straffung der vorbestehenden häufigsten verwendete Protokoll zu erreichen. 11 Im Gegensatz zu dem bestehenden Protokoll eine hohe Prozesstemperatur erforderlich ist (180 ° C) und eine lange Prozessdauer (7 Tage), 11 die aktuelle Optimierungs wurde SEC - Extraktionsverarbeitung in erster Linie auf die Verringerung der Temperatur und die Dauer der Acidolyse Schritt konzentriert.
Die Entfettung und Alkalibehandlungen bieten minimale Entfernung von sporoplasmic Material von Sporen. Allerdings Acidolyse von 5 h bis 120 h die maximale Menge des sporoplasmic Material entfernt. Die Ergebnisse zeigten , dass die Gesamtbearbeitungsdauer und Temperaturen könnten drastisch von herkömmlichen Techniken reduziert werden, 11 und , dass nur 30 Stunden in mäßiger Temperatur (70° C) zur Verfügung gestellt Phosphorsäure die optimale Qualität Kapseln. Auch über 30 h Acidolyse, wurde gefunden, daß die SECs begann zu brechen und eine signifikante Erhöhung der Partikelfragmente beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die gesamte Charge von SECs kann eine Verringerung der gesamten strukturellen Integrität ausstellen. Außerdem sollte beachtet werden , daß L. clavatum wird als vergleichsweise robust Sporopollenin umfassen, 2 und daß die spezifischen Verfahrensbedingungen in diesem Protokoll beteiligt sind , wie Säurekonzentration, der Temperatur und / oder Hydrolyse Dauer benötigen kann für andere Arten Pollen angepasst werden.
Es wurde , dass die Produktion von SECs gezeigt durch Acidolyse-nur unter Verwendung von Phosphorsäure (85% v / v) für 30 h Ausbeuten sauber und intakt SECs. 41 Die Daten bestätigen , dass Acidolyse der entscheidende Schritt in SEC - Produktion ist. Schließlich wurden die säure nur SECs zur Verkapselung von BSA und ein hoher Beladungsgrad verwendet wurde beobachtet. Die Beladung wwie bei der Anwendung eines Vakuums erreicht, wobei der Innendruck SEC Hohlraums verändert wird, um zwangsweise die BSA-Lösung in die leeren Kapseln zeichnen. Nanokanäle (dia . 15 - 20 nm), die in den Wänden der exine L. zuvor identifiziert wurden , clavatum, 7 lassen Sie die Lösung in den großen inneren Hohlraum zu gelangen. Nach dem Beladen wurden die Kapseln gewaschen und in einem Gefriertrockner getrocknet, um ein freifließendes Pulver zu ergeben.
Größeneinheitlichkeit und morphologischen Eigenschaften sind wichtige Faktoren für die Beurteilung der Qualität eines erfolgreichen Verkapselungsmaterial. Die beobachtete einheitliche Größe und intakte Morphologie von BSA belasteten SECs bestätigt das Potenzial Nutzung von Acidolyse-only verarbeitet SECs für Mikroverkapselung Anwendungen.
Diese Ergebnisse sind wichtig für die großtechnische Produktion von SECs und zum Stimulieren größeres Interesse an der möglichen Anwendungen der SECs in die Mikroverkapselung von Arzneistoffen,Proteine, Peptide, Nahrungsergänzungsmittel, Nutraceuticals und Kosmetik.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lycopodium clavatum spores (s-type) | Sigma | 19108-500G-F | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | |
| FITC-conjugated BSA | Sigma | A9771-250MG | |
| Phosphoric acid (85% w/v) | Sigma | 438081-2.5L | |
| Hydrochloric acid | Sigma | V800202 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-1KG | |
| Acetone | Sigma | V800022 | |
| Ethanol | AcME | C000356 | |
| Deionized water | Millipore purified water | ||
| Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose) | |||
| Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm) | Thermoscientific (CA, USA) | 4250A | |
| Vectashield | Vector labs (CA, USA) | H-1000 | |
| Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide | Ibidi GmbH (Munich, Germany) | 10812 | |
| Commercial Lycopodium SECs (L-type) | Polysciences, Inc. (PA, USA) | 16867-1 | |
| Heating plates | IKA, Germany | ||
| Scanning electron microscope | Jeol, Japan | JFC-1600 | |
| Elemental analyzer | Elementar, Germany | VarioEL III | |
| FlowCam: The benchtop system | Fluid Imaging Technologies, USA | FlowCamVS | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Germany | LSM710 | |
| Freeze dryer | Labconco, USA | ||
| UV Spectrometer | Boeco, Germany | S220 |
References
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