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Bioengineering

Cápsulas à base de plantas de extração de para aplicações de microencapsulação

Published: November 9, 2016 doi: 10.3791/54768
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Este protocolo / manuscrito descreve um processo simplificado para a produção de cápsulas exinas esporopolenina (segundos) a partir de esporos clavatum Lycopodium e para o carregamento de compostos hidrofílicos para estes segundos.

Abstract

Microcápsulas derivados de esporos ou pólen à base de plantas fornecem uma plataforma robusta para uma gama diversificada de aplicações de microencapsulação. cápsulas esporopolenina exinas (segs) são obtidos quando os esporos ou pólen são processados ​​de modo a remover o conteúdo sporoplasmic internos. As microcápsulas ocas resultantes exibem um elevado grau de uniformidade micromerítica e reter características microestruturais intrincados relacionados com as espécies de plantas particulares. Aqui, demonstramos um processo simplificado para a produção de s a partir de esporos clavatum Lycopodium e para o carregamento de compostos hidrofílicos para estes segundos. O actual procedimento de isolamento SEC foi optimizado recentemente para reduzir significativamente os requisitos de processamento que são convencionalmente utilizados no isolamento SEC, e para assegurar a produção de microcápsulas intactas. Natural L. clavatum esporos são desengordurado com acetona, tratou-se com ácido fosfórico, e extensivamente lavadas para remover sporoplasmiconteúdo c. Depois de desengorduramento acetona, um único passo de processamento usando 85% de ácido fosfórico tem sido demonstrado para remover todo o conteúdo sporoplasmic. Ao limitar o tempo de processamento ácido para 30 horas, é possível isolar SECs limpas e evitar SEC fractura, o que tem sido demonstrado que ocorre com o tempo de processamento prolongado. lavagem extensiva com água, ácidos diluídos, diluir bases e solventes garante que todos os materiais e produtos químicos resíduos sporoplasmic são adequadamente removidos. A técnica de carga de vácuo é utilizada para carregar uma proteína modelo (Albumina de Soro Bovino) como um composto representativo hidrofílico. carregamento de vácuo proporciona uma técnica simples para carregar vários compostos, sem a necessidade de solventes agressivos ou produtos químicos indesejáveis ​​que são frequentemente necessários em outros protocolos de microencapsulação. Com base nestes protocolos de isolamento e de carregamento, segs proporcionar um material promissor para uso em uma grande variedade de aplicações de microencapsulação, tais como, agentes terapêuticos, alimentos, cosméticos, de cuidados pessoais e proddutos.

Introduction

Existe um interesse significativo em cápsulas à base de plantas naturais, obtidos a partir de esporos de plantas e pólens para uso em aplicações de microencapsulação. 15/01 Na natureza, esporos e pólen proporcionar uma protecção para os materiais genéticos sensíveis contra condições ambientais adversas. A estrutura básica de esporos de plantas e do pólen compreende, tipicamente, uma camada de invólucro exterior (exina), uma camada de invólucro interior (intina), e o material citoplasmático interno. A exina é composta de um biopolímero quimicamente robusto 1,9,10,13,16 referido como esporopolenina eo intina é composta principalmente de materiais celulósicos. 16-18 cápsulas vazias podem ser isoladas por vários processos para a remoção de material de 7,9 citoplasmática , proteínas, e a camada intine. 2,12,16 Estas cápsulas exinas esporopolenina (segundos) fornecer uma alternativa atraente para encapsulantes sintéticos devido à sua distribuição de tamanho estreita e morfologia uniforme. 7,9,13,19,20 adesenvolvimento de processos padronizados para a obtenção de s a partir de várias espécies de plantas, tais como Licopódio clavatum, abre a possibilidade de uma vasta gama de aplicações de microencapsulação nos campos de entrega de drogas, alimentos, cosméticos e 6,10-13,21.

A fim de obter SECs, investigadores trataram primeiro os esporos e pólen com solventes orgânicos e submetida a refluxo em soluções alcalinas para remover o conteúdo citoplasmático. 22-25 No entanto, a estrutura da cápsula remanescente foi determinada para conter ainda o intina camada celulósica. A fim de eliminar isto, os investigadores exploraram a utilização do tratamento de hidrólise ácida prolongada utilizando ácido clorídrico, ácido sulfúrico quente, ou ácido fosfórico quente ao longo de vários dias, 22-25 com ácido fosfórico a tornar-se o método preferido de remoção intina SEC. 2 No entanto, em curso investigação ao longo dos anos tem mostrado que vários esporos e pólenes têm diferentes graus de resistência à dura me processarthods comumente usados. 26,27 Alguns esporos e pólenes são completamente degradada e perder toda a integridade estrutural em soluções alcalinas fortes, ou tornar-se fortemente danificada em soluções ácidas fortes. 16 A variabilidade na resposta SEC para condições de tratamento é devido a variações sutis na química estrutura e morfologia do material de exina esporopolenina exina entre espécies. 28 Devido à variabilidade na robustez de cápsulas exinas esporopolenina (segundos), é necessário optimizar as condições de processamento para cada espécie de esporos e pólen.

Esporos de plantas da espécie L. clavatum tornaram-se a única fonte mais amplamente estudado da SCEE. Propõe-se que isto é principalmente devido à sua ampla disponibilidade, baixo custo, monodispersity, robustez e química 9,29 Os esporos podem ser facilmente colhidas e conter conteúdo sporoplasmic sob a forma de agrupamentos de 1 -. 2 uM organelos celulares e biomolecules. 11 L. clavatum esporos foram usados como um lubrificante em pó natural, 30,31 base para cosméticos, 30 e 32-36 em fitoterapia para uma ampla gama de aplicações terapêuticas. O SCEE obtidos a partir de L. clavatum foram mostrados para ser mais resistente ao processamento de SECs de outras espécies de esporos e pólen. 2 Após o processamento, as SECs resultantes foram mostrados para manter suas estruturas microridge intrincados e alta uniformidade morfológica, proporcionando uma grande cavidade interna para encapsulamento. 7 estudos indicam que o L. SECs clavatum podem ser utilizados para a encapsulação de fármacos, vacinas, 10,13 11 proteínas, células, 8 7,14 óleos, 5-7,9 e suplementos alimentares. 5,15 observadas eficiências de carregamento SEC são relativamente elevadas em comparação com convencional materiais de encapsulamento. 7 Há também um certo número de benefícios relatadosSEC para encapsulação, tais como a capacidade de mascarar o gosto, 6,10 e para proporcionar um certo grau de protecção natural contra a oxidação. 12 Nos estudos existentes, o método de extracção mais utilizada SEC para L. clavatum baseia-se em quatro etapas principais. O primeiro passo é de refluxo do solvente em acetona durante até 12 h a 50 ° C para secar os esporos. 11 O segundo passo é a refluxo alcalina em hidróxido de potássio a 6% durante até 12 h a 120 ° C para remover citoplasmática e materiais proteicos. 11 Passo três é a refluxo ácido em ácido fosfórico a 85% durante 7 dias a 180 ° C para remover o material intina celulósico. 11 Passo quatro é um processo de lavagem exaustiva utilizando água, solventes, ácidos e bases para remover todo o material não-exina restante e resíduos químicos.

Os principais objetivos da extração SEC em relação a aplicações de encapsulamento são para produzir cápsulas que estão vazios de material citoplasmático, livre from proteínas potencialmente alergênicas, e morfologicamente intactos. 2,37 No entanto, do ponto de vista de produção industrial, também é importante considerar factores económicos e ambientais adicionais, tais como, a eficiência energética, a duração de produção, segurança e resíduos resultantes. No que se refere à eficiência de energia, ambas as altas temperaturas e tempos de processamento longos afecta os custos de produção, bem como o impacto ambiental. duração produção e tempo de resposta são factores-chave que influenciam a rentabilidade de processamento. Particularmente preocupante é que o processamento de ácido fosfórico de alta temperatura aumenta a questões de segurança e é conhecido por resultar em escamação corrosivo que leva a aumentos significativos na manutenção da infra-estrutura e atrasos em tempos de rotação lote 38-40. Sempre que possível, minimizando o número de passos necessários pode levar a redução significativa dos resíduos produzidos. No entanto, a normalmente utilizada processo de quatro passos de L. extração clavatum SEC tem simplesmente evolved de décadas de pesquisa e teve pouco otimização processo real. Recentemente, Mundargi et al., 41 fez uma contribuição significativa para os trabalhos em curso neste domínio, através da avaliação e otimização de uma das técnicas de extração SEC mais comumente reportados de forma sistemática.

Na primeira secção deste trabalho: desengorduramento de esporos é demonstrado utilizando processamento de acetona a 50 ° C durante 6 horas; sporoplasm procedimentos de remoção e intina são demonstradas utilizando processamento de ácido fosfórico a 85%, a 70 ° C durante 30 h; lavagem extensiva com água, solventes, ácido, e a base é utilizada para demonstrar a remoção de conteúdos sporoplasmic residuais; e SEC secagem é demonstrada utilizando secagem por convecção e vácuo secagem em estufa. Na terceira secção, SEC carregamento vácuo é demonstrada utilizando o carregamento de vácuo de um modelo de proteína, albumina de soro bovino (BSA), seguido de BSA-carregado-SEC lavagem e liofilização. Na quarta seção, a determinção da eficiência de encapsulamento de BSA é demonstrada utilizando centrifugação, a sonda de ultra-sons, e espectrometria de UV / Vis.

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Protocol

1. Extração de esporopolenina exina Cápsulas (segundos) a partir de L. clavatum Esporos

Nota: O processo de extração SEC envolve um pó inflamável (L. clavatum), ácidos corrosivos picantes, e solventes inflamáveis, equipamentos, portanto, adequada proteção individual (óculos de proteção, máscara, luvas, jaleco), avaliação de risco aprovada em uso e descarte de produtos químicos por pessoal de laboratório autorizado é essencial.

  1. Spore Desengordurante
    1. Prepara-se uma set-up refluxo numa câmara exaustora, utilizando um condensador de vidro, sistema de circulação de água, e banho de água (Figura 1).
    2. Pesar 100 g L. esporos clavatum sem criar poeira e longe de qualquer fonte de ignição.
      Nota: Os esporos aqui utilizados foram obtidos comercialmente (Veja Lista de Materiais).
    3. Transferência de esporos lentamente a uma de 1 L de politetrafluoretileno (PTFE) frasco de fundo redondo com uma barra de agitação magnética.
    4. Adicionar 500 ml de acetona para os esporos dobalão de PTFE e agitar suavemente o frasco para formar uma suspensão homogénea.
    5. Colocar o balão de PTFE no conjunto do banho de água a 50 ° C e conectar-se a um condensador de refluxo.
    6. Realizar a refluxo em acetona durante 6 horas com agitação a 200 rpm e, em seguida, deixa-se arrefecer à temperatura ambiente.
    7. Filtrar a suspensão, com papel de filtro sob vácuo e recolher os esporos desengordurados em grandes (15 cm de diâmetro) placas de petri de vidro.
    8. Secam-se os esporos à temperatura ambiente (hotte) por revestimento com folha de alumínio com furos para a evaporação do solvente.
  2. acid�ise
    1. Prepare a 85% (v / v) de ácido fosfórico com água desionizada (Dl) e transferir os esporos secos desengordurados para um balão de 1 L de PTFE.
    2. Adicionar 500 ml de ácido fosfórico (85% v / v) para os esporos desengordurados.
    3. Colocar o balão de PTFE em conjunto um banho de água a 70 ° C e conectar-se a um condensador de refluxo.
    4. Realizar refluxo suave (70 ° C) em ácido fosfórico durante 30 h e, em seguida, para permitiresfriar em temperatura ambiente.
    5. Diluir a suspensão utilizando água DI 500 ml quente e recolher os SECs por filtração a vácuo utilizando papel de filtro.
    6. Transferir a segundos para uma proveta de vidro de 3 L para executar uma série de lavagens.
  3. SEC lavar roupa
    1. Colocar a proveta de vidro de 3 L contendo SECs numa hotte.
    2. Adicionar (50 ° C) de água DI 800 ml quente para os SECs com agitação suave durante 10 min.
    3. Filtrar a suspensão usando papel de filtro e uma filtração a vácuo set-up.
    4. Recolher o SECs em 3 L copo de vidro limpo.
    5. Repita os passos 1.3.1. a 1.3.4. cinco vezes.
    6. Adicionar acetona 600 ml quente (45 ° C) para os SECs com agitação suave durante 10 min.
    7. Recolher os SECs por filtração sob vácuo e transferir os segundos para a 3 L copo de vidro limpo.
    8. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando-se 600 ml quente (50 ° C) de ácido clorídrico 2M.
    9. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando 600 ml hot (50 ° C) a 2 M de hidróxido de sódio.
    10. Repita os passos 1.3.1 e 1.3.4 oito vezes.
    11. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando-se 600 ml quente (45 ° C) de acetona.
    12. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando-se 600 ml quente (45 ° C) de etanol.
    13. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando 800 ml quente (50 ° C) de água DI.
    14. Transferir os SECs limpas para seis grandes placas de petri de vidro e seco numa hote à temperatura ambiente durante 24 horas para remover todo o conteúdo de água.
    15. Secam-se as SECs num forno de vácuo a 60 ° C e 1 mbar de vácuo durante 10 h ou até peso constante.
    16. Recolher o SECs seco e transferir para um frasco de polipropileno.
    17. Armazenar o SECs em um armário seco.

2. Caracterização do SECs

  1. Realizar electrónica de varrimento análise microscópica utilizando 41 esporos e SECs produzidas em diferentes fases.
  2. Realizar análise elementar 41 usando esporos e SECs produzidas em diferentes fases. DRY todas as amostras a 60 ° C durante pelo menos 1 hora antes da análise elementar e calcular o teor de proteína usando por cento de azoto, com um factor de multiplicação de 6,25. 11 obter resultados utilizando medições triplicadas para cada amostra.
  3. Realizar uma análise de propriedades micromerítica usando um analisador de imagem de partículas dinâmico. 41
  4. Digitalizar não transformados, processados e SECs FITC-BSA-carregados usando microscopia confocal de varredura a laser. 41

3. Biomacromolecule Encapsulation por vácuo Carregando Técnica

  1. Preparar 1,2 ml solução de 125 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) usando água Dl e transferir para um tubo de polipropileno de 50 ml.
  2. Pesar 150 mg de segundos e transferir para a solução de BSA.
  3. Vortex o tubo durante 10 minutos para formar uma solução homogénea.
  4. Cobrir o tubo com papel de filtro.
  5. Transferir o tubo para um frasco de secador por congelação e seco durante 4 horas com vácuo a 1 mbar.
  6. Execute as etapas de 3.1para 3,5. para três lotes independentes.
  7. Recolher o SECs BSA-carregado e remover os aglomerados usando um almofariz e pilão.
  8. Transfira os SECs BSA-carregados para um tubo de 50 ml e adicionar 2 ml de água DI para remover a BSA residual.
  9. Recolher os SECs por centrifugação a 4704 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
  10. Repetir a lavagem com água DI vez.
  11. Cubra o tubo contendo SECs BSA-carregado usando papel de filtro.
  12. Transferir os segundos para um congelador (-20 ° C) e congelar durante 1 h.
  13. Congelar secar o SECs, durante 24 horas e armazenar em um congelador até posterior caracterização.
  14. Prepare os SECs placebo sem BSA utilizando o mesmo processo que nos passos 3.1. a 3.13.
  15. Prepare os FITC-BSA SECs carregados usando o mesmo processo que nos passos 3.1. a 3.13.

4. Determinação da eficiência de encapsulação

  1. Pesar 5 mg de SECs BSA-carregados em 2 ml de tubos de polipropileno.
  2. Adicionar 1,4 ml de fosfate solução salina tamponada com pH 7,4 (PBS) e agitar com vortex durante 5 min.
  3. Sonda sonicar a suspensão a 40% de amplitude durante 3 ciclos de 10 seg.
  4. Filtrar a solução através de um filtro de 0,45 um de polietersulfona (PES).
  5. Realizar o mesmo procedimento tal como nos passos 4.1. para 4,4. usando SECs placebo.
  6. Medir a absorvância a 280 nm, utilizando placebo como um branco.
  7. Quantificar a quantidade de BSA encapsulada utilizando uma curva padrão de BSA (200 a 1000 ug / ml) em PBS 42.

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Representative Results

Processo de Extracção simplificado para esporopolenina exina Cápsulas

O L. extracção clavatum SEC foi conseguida por três etapas principais: (1) Desengordurante usando acetona; (2) acidólise com ácido fosfórico a 85% (v / v); e (3) lavagem SEC extensa utilização de solventes. O fluxo do processo de extracção SEC simplificado é apresentado na Figura 1 A -. I Resumidamente, o processo envolve um passo de desengorduramento com refluxo de acetona durante 6 horas a 50 ° C e os esporos desengorduradas foram em seguida secas durante a noite numa hotte para remover residuais acetona. Os esporos foram sujeitos a desengordurados acidólise usando ácido fosfórico durante 30 h. Durante acidólise a maioria dos materiais sporoplasmic são dissolvidos e, em seguida, removido durante o passo de filtração em vácuo. A fim de remover materiais residuais sporoplasmic uma extensa série de passos de lavagem com solventes, ácido, É realizada de base, e água. Os SECs foram secos inicialmente à temperatura ambiente durante 24 h e depois secos a 60 ° C e 1 mbar de vácuo durante 10 h para remover os solventes residuais e humidade.

Como mostrado na Figura 1, todos os passos de extracção da SEC foram realizadas num extractor de fumo com um aviso de perigo. Durante a extração SEC, cerca de perda de massa de 70% é observada devido à remoção de materiais sporoplasmic e nossos dados são consistentes com relatórios existentes de produção de SECs limpa e intacta. 7, 19,20,29 O processo racionalizado da etapa inicial desengorduramento para o produto final é concluída em cerca de 5 dias, e o processo pode ser facilmente aumentada para um lote de 1 kg de escala laboratorial com os controlos de segurança apropriadas.

Encapsulation passos utilizando SECs são apresentados na Figura 1 J - M, estes são vantajosos devido a serem passos sem involving solventes orgânicos agressivos ou exigindo forças de cisalhamento mecânicas. 7 Nossos experimentos encapsulamento envolvem 150 mg de segundos e um volume de solução de carga suficiente para a absorção pelos segundos. O carregamento nestas SECs é limitada pela solubilidade do composto em solventes aquosos ou orgânicos seleccionados, e de carregamento pode ser conseguido por qualquer um dos três métodos de carregamento: passivo, por compressão, e o carregamento de vácuo. No entanto, a carga de vácuo fornece relativamente mais elevada encapsulação de compostos. 7, 19,20

Caracterizações físico-químicas da esporopolenina exina Cápsulas

Para determinar a limpeza de SECs produzidos utilizando o processo simplificado apresentado na Figura 1, a morfologia da superfície e da secção transversal, propriedades micromerítica, e composição elementar foram examinados em diferentes fases do processo de extracção SEC. Como mostrado emA Figura 2, as imagens SEM indicam esporos intactas com uma microestrutura única, e antes do processamento, em escala mícron organelos sporoplasmic foram observadas na imagem em corte transversal. Com desengorduramento de esporos e do tratamento alcalino não há mudanças morfológicas e estruturais foram observados para além da ruptura das organelas sporoplasmic.

A Figura 3 mostra imagens de SEM de SECs após acidólise usando ácido fosfórico a vários pontos de tempo de 5 h a 30 h. Estes suporte resultados que acidólise por até 30 horas fornece SECs intactas e limpos desprovidos de materiais sporoplasmic. A fim de confirmar material proteico residual, análise elementar CHN 29 foi realizada e os dados estão apresentados na Figura 4. Estes resultados fornecem uma orientação para a escolha da melhor condição de processamento para conseguir SECs limpa e intacta. No caso de SECs desengordurada e alcalino tratada, não proteináceo substanciala remoção do material é observada. No entanto, com acidólise usando ácido fosfórico, a maior parte dos materiais proteicos é removido em 30 horas e não mais de redução é observado com o aumento do tempo de processo até 120 h. Os dados elemental é consistente com relatórios anteriores sobre o tratamento prolongado da SCEE 7,11 e com SECs comerciais.

Propriedades micromerítica foram analisados por análise de imagem dinâmico da partícula (DIPA) e os resultados são apresentados na Figura 5. Estes resultados apoiam a distribuição de tamanho uniforme de SECs após acidólise por até 30 horas, com um tamanho de 31,0 ± 2,2 uM. Em contraste, a integridade estrutural SEC diminui com acid�ise prolongada e começa a causar fragmentação significativa dos SECs além durações de tratamento de 30 h.

A Figura 6 mostra os dados de SEM e DIPA para SECs produzidos com apenas acidólise prócessamento utilizando ácido fosfórico durante 30 h. Estes resultados confirmam que, após o passo de desengorduramento, acidólise SECs produzida limpa e intacta, com uma distribuição uniforme de tamanho de 32,5 ± 2,7 uM. Acidólise-SECs apenas ter um teor de proteína residual de apenas 0,15 ± 0,0%, como determinado em relação ao teor de% de azoto, 11, que é comparável ao SECs produzidos por alcali e tratamento acidólise, como discutido acima e com relatos anteriores. 7

A microencapsulação utilizando esporopolenina exina Cápsulas

A fim de demonstrar a utilização de L. SECs clavatum produzidos utilizando o processo só de acidólise, experiências de microencapsulação foram realizadas utilizando BSA como proteína modelo. A carga em SECs foi conseguida usando uma técnica de carregamento utilizando vácuo 150 SECs mg e 1,2 ml de 125 mg / ml de BSA. A Figura 7 mostra a im CLSMidades de SECs antes e após o processamento somente acidólise e com FITC-BSA encapsulamento. Os dados indicam que a autofluorescência SECs não tratados apresentam devido à presença dos componentes de sporoplasm no interior da cavidade de esporos. No entanto, após o processamento somente acidólise, todos os conteúdos sporoplasmic são removidos resultando em uma cavidade interior vazio. Surpreendentemente, depois de encapsulamento de FITC-BSA, fluorescência verde é observado dentro do SECs, confirmando a encapsulação da proteína modelo em segundos. 19,20,41

Além disso, para investigar as alterações morfológicas e propriedades micromerítica de BSA-carregado SECs, SEM e análise DIPA foram realizados e os dados são apresentados na Figura 8. As imagens de MEV confirmar a presença das microssaliências intactas e limpas após carregamento de BSA. Além disso, não foram observadas alterações significativas no diâmetro, circularidade, e relação de aspecto após BSA de carga em segundos. Estes dados são consiste dont com relatórios anteriores sobre o encapsulamento de drogas usando SECs. 7,10

Para quantificar a quantidade de BSA encapsulada, BSA foi extraído a partir de 5 mg de BSA SECs-carregado, e os dados são apresentados na Tabela 1. Os dados indicam 0,170 ± 0,01 g de BSA de carga por grama de segundos. No geral, o SEM, DIPA, CLSM, e quantificação de BSA por análise espectrográfica, confirmar a encapsulação bem sucedida de BSA em L. SECs clavatum e estabilidade morfológica SEC.

figura 1
Figura 1. Processo simplificado Extração de L. clavatum esporopolenina exina Cápsulas (segundos). (A) os esporos não tratadas. (B) esporo desengorduramento usando um refluxo definir-se a 50 ° C durante 6 hr. (C) filtração do solvente e recolher ião de esporos desengordurados. (D) secagem dos esporos desengordurados à temperatura ambiente. (E) acidólise esporo em balão de PTFE utilizando 85% (v / v) de ácido fosfórico a 70 ° C durante 30 hr. de filtragem (F) Ácido usando filtração sob vácuo set-up. (L) SEC de lavagem usando uma série de água, ácido, base, e solventes passos de lavagem. (H) SEC secagem em forno de vácuo a 60 ° C e 1 mbar de vácuo durante 10 h. (I) intacta, limpo , e secou-se Segundos como um produto final. (J) de mistura de solução segundos e BSA. (K) Homogeneização da solução segundos e BSA. (L) de carregamento de vácuo de BSA em segundos. segundos (M) de BSA-carregados. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

54768 / 54768fig2.jpg "/>
Figura 2. Scanning Electron análise microscópica de L. clavatum Esporos durante as diferentes fases de pré-tratamento ácido. (A) esporos não tratados mostrando organelas celulares sporoplasmic e biomoléculas. (B) de acetona esporos tratados mostrando interrompidas conteúdos sporoplasmic. (C) e (D) Alkali tratados esporos mostrando remoção de conteúdos sporoplasmic e camada interna celulósico enrugada intine. Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Scanning Electron análise microscópica de L. clavatum Esporos durante as diferentes fases de ácidoO tratamento de 5 a 30 h (A - D). Respectivamente, 5, esporos tratadas com ácido 10, 20, e 30 h mostrando microestrutura externa intacta e cavidade interna limpo. Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Conteúdo de proteína de esporos e esporopolenina exina Cápsulas (segundos). O teor de proteína, após várias etapas de tratamento. Os dados representados são a média de medições em triplicado com um desvio padrão (n = 3). Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.

Figura 5
Figura 5. Dinâmica de Imagem Análise de partículas (DIPA) de esporos e esporopolenina exina Cápsulas (segundos) em várias fases de tratamento Colunas (A - C). São, respectivamente, o tratamento pré-ácido, tratamento com ácido, e SECs intactas. Parcelas são gráficos representativos de diâmetro SEC, circularidade, relação de aspecto, e um gradiente de borda. Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Dynamic imagem Análise de partículas (DIPA) de 30 hr AcidolySECs sis-only esporopolenina exina Cápsulas (segundos). (A) mostrando microestrutura externa intacta e cavidade interna limpa. (B) gráficos representativos de diâmetro SEC, circularidade, e relação de aspecto. Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) Análise de esporopolenina exina Cápsulas (segundos) antes e após o tratamento e BSA encapsulamento. A primeira linha descreve esporos não tratados mostrando organela celular sporoplasmic e autofluorescência biomolécula. A segunda linha mostra 30 h SECs somente acidólise com uma cavidade interior vazio. A terceira linha mostra FITC-BSA carregadoem 30 hr SECs somente acidólise. (As barras de escala são 10 uM). Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Dynamic imagem Análise de partículas (DIPA) Caracterização da BSA-carregados esporopolenina exina Cápsulas (segundos). Imagens (A) MEV de SECs BSA-carregado. (B) gráficos representativos de BSA-carregado diâmetro SEC, circularidade, relação de aspecto, e gradiente de bordo. Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material BSA a carga por lote (125 mg / ml) BSA em 5 mg segundos (mg) Quantidade de BSA carregado (g por g de segundos) esporos não tratados 0,6 ml 0,654 ± 0,05 0,131 ± 0,01 SECs 1,2 ml 0,831 ± 0,05 0,170 ± 0,01

Tabela 1. Encapsulação de Albumina de Soro Bovino (BSA) em não tratados Esporos e segundos. Volume de solução de BSA utilizado para o carregamento por 150 mg lote de 'esporos não tratados' ou 's'. Os dados representados são a média de lotes em triplicado com um desvio padrão (n = 3). Adaptado de 41 e usadas com permissão de relatórios científicos.

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Discussion

Neste trabalho, uma análise sistemática da extração SEC de L. esporos clavatum é apresentada e este relatório mostra que é possível produzir cápsulas de qualidade superiores, ao mesmo tempo alcançar uma simplificação significativa do pré-existente protocolo vulgarmente usado. 11 Em contraste com o protocolo já existente que requer uma temperatura elevada de processo (180 ° C) e uma longa duração do processo (7 dias), a corrente 11 SEC optimização processamento extracção foi focado principalmente na redução da temperatura e duração do passo de acidólise.

Os tratamentos desengordurantes alcalinos e fornecer remoção mínima de material sporoplasmic de esporos. No entanto, acidólise de 5 horas a 120 horas removida a quantidade máxima de material sporoplasmic. Os resultados indicaram que a duração total de processamento e as temperaturas podem ser drasticamente reduzidos a partir de técnicas convencionais, 11 e que apenas 30 h em temperatura moderada (70° C) de ácido fosfórico, desde que os cápsulas de qualidade óptimas. Além disso, para além de 30 h acidólise, verificou-se que o SECs começou a fracturar e foi observado um aumento significativo em fragmentos de partículas, o que sugere que todo o lote de SECs pode ser exibindo uma redução na integridade estrutural geral. Além disso, deve notar-se que o L. clavatum é considerado por compreender esporopolenina comparativamente robusto, 2 e que as condições de processamento específicos envolvidos neste protocolo, tais como, a concentração do ácido, temperatura, e / ou a duração da hidrólise, pode necessitar de ser ajustado para outras espécies de pólen.

Foi demonstrado que a produção de SECs por acidólise usando somente de ácido fosfórico (85% v / v) durante 30 hr produz limpa e intacta segundos. 41 Os dados confirmam que acidólise é o passo decisivo na produção de SEC. Finalmente, o ácido-SECs apenas foram utilizados para o encapsulamento de BSA e foi observado um elevado grau de carga. A carga Wcomo alcançado com a aplicação de um vácuo, pelo que a pressão interna da cavidade SEC é alterado para desenhar vigorosamente a solução de BSA para as cápsulas vazias. Nanocanais (dia. 15 - 20 nm), que tenham sido previamente identificados nas paredes exinas de L. clavatum, 7 permitem que a solução entre na grande cavidade interna. Após o carregamento, as cápsulas foram lavadas e secas num liofilizador para se obter um pó de escoamento livre.

Tamanho uniformidade e características morfológicas são fatores importantes para avaliar a qualidade de um material de encapsulamento de sucesso. A uniformidade de tamanho e morfologia observada intacta de SECs BSA-carregado confirmou o uso potencial de SECs acidólise-tratados unicamente para aplicações de microencapsulação.

Estes resultados são importantes para a produção industrial de SECs em grande escala e para estimular um maior interesse nos potenciais aplicações da SCEE na microencapsulação de drogas,proteínas, péptidos, suplementos alimentares, nutracêuticos, e cosméticos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

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References

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Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

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