Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udvinding af Plant-baserede Kapsler til Microencapsulation Applications

Published: November 9, 2016 doi: 10.3791/54768
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2Centre for Biomimetic Sensor Science, Nanyang Technological University, 3School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Denne protokol / manuskript beskriver en strømlinet proces til fremstilling af sporopollenin exine kapsler (sek) fra Lycopodium clavatum sporer og til lastning af hydrofile forbindelser i disse sek.

Abstract

Mikrokapsler afledt af plantebaserede sporer eller pollen giver en robust platform for en bred vifte af mikroindkapslingsmetoder applikationer. Sporopollenin exine kapsler (sek) opnås, når sporer eller pollen bearbejdes for at fjerne de interne sporoplasmic indhold. De resulterende hule mikrokapsler udviser en høj grad af micromeritic ensartethed og fastholde indviklede mikrostrukturelle funktioner i forbindelse med de særlige plantearter. Heri demonstrerer vi en strømlinet proces til produktion af sek fra Lycopodium clavatum sporer og til lastning af hydrofile forbindelser i disse sek. Den nuværende isolation procedure SEC er for nylig blevet optimeret til at reducere de forarbejdninger, som konventionelt anvendes i SEC isolation, og for at sikre produktionen af ​​intakte mikrokapsler. Naturlig L. clavatum sporer affedtet med acetone, behandlet med phosphorsyre, og ekstensivt vaskes til fjernelse sporoplasmic indhold. Efter acetone affedtning, har et enkelt procestrin ved hjælp 85% fosforsyre vist sig at fjerne alle sporoplasmic indhold. Ved at begrænse den sure processortid til 30 timer, er det muligt at isolere rene sek og undgå SEC frakturering, som er blevet vist at forekomme med forlænget behandlingstid. Omfattende vask med vand, fortyndet syre, fortyndet baser, og opløsningsmidler sikrer, at alle sporoplasmic materiale- og kemiske rester er tilstrækkeligt fjernet. Vakuumet fyldningsteknik anvendes til at indlæse en model protein (bovint serumalbumin) som en repræsentativ hydrofil forbindelse. Vakuum loading giver en enkel teknik til at indlæse forskellige forbindelser uden behov for skrappe opløsningsmidler eller uønskede kemikalier, som ofte er nødvendige i andre mikroindkapsling protokoller. Baseret på disse isolation og lastning protokoller, Sek give en lovende materiale til brug i en bred vifte af mikroindkapslingsmetoder applikationer, såsom, terapi, fødevarer, kosmetik og personlig pleje proddukter.

Introduction

Der er en betydelig interesse i naturlige plante-baserede kapsler fremstillet af vegetabilske sporer og pollen til anvendelse i mikroindkapsling applikationer. 1-15 I naturen sporer og pollen yde beskyttelse til følsomme genetiske materialer mod barske miljøforhold. Den grundlæggende struktur af plante sporer og pollen omfatter typisk en ydre skal lag (exine), en indre skal lag (intine), og den indre cytoplasmatiske materiale. Den exine består af en kemisk robust biopolymer 1,9,10,13,16 benævnt sporopollenin og intine består primært af cellulosematerialer. 16-18 tomme kapsler kan isoleres ved forskellige fremgangsmåder 7,9 til fjernelse af cytoplasmatisk materiale , proteiner og den intine lag. 2,12,16 Disse sporopollenin exine kapsler (sek) give en overbevisende alternativ til syntetiske indkapslinger grund af deres snæver størrelsesfordeling og ensartet morfologi. 7,9,13,19,20 denudvikling af standardiserede processer for at opnå sek fra forskellige plantearter, såsom Lycopodium clavatum, åbner mulighed for en bred vifte af mikroindkapsling applikationer inden for områderne lægemiddelafgivelsessystemer, fødevarer og kosmetik. 6,10-13,21

For at opnå Sek, forskere først behandlet sporer og pollen med organiske opløsningsmidler og tilbagesvalet i alkaliske opløsninger for at fjerne cytoplasmiske indhold. 22-25 blev imidlertid den resterende kapsel struktur bestemmes til stadig indeholde den celluloseholdige intine lag. For at fjerne denne, forskere undersøgt brugen af forlænget sur hydrolyse forarbejdning under anvendelse af saltsyre, varm svovlsyre, eller varm phosphorsyre over flere dage, 22-25 med phosphorsyre blive den foretrukne fremgangsmåde til SEC intine fjernelse. 2 Dog igangværende forskning gennem årene har vist, at forskellige sporer og pollen har forskellige grader af modstandsdygtighed over for den barske behandling migthods almindeligt anvendt. 26,27 Nogle sporer og pollen er helt nedbrudt og miste alle strukturelle integritet i stærke alkaliske opløsninger, eller bliver stærkt beskadiget i stærke sure opløsninger. 16 Variabiliteten i SEC respons på behandling betingelser skyldes subtile variationer i den kemiske struktur og exine morfologi sporopollenin exine materiale mellem arterne. 28 på grund af variabilitet i robusthed sporopollenin exine kapsler (sek), er det nødvendigt at optimere betingelser for databehandling på hver art spore og pollen.

Plant sporer fra arterne L. clavatum er blevet den mest undersøgte enkelt kilde sek. Det foreslås, at dette er primært på grund af sin udbredte tilgængelighed, lave omkostninger, monodispersitet, og kemisk robusthed 9,29 Sporerne kan let høstes og indeholder sporoplasmic indhold i form af grupperinger af 1 -. 2 um cellulære organeller og Biomolecules. 11 L. clavatum sporer er blevet anvendt som en naturlig pulver smøremiddel, 30,31 en base for kosmetik, 30 og i urtemedicin 32-36 for en lang række terapeutiske anvendelser. De Sek opnået fra L. clavatum har vist sig at være mere modstandsdygtig over for behandling end Sek fra andre arter af sporer og pollen. 2 Efter bearbejdning har de resulterende sek blevet vist at bevare deres indviklede microridge strukturer og høj morfologisk ensartethed og samtidig sikre et stort indre hulrum til indkapsling. 7 undersøgelser viser, at L. clavatum Sek kan bruges til indkapsling af lægemidler, 10,13 vacciner, 11 proteiner, 7,14 celler, 8 olier, 5-7,9 og kosttilskud. 5,15 Observerede SEK belastningseffektiviteter er relativt høje i forhold til traditionel indkapsling materialer. 7 Der er også en række rapporterede fordeletil SEC indkapsling såsom evnen til at maskere smag, 6,10 og for at tilvejebringe en vis grad af naturlig beskyttelse mod oxidation. 12 i eksisterende undersøgelser, den mest anvendte SEC ekstraktionsmetode for L. clavatum er baseret på fire hovedtrin. Trin et er solvent tilbagesvaling i acetone i op til 12 timer ved 50 ° C for at affedte sporerne. 11 Trin to er alkalisk tilbagesvaling i 6% kaliumhydroxid i op til 12 timer ved 120 ° C til fjernelse cytoplasmatisk og proteinholdige materialer. 11 trin tre er syre tilbagesvaling i 85% phosphorsyre i op til 7 dage ved 180 ° C for at fjerne den celluloseholdige intine materiale. 11 Trin fire er en omfattende vaskeproces ved hjælp af vand, opløsningsmidler, syrer og baser til fjernelse af alle tilbageværende ikke-exine materiale og kemiske rester.

De vigtigste mål for SEC udvinding i forhold til indkapsling applikationer er at producere kapsler, der er tømt for cytoplasmatisk materiale, fri from potentielt allergifremkaldende proteiner, og morfologisk intakt. 2,37 Men fra en industriel produktion perspektiv, er det også vigtigt at overveje yderligere økonomiske og miljømæssige faktorer, såsom energieffektivitet, produktion varighed, sikkerhed, og deraf affald. Med hensyn til energieffektivitet, både høje temperaturer og lange behandlingstider påvirker produktionsomkostningerne samt miljømæssige fodaftryk. Produktion varighed og ekspeditionstid er centrale faktorer, der påvirker behandling rentabilitet. Af særlig bekymring er, at høj temperatur fosforsyre behandling øger sikkerhedsspørgsmål og er kendt for at resultere i ætsende skalering, som fører til betydelige stigninger i vedligeholdelse af infrastrukturen og forsinkelser i batch ekspeditionstider. 38-40 Hvor det er muligt, minimere antallet af nødvendige trin kan føre til en markant nedsættelse af affaldet produceres. Men det almindeligt anvendte fire-trins proces med L. clavatum SEC udvinding har simpelthen evolved fra årtiers forskning og har haft lidt faktiske procesoptimering. For nylig, Mundargi et al., 41 ydet et væsentligt bidrag til det igangværende arbejde på dette område ved systematisk at evaluere og optimere en af de mest almindeligt rapporterede SEC ekstraktionsteknikker.

I første del af denne undersøgelse: sporedannelse affedtning demonstreres ved anvendelse af acetone behandling ved 50 ° C i 6 timer; sporoplasm og intine fjernelse procedurer er påvist at udnytte 85% fosforsyre behandling ved 70 ° C i 30 timer; omfattende vask med vand, opløsningsmidler, syre, og basen anvendes til at demonstrere fjernelse af resterende sporoplasmic indhold; og SEC tørring demonstreres udnytte konvektion tørring og vakuum ovn tørring. I det tredje afsnit, er SEC vakuum loading demonstreret under anvendelse vakuum indlæsningen af ​​en model protein, bovint serumalbumin (BSA), efterfulgt af BSA-ladede-SEC vask og lyofilisering. I fjerde afsnit, i determination af BSA indkapslingseffektiviteten demonstreres ved anvendelse af centrifugering, probesonikering, og UV / Vis-spektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udvinding af Sporopollenin Exine Kapsler (sek) fra L. clavatum sporer

Bemærk: SEC udvinding proces involverer en brændbar pulver (L. clavatum), hot ætsende syrer, og brændbare opløsningsmidler, og derfor korrekt personlige værnemidler (beskyttelsesbriller, ansigtsmaske, handsker, kittel), vurdering godkendt risikoen på brug og bortskaffelse af kemikalier ved autoriserede laboratoriepersonale er afgørende.

  1. Spore affedtende
    1. Forbered et tilbagesvaling set-up i et stinkskab under anvendelse af en glas-kondensator, vand omsætning system, og vandbad (figur 1).
    2. Afvej 100 g L. clavatum sporer uden at skabe støv og væk fra enhver antændelseskilde.
      Bemærk: Sporerne her anvendte blev kommercielt opnået (se Materialer List).
    3. Overfør sporer langsomt til en 1 L polytetrafluorethylen (PTFE) rundbundet kolbe med en magnetisk rørepind.
    4. Tilsættes 500 ml acetone til sporerne iPTFE og kolben rystes kolben forsigtigt for at danne en homogen suspension.
    5. Anbring PTFE kolbe i vandbad indstillet på 50 ° C og forbindelse til tilbagesvaler.
    6. Udfør tilbagesvaling i acetone i 6 timer med omrøring ved 200 rpm og derefter lad det køle af ved stuetemperatur.
    7. Filtrer suspensionen op filtrerpapir under vakuum og indsamle det fedtfri sporer i store (15 cm diameter) glaspetriskåle.
    8. Tør sporerne ved stuetemperatur (stinkskab) ved at dække med aluminiumsfolie med huller til opløsningsmiddelafdampning.
  2. acidolyse
    1. Forbered 85% (v / v) phosphorsyre med deioniseret (DI) vand og overføre affedtede tørre sporer til en 1 L PTFE kolbe.
    2. Der tilsættes 500 ml phosphorsyre (85% v / v) til det fedtfri sporer.
    3. Anbring PTFE kolben i et vandbad indstillet på 70 ° C og forbindelse til tilbagesvaler.
    4. Udfør blid tilbagesvaling (70 ° C) i fosforsyre i 30 timer og derefter lader mankøligt ved stuetemperatur.
    5. Suspensionen fortyndes ved anvendelse af 500 ml varmt deioniseret vand og indsamle sekunder ved vakuumfiltrering under anvendelse af filtrerpapir.
    6. Overfør Sek til en 3 L bægerglas at udføre en række vaske.
  3. SEK Vask
    1. Placer 3 L bægerglas indeholdende Sek i et stinkskab.
    2. Tilføj 800 ml varm (50 ° C) DI vand til sek under forsigtig omrøring i 10 min.
    3. Filtrer suspensionen ved hjælp filtrerpapir og en vakuumfiltrering set-up.
    4. Opsaml Sek i en ren 3 L bægerglas.
    5. Gentag trin 1.3.1. til 1.3.4. fem gange.
    6. Tilsættes 600 ml varmt (45 ° C) acetone til sek under forsigtig omrøring i 10 min.
    7. Indsamle Sek ved filtrering under vakuum og overføre sekunder til et rent 3 L bægerglas.
    8. Gentag trin 1.3.6. og 1.3.7. anvendelse af 600 ml varmt (50 ° C) 2 M saltsyre.
    9. Gentag trin 1.3.6. og 1.3.7. anvendelse af 600 ml hot (50 ° C) 2 M natriumhydroxid.
    10. Gentag trin 1.3.1 og 1.3.4 otte gange.
    11. Gentag trin 1.3.6. og 1.3.7. anvendelse af 600 ml varmt (45 ° C) acetone.
    12. Gentag trin 1.3.6. og 1.3.7. anvendelse af 600 ml varmt (45 ° C) ethanol.
    13. Gentag trin 1.3.6. og 1.3.7. anvendelse af 800 ml varmt (50 ° C) deioniseret vand.
    14. Overfør de rene sek til seks store glas petriskåle og tørt i et stinkskab ved stuetemperatur i 24 timer for at fjerne alt vandindhold.
    15. Tør SECS i en vakuumovn ved 60 ° C og 1 mbar vakuum i 10 timer eller indtil konstant vægt.
    16. Saml den tørrede sek og overføre til en polypropylen flaske.
    17. Opbevar Sek tørt skab.

2. Karakterisering af SECS

  1. Udføre scanning elektronmikroskopisk analyse 41 ved hjælp af sporer og sek produceret på forskellige stadier.
  2. Udfør grundstofanalyse 41 ved hjælp af sporer og sek produceret på forskellige stadier. DRy alle prøver ved 60 ° C i mindst 1 time før elementaranalyse og beregne proteinindholdet ved hjælp procent nitrogen med en multiplikationsfaktor på 6,25. 11 Opnå resultater ved hjælp tredobbelte målinger for hver prøve.
  3. Foretage micromeritic egenskaber analyse under anvendelse af et dynamisk billede partikel analysator. 41
  4. Scan uforarbejdede, behandles og FITC-BSA-loaded sek hjælp konfokal laser scanning mikroskopi. 41

3. Biomacromolecule Indkapsling af Vacuum fyldningsteknik

  1. Forbered 1,2 ml 125 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) opløsning under anvendelse DI vand og overføres til et 50 ml polypropylenrør.
  2. Afvej 150 mg sek og overføre til BSA-opløsningen.
  3. Vortex røret i 10 minutter til dannelse af en homogen opløsning.
  4. Dæk rør under anvendelse filtrerpapir.
  5. Overfør røret til en frysetørrer kolbe og tørre i 4 timer med vakuum ved 1 mbar.
  6. Udfør trin 3.1til 3,5. for tre uafhængige batches.
  7. Opsaml BSA-loaded sek og fjern agglomeraterne ved anvendelse af en morter og støder.
  8. Overfør BSA-loaded sek til et 50 ml rør, og der tilsættes 2 ml DI vand for at fjerne det resterende BSA.
  9. Saml Sek ved centrifugering ved 4704 xg i 5 min og kassér supernatanten.
  10. Bundfaldet vaskes med deioniseret vand en gang.
  11. Dæk rør indeholdende BSA-loaded sek ved hjælp filtrerpapir.
  12. Overfør Sek til en fryser (-20 ° C) og fryses i 1 time.
  13. Frys tørre sek i 24 timer og opbevares i en fryser indtil yderligere karakterisering.
  14. Forbered placebo sek uden BSA anvendelse af den samme fremgangsmåde som i trin 3.1. til 3.13.
  15. Forbered FITC-BSA lastede sek under anvendelse af samme procedure som i trin 3.1. til 3.13.

4. Bestemmelse af Indkapslingseffektivitet

  1. Afvejes 5 mg BSA-loaded sek i 2 ml polypropylen rør.
  2. Tilføj 1,4 ml phosphate saltvand, pH 7,4 (PBS) og vortex i 5 minutter.
  3. Probe sonikeres suspensionen ved 40% amplitude i 3 cyklusser på 10 sekunder.
  4. Opløsningen filtreres ved hjælp af en 0,45 um polyetersulfon (PES) filter.
  5. Udfør den samme procedure som i trin 4.1. til 4,4. hjælp placebo SECS.
  6. Absorbansen ved 280 nm ved hjælp af placebo som en tom.
  7. Kvantificere mængden af BSA indkapslet under anvendelse af en BSA-standardkurve (200 til 1.000 pg / ml) i PBS. 42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strømlinet Udvindingsproces for Sporopollenin Exine Kapsler

L. clavatum SEC ekstraktion blev opnået ved tre hovedtrin: (1) affedtning af anvendelse af acetone; (2) acidolyse under anvendelse phosphorsyre 85% (v / v); og (3) Omfattende SEC vask med opløsningsmidler. Strømmen af den strømlinede SEC ekstraktionsprocessen er præsenteret i figur 1 A -. Jeg Kort fortalt involverer fremgangsmåden en affedtende trin med acetone tilbagesvaling i 6 timer ved 50 ° C, og det fedtfri sporer blev derefter tørret natten over i et stinkskab for at fjerne resterende acetone. De affedtede sporer blev underkastet acidolyse under anvendelse phosphorsyre i 30 timer. Under acidolyse størstedelen af ​​sporoplasmic materialer opløses og fjernes derefter under vakuum filtreringen. For resterende sporoplasmic materialer en omfattende serie af vasketrin for at fjerne med opløsningsmidler, syre, Base, og vand udføres. De SECS blev indledningsvis tørret ved stuetemperatur i 24 timer og yderligere tørret ved 60 ° C og 1 mbar vakuum i 10 timer til fjernelse af resterende opløsningsmidler og fugt.

Som vist i figur 1, blev udført alle SEC ekstraktionstrin i et stinkskab med en fare varsel. Under SEC udvinding, ca. 70% massetab observeres på grund af fjernelsen af sporoplasmic materialer og vores data er i overensstemmelse med eksisterende rapporter om produktionen af rene og intakte sek. 7, 19,20,29 Den strømlinede proces fra den indledende affedtning trin til det endelige produkt er afsluttet i ca. 5 dage, og processen kan let skaleres op til en 1 kg laboratorieskala batch med passende sikkerhedskontroller.

Indkapsling trin udnytter sek er vist i Figur 1 J - M, disse er fordelagtige på grund af at være enkle trin uden involving barske organiske opløsningsmidler eller kræver forskydningskræfter mekaniske. 7 Vores indkapsling eksperimenter involverer 150 mg sek og en belastning løsning volumen tilstrækkelig til optagelse af sek. Lastning i disse sek begrænses af forbindelsen opløselighed i udvalgte vandige eller organiske opløsningsmidler, og belastning kan opnås ved enhver af tre fyldningsmetoder: passiv, kompression, og vakuum lastning. Imidlertid vakuum loading giver relativt højere indkapsling af forbindelser. 7, 19,20

Fysisk-kemiske beskrivelser af Sporopollenin Exine Kapsler

For at bestemme renholdelse af sek fremstillet ved anvendelse af den strømlinede proces beskrevet i figur 1, blev overfladen og tværsnit morfologi, micromeritic egenskaber, og grundstofsammensætningen undersøgt på forskellige stadier af SEC ekstraktionsprocessen. Som vist iFigur 2 SEM billeder indikerer intakte sporer med en unik mikrostruktur, og før forarbejdningen er micron skala sporoplasmic organeller observeret i tværsnit billede. Med spore affedtning og alkalibehandling blev der ikke observeret morfologiske og strukturelle ændringer bortset fra brud af de sporoplasmic organeller.

Figur 3 viser SEM billeder af Sek efter acidolyse under anvendelse phosphorsyre på forskellige tidspunkter fra 5 timer til 30 timer. Disse resultater understøtter, at syrelyse for op til 30 timer giver intakte og rene sek blottet for sporoplasmic materialer. For at bekræfte resterende proteinholdigt materiale blev CHN grundstofanalyse 29 udføres, og data er vist i figur 4. Disse resultater giver en rettesnor for at vælge den bedste behandling betingelse for at opnå rene og intakte sek. I tilfælde af affedtet og alkali behandlet Sek, ingen væsentlig proteinholdigematerialefjernelse overholdes. Men med acidolyse under anvendelse phosphorsyre, er størstedelen af ​​proteinholdige materialer fjernet i 30 timer og ingen yderligere reduktion observeres med stigende procestid op til 120 timer. Den elementære data er i overensstemmelse med tidligere rapporter om udvidet behandling af Sek 7,11 og med kommercielle sek.

Micromeritic egenskaber blev analyseret ved dynamisk billede partikel analyse (DIPA) og resultaterne er vist i figur 5. Disse resultater understøtter den ensartede størrelsesfordeling af Sek efter acidolyse i op til 30 timer, med en størrelse på 31,0 ± 2,2 um. I modsætning hertil SEC strukturel integritet falder med langvarig acidolyse og begynder at forårsage betydelig fragmentering af sek uden 30 timers behandling varigheder.

Figur 6 viser SEM og DIPA data for sek fremstillet med kun acidolyse probejde hjælp phosphorsyre i 30 timer. Disse resultater bekræfter, at efter affedtning trin, acidolyse produceret rene og intakte sekunder med en ensartet størrelsesfordeling på 32,5 ± 2,7 um. Acidolyse-only sek har en resterende proteinindhold på kun 0,15 ± 0,0%, som bestemt i forhold til% nitrogenindhold, 11, der er sammenlignelig med sek produceret af alkali og acidolyse behandling som diskuteret ovenfor og med tidligere rapporter. 7

Mikroindkapsling hjælp Sporopollenin Exine Kapsler

For at demonstrere brugen af L. clavatum SECS fremstillet ved hjælp af acidolyse-only proces blev udført mikroindkapsling eksperimenter under anvendelse af BSA som en model protein. Lastningen i Sek blev opnået ved anvendelse af en vakuum fyldningsteknik under anvendelse af 150 mg sek og 1,2 ml 125 mg / ml BSA. Figur 7 viser CLSM imalderen Sek før og efter acidolyse kun behandling og med FITC-BSA indkapsling. Dataene angiver, at ubehandlede sek udviser autofluorescens på grund af tilstedeværelsen af ​​sporoplasm bestanddele inde i sporen hulrum. Men efter acidolyse-eneste forarbejdning, er alle sporoplasmic indhold fjernet resulterende i en tom indre hulrum. Påfaldende, efter indkapsling af FITC-BSA, er grøn fluorescens iagttaget inde i sek, hvilket bekræfter indkapsling af modellen proteinet i sek. 19,20,41

Endvidere at undersøge de morfologiske ændringer og micromeritic egenskaber af BSA-loaded Sek, SEM og DIPA analyse blev udført, og data er præsenteret i figur 8. De SEM billeder bekræfter tilstedeværelsen af intakte og rene microridges efter BSA belastning. Desuden blev der ikke observeret væsentlige ændringer i diameter, cirkularitet, og billedformatet efter BSA lastning i sek. Disse data er consistent med tidligere rapporter om indkapsling af lægemidler ved hjælp sek. 7,10

At kvantificere mængden af indkapslet BSA, blev BSA ekstraheret fra 5 mg BSA-loaded sek, og dataene er vist i tabel 1. Dataene indikerer 0,170 ± 0,01 g BSA loading per gram sek. Samlet set SEM, DIPA, CLSM, og kvantificering af BSA ved spektrografiske analyse, bekræfter den vellykkede indkapsling af BSA i L. clavatum SECS og SEC morfologiske stabilitet.

figur 1
Figur 1. Strømlinet Udvindingsproces for L. clavatum Sporopollenin Exine Kapsler (sek). (A) Ubehandlede sporer. (B) Spore affedtning ved hjælp en tilbagesvalende set-up ved 50 ° C i 6 timer. (C) Opløsningsmiddel filtrering og indsamle ion af fedtfri sporer. (D) Tørring af fedtfri sporer ved stuetemperatur. (E) Spore acidolyse i PTFE kolbe ved anvendelse af 85% (v / v) phosphorsyre ved 70 ° C i 30 timer. (F) Syre filtrering under anvendelse af vakuumfiltrering set-up. (G) SEK vask anvendelse af en serie af vand, syre, base, og opløsningsmidler vasketrin. (H) SEK tørring under anvendelse vakuumovn ved 60 ° C og 1 mbar vakuum i 10 timer. (i) Intact, ren og tørret sek som et slutprodukt. (J) Blanding af sek og BSA løsning. (K) Homogenisering af sek og BSA løsning. (L) Vacuum lastning af BSA i sek. (M) BSA-loaded sek. klik her for at se en større version af dette tal.

54.768 / 54768fig2.jpg "/>
Figur 2. Scanning Electron Mikroskopisk analyse af L. clavatum sporer under forskellige stadier af Pre-syre behandling. (A) Ubehandlet sporer viser sporoplasmic cellulære organeller og biomolekyler. (B) Acetone behandlede sporer som frembyder forstyrret sporoplasmic indhold. (C) & (D) Alkali behandlede sporer viser fjernelse af sporoplasmic indhold og rynkede indre celluloseholdige intine lag. Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Scanning Electron Mikroskopisk analyse af L. clavatum sporer under forskellige stadier af AcidBehandling fra 5 til 30 timer (A - D). Henholdsvis 5, 10, 20, og 30 timers syre behandlet sporer viser intakt ekstern mikrostruktur og rene indre hulrum. Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Protein indhold Sporer og Sporopollenin Exine Kapsler (sek). Proteinindholdet efter forskellige stadier af behandlingen. Data repræsenteret er et gennemsnit af tredobbelte målinger med standardafvigelse (n = 3). Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version of denne figur.

Figur 5
Figur 5. Dynamisk Imaging Particle Analysis (DIPA) af sporer og Sporopollenin Exine Kapsler (sek) på forskellige stadier af behandling Kolonner (A - C). Er henholdsvis præ-syrebehandling, syrebehandling, og intakte sek. Plots er repræsentative grafer af SEC diameter, cirkularitet, aspect ratio, og kant gradient. Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Scanning Electron Microscopy (SEM) og Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) på 30 timer Acidolysis kun Sporopollenin Exine Kapsler (sek). (A) sek viser intakt ekstern mikrostruktur og rene indre hulrum. (B) Repræsentative grafer af SEC diameter, cirkularitet, og billedformat. Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Konfokal Laser Scanning Microscopy (CLSM) Analyse af Sporopollenin Exine Kapsler (sek) før og efter behandling og BSA Indkapsling. Den første række viser ubehandlede sporer viser sporoplasmic cellulære organel og biomolekyle autofluorescens. Den anden række afbilder 30 timers acidolyse-only sek med en tom indre hulrum. Den tredje række afbilder FITC-BSA indlæsti 30 timers acidolyse-only sek. (Scale barer er 10 um). Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Scanning Electron Microscopy (SEM) og Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) Karakterisering af BSA-fyldte Sporopollenin Exine kapsler (sek). (A) SEM billeder af BSA-loaded sek. (B) Repræsentative grafer af BSA-loaded SEC diameter, cirkularitet, aspect ratio, og kant gradient. Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materiale BSA belastning per portion (125 mg / ml) BSA i 5 mg sek (mg) Mængde BSA indlæst (g pr g sek) ubehandlede sporer 0,6 ml 0,654 ± 0,05 0,131 ± 0,01 sECS 1,2 ml 0,831 ± 0,05 0,170 ± 0,01

Tabel 1. Indkapsling af bovint serumalbumin (BSA) i Ubehandlede sporer og sek. Volumen af ​​BSA opløsning, der anvendes til lastning pr 150 mg parti af 'ubehandlede sporer "eller" sek ". Data repræsenteret er et gennemsnit af tredobbelte batcher med standardafvigelse (n = 3). Tilpasset fra 41 og anvendes med tilladelse fra videnskabelige rapporter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde, en systematisk analyse af SEC ekstraktion fra L. clavatum sporer præsenteres og denne rapport viser, at det er muligt at producere højere kvalitet kapsler samtidig opnå en betydelig effektivisering af den allerede eksisterende almindeligt anvendte protokol. 11 I modsætning til den gældende protokol, der kræver en høj procestemperatur (180 ° C) og en lang proces varighed (7 dage), 11 den nuværende SEC udvinding forarbejdning optimering blev primært fokuseret på at reducere temperaturen og varigheden af acidolyse trin.

De affedtende og alkaliske behandlinger giver minimal fjernelse af sporoplasmic materiale fra sporer. Men syrelyse fra 5 timer til 120 timer fjernede maksimale sporoplasmic materiale. Resultaterne viste, at den samlede behandlingstid varighed og temperatur kan reduceres drastisk fra traditionelle teknikker, 11 og at kun 30 timer i moderat temperatur (70° C) phosphorsyre billede de optimale kvalitet kapsler. Også ud over 30 timer acidolyse, blev det konstateret, at sek begyndte at bryde og der blev observeret en signifikant stigning i partikel-fragmenter, hvilket tyder på, at hele partiet af sek kan der udviser en reduktion i den samlede strukturelle integritet. Derudover skal det bemærkes, at L. clavatum anses for at omfatte forholdsvis robust sporopollenin, 2, og at de specifikke forarbejdningsbetingelser involveret i denne protokol, såsom syre koncentration, temperatur og / eller hydrolyse varighed, kan det være nødvendigt at justere for andre pollen arter.

Det blev vist, at produktionen af sek ved acidolyse-kun bruger phosphorsyre (85% v / v) i 30 h udbytter rene og intakte sek. 41 Dataene bekræfter, acidolyse er det afgørende skridt i SEC produktion. Endelig blev syre-only sek anvendt til indkapsling af BSA og blev observeret en høj grad af belastning. Belastningen wsom opnået med anvendelsen af ​​et vakuum, hvorved det indre SEC hulrum tryk ændres til kraftigt trække BSA-opløsningen i de tomme kapsler. Nanochannels (dia 15 -. 20 nm), som tidligere er blevet identificeret i exine mure L. clavatum, 7 tillader løsningen til at indgå i det store indre hulrum. Efter påsætning blev kapslerne vaskes og tørres i en frysetørrer for at give et fritflydende pulver.

Størrelse ensartethed og morfologiske karakteristika er vigtige faktorer for at vurdere kvaliteten af ​​et vellykket indkapsling materiale. Den observerede størrelse ensartethed og intakt morfologi af BSA-ladede sek bekræftede potentielle anvendelse af acidolyse-only forarbejdet Sek til mikroindkapsling applikationer.

Disse resultater er vigtige for storstilet industriel produktion af sek og til at stimulere større interesse for de potentielle anvendelser af Sek i mikroindkapsling af lægemidler,proteiner, peptider, kosttilskud, nutraceutika, og kosmetik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type) Sigma 19108-500G-F
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G
FITC-conjugated BSA Sigma A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v) Sigma 438081-2.5L
Hydrochloric acid Sigma V800202 
Sodium hydroxide Sigma S5881-1KG 
Acetone Sigma V800022
Ethanol AcME  C000356
Deionized water Millipore purified water 
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)  Thermoscientific (CA, USA) 4250A
Vectashield  Vector labs (CA, USA) H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide Ibidi GmbH (Munich, Germany) 10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type) Polysciences, Inc. (PA, USA) 16867-1
Heating plates IKA, Germany
Scanning electron microscope Jeol, Japan  JFC-1600
Elemental analyzer  Elementar, Germany VarioEL III
FlowCam: The benchtop system Fluid Imaging Technologies, USA FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss, Germany LSM710
Freeze dryer Labconco, USA 
UV Spectrometer Boeco, Germany S220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17 (7), 609-612 (2007).
  2. Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. , University of Hull. (2008).
  3. Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , US 7,608,270 B2 (2009).
  4. Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
  5. Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45 (7), 645-649 (2010).
  6. Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43 (1), 73-76 (2010).
  7. Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21 (4), 975-981 (2011).
  8. Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21 (44), 18018-18023 (2011).
  9. Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22 (19), 9767-9773 (2012).
  10. Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1 (5), 707-713 (2013).
  11. Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
  12. Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. , Elsevier. 283-297 (2014).
  13. Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6 (1), 80-96 (2014).
  14. Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31 (7), 667-673 (2014).
  15. Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2 (8), 945-959 (2014).
  16. Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. , Academic Press. 193-212 (2013).
  17. Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
  18. Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
  19. Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12 (9), 1167-1173 (2015).
  20. Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26 (4), 487-497 (2015).
  21. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , WO2007012857A1 (2007).
  22. Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461 (1), 89-109 (1928).
  23. Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 517-519 (1931).
  24. Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 62-67 (1931).
  25. Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148 (9-10), 267-286 (1937).
  26. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5 (2), 247-252 (1964).
  27. Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. , 16-22 (1966).
  28. Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12 (3), 171-178 (1999).
  29. Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
  30. Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109 (1), 146-150 (2007).
  31. Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. , 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
  32. Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47 (7), 602-607 (2009).
  33. Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21 (6), 752-772 (2004).
  34. Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698 (1), 110-121 (2013).
  35. Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57 (3), 61-68 (2011).
  36. Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3 (1), 207-210 (2014).
  37. Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6 (20), 16533-16539 (2016).
  38. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, , (2000).
  39. El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190 (1), 324-329 (2011).
  40. Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
  41. Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
  42. Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , CRC press. 182 (2011).

Tags

Bioengineering , naturlige sporer sporopollenin exine kapsler indkapsling mikrostruktur microridges
Udvinding af Plant-baserede Kapsler til Microencapsulation Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potroz, M. G., Mundargi, R. C.,… More

Potroz, M. G., Mundargi, R. C., Park, J. H., Tan, E. L., Cho, N. j. Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications. J. Vis. Exp. (117), e54768, doi:10.3791/54768 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter