Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Published: December 2, 2016 doi: 10.3791/54773
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Protocol

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi Ulusal Enstitüleri (NIH Pub. No: 80-23) göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalarda kullanılan tüm yöntemler ve protokoller NIH tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için yönergeler aşağıdaki Wisconsin Hayvan Bakım ve Kullanım Protokolü Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (yayın No. 85-23, 1996 revize). Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuz uygun olarak, insan sağlığı aldı.

1. Kalp Kaldırma ve Langendorff Perfüzyon

  1. Kalp izolasyonu, bir su banyosu ve bir su ceketi ile 37 ° C sıcak bir Tyrode çözeltisi önce.
  2. % 5 izofluran /% 95 O 2 ile fare anestezisi.
  3. Ağrı refleksi kaybı kontrol ederek anestezi uygun düzeyde sağlamak.
  4. torakotomi gerçekleştirin. Kavisli 5.5 "Mayo makas ve 5.5" Kelly hemostatik için kullanarak göğüs açınceps Toraks önünde kesilmiş bir 1 cm yapmak.
    1. Çabuk (30 saniye içinde) göğüs kalbini ayıklayın. "Akciğer dokusu kapmak ve 4.3 kullanılarak perikard ile birlikte akciğer, timus ve kalbini kesip kavisli İris forseps" İris makas 4 kullanın. doğrudan kalbi almayın.
    2. Oksijenli (% 95 O 2/5% CO2) yıkayın, sabit sıcaklık (36.8 ± 0.4 ° C) Tyrode çözeltisi modifiye. (MM olarak) şu çözeltisi bileşimi kullanın: 128.2 NaCl, 4,7 KCİ, 1,19 NaH 2 PO 4, 1.05 MgCI2, 1.3 CaCl2, 20.0 NaHCO 3 ve 11.1 glükoz (pH 7.35 ± 0.05).
  5. aynı çözelti içinde banyo birlikte, akciğer, timus ve yağ dokusu tanımlar. Dikkatle kalpten onları incelemek. 3 "Vannas-Tübingen makas ve 4.3" # 5 forseps kavisli kullanın.
  6. Sonra aort tanımlamak ve ısmarlama 21 G kanül üzerine cannulate. iki kavisli 4.3 "# 5B güç kullanmayaps.
  7. Kanülasyon sonra eş zamanlı olarak serpmek (~ 50 ml / dakika bir akış hızında banyosu içinde) (~ 5 ml / dk'lık bir akış hızında bir kanül aracılığıyla bu aort basıncı göre ayarlanmalıdır, aşağıya bakınız) ve Superfuse tüm deney boyunca ısıtıldı ve filtre edildi Tyrode çözeltisi kalp. Koroner dolaşımın tıkanmasını önlemek için bir in-line 11 mikron naylon filtre aracılığıyla perfüzyon çözümü geçirin.
  8. perfüzyon hattına 3 yollu musluk Luer kilidi üzerinden bağlı bir basınç transdüktörü (ya da bir basınç göstergesi) kullanılarak, aort basıncı izleme ve 60 ve 80 mmHg arasında muhafaza. Bu aralıkta aort basıncı tutmak için gerekirse perfüzyon hızını ayarlayın.

Langendorff-perfüze Tüm from the Heart SAN 2. Optik Haritalama

  1. aletler
    1. yatay kalbi yerleştirin ve p 0,1 mm çaplı işaretçilerine kullanarak odasının silikon kaplı alt ventrikül apeks pinRevent akışı kaynaklı deney sırasında hareket. 12
    2. pulmoner ven yoluyla sol ventrikül (LV) içine küçük (0,012 "ID x 0,005") silikon tüp takın, sol kulakçık (LA) ve mitral kapak (MV). sondaj bağ dokusu bir ipek sütür (4-0) ile tüp sabitleyin.
    3. Posterior tarafı (Şekil 1A, sol panel) yukarı bakacak şekilde kalbi yerleştirin.
    4. 0.1 mm çapında minutien işaretçilerine kullanarak odasının silikon altına RA apendiks (RAA) kenarını sabitleyin. RA düz arka yüzeyini yapmak ve kameranın odak düzlemi bulunduğu için izin vermek için kendi seviyesini ayarlayın. Bu atrium maksimal yüzey alanından optik ölçümler sağlayacaktır.
    5. Ipek sütür (4-0) tarafından kement üstün (SVK) ve alt (IVC) vena kava, streç ve bir silikon kaplı odasına (Şekil 3A bakınız) altına sütür diğer ucunu pin. dikişler blok yok emin olungörüş optik alanı.
    6. RAA kenarında ısmarlama pace elektrodu yerleştirin. Elektrotları yapmak için kullanımı silikon 0,5 mm arası bir elektrot mesafesi, 0.25 mm çapında bir gümüş tel kaplamalı ve ilerleme hızı sonunda 1 mm uzunluğu için silikon yoksundur. Sonra iki EKG 12 mm iğne (29 gauge) sağ ve sol ventrikül tabanına yakın monopolar elektrotlar yerleştirin. ventriküllerin apeks yakınında zemin EKG elektrot yerleştirin.
  2. boyanma
    1. Floresan boyalar ve elektro-mekanik uncoupler blebbistatin hem ışığa duyarlı olduğu için, karanlık bir odada, aşağıda anlatılan bütün işlemleri gerçekleştirmek. İlk dimetil sülfoksit (2.5 mM), kısım içinde bir stok çözeltisi, 1.25 mg / ml olarak (30 ul her biri) voltaja duyarlı boya RH-237 ya da di-4-ANNEPS hazırlama ve -20 ° C'de alikot saklayın.
    2. ısıtılmış (37 ° C), Tyrode çözeltisi, 1 ml boya stok çözeltisi, 5-10 ul seyreltilir ve daha sonra, koroner perfüzyon hattına enjektebir in-line Luer enjeksiyon ağzının kullanılarak 5-7 dakikalık bir süre içinde.
    3. Önceden bir stok çözeltisi (dimetil sülfoksit içinde 2 mg / mL, 6.8 mM) ve blebbistatin hazırlamak ve 4 ° C'de saklayın.
    4. stabilizasyon için 20 dakika sonra, perfüzata ısıtıldı 0.5 ml (37 ° C) ekleme ve blebbistatin ısıtıldı (37 ° C), Tyrode çözeltisi, 1 ml blebbistatin 0.1 ml seyreltin. Daha sonra, bir in-line Luer enjeksiyon ağzının kullanılarak 5-7 dakikalık bir süre içinde, koroner perfüzyon hattına enjekte.

İzole Atriyal Hazırlık SAN 3. Optik haritalama

  1. aletler
    1. izole edilmiş atrial hazırlanması için, izole edilmesi ve bütün kalp hazırlanması için aşamaların 1.1-1.5 yukarıda tarif edildiği gibi kalp kanüle.
    2. uzakta ön taraftan ventriküllerin parçalara ayır. Şekil 1A, sağ paneli ayrıntılar için bkz içerisinde 1. kesti.
    3. triküspit va yoluyla keserek RA açınTV-SVC ekseni boyunca lve (TV). Şekil 1A, sağ paneli ayrıntılar için bkz içerisinde 2. kesti.
    4. RAA açmak için crista terminalisin medial ekstremite kesin. Şekil 1A, sağ paneli Bkz içerisinde 3. kesti.
    5. , RAA sağ alt köşesinde kenarına önceki kesim içerisinde 3. orta hattan bir kesim yaparak ön atriyal serbest duvarını açın düzleştirmek ve silikon kaplı odanın tabanına atriyal ücretsiz duvar pin. 4. kesip, Şekil 1A içi boş ok ile gösterilen yönde bakın. atriyumlardan zarar görmesini önlemek için hazırlık iğneleyerek için ventrikül doku jant koru.
    6. Benzer şekilde, LA apendiks (SAA) MV-üst köşesinde boyunca MV aracılığıyla keserek açık LA.
    7. SAA orta jant yakın kadar ön atriyal serbest duvarından açılan SAA ortasından kesilmiş LAA, açın.
    8. ön atriyal serbest duvar alo açınaynı yöne ng, sonra dümdüz ve Sylgard kaplı odanın tabanına pin.
    9. Kısmen interatrial septal doku kaldırmak. Bu odakta değil dokudan optik sinyalin saçılma azaltacaktır. Bu nedenle, LA ve RA yanı sıra SAN ve atriyoventriküler kavşak (Avj) de bu hazırlık (Şekil 1B) erişilebilir.
    10. Epikardiyal ve endokard yüzeyleri hem Superfusion izin vermek için silikon kaplı bölmenin tabanından yaklaşık 0.5 mm nihai hazırlama yukarı kaldırın.
    11. SVC yakınındaki odaklanmış bir akış 12 ml / dk'lık bir sabit bir hızda ısıtıldı ile preparasyonu (37 ° C), Tyrode çözeltisi Superfuse ve • banyo süperfüzyon için 30 ml / dk.
    12. Disseke RAA kenarında ısmarlama kalp pili Ag / AgCl 2 elektrot (0.25 mm çapında) yerleştirin. Sonra sırasıyla, iki EKG 12 mm iğne (29G) RAA ve SAA yakın elektrotlar (tek kutuplu) yerleştirin. zemin EKG seçilen yerleştirinAvj yakın sürdü.
  2. boyanma
    1. voltaja duyarlı bir boya (RH-237 ya da di-4-ANNEPS) doğrudan bir uygulama gerçekleştirmek. Bunun için, ısıtılmış (37 ° C), Tyrode çözeltisi 1 mm boya stok çözeltisi 1-2 ul seyreltilmiş ve yavaş yavaş 1 mm'lik bir pipet kullanılarak hazırlama yüzeyi üzerinde seyreltilmiş boya bırakın.
    2. Alternatif olarak, bütün kalp hazırlanması (adım 2.2.1-2.2.2) için yukarıda tarif edilene benzer Langendorff perfüze kalp koroner perfüzyon yoluyla voltaja duyarlı boya atriyal boyama yapar.
      1. açıklandığı gibi koroner perfüzyon boyanması sonra, atriyal hazırlık izole. tatmin edici bir floresans seviyesine ulaşmak için gerektiğinde ek yüzey boyama gerçekleştirin. Hızlı atriyal izolasyon boya ağartıcı değildir ve boyama kalitesini etkilemez.
    3. elektro-mekanik uncoupler, blebbistatin ile hazırlık hareketsiz. ble 3-5 ul sulandırmakısıtılmış (37 ° C), Tyrode çözeltisi içinde stok çözeltisi bbistatin yavaşça preparatın yüzeyine ve çevredeki çözeltisi seyreltilmiş blebbistatin bırakın. Blebbistatin hazırlanması ve boyama esnasında ışığa ışığa duyarlı, 13,14 kaçının uzun pozlama olduğu gösterilmiştir beri.
    4. kasılmasını bastırmak için gerektiği kadar ek blebbistatin uygulamasını gerçekleştirin. Normalde 3 ek uygulamalar (her uygulama başına 3-5 ul) kadar doğru SAN ve atriyal aktivasyon yeniden amacıyla yeterince hareket artifakı bastırmak için kullanılabilir.
    5. Perfüzat ısıtılan blebbistatin ilave 0.5 ml ilave edilir. Bu işlem sırasında, boya / blebbistatin atrial dokuda leke izin 30 saniye için Superfusion duraklama.

4. Optik Haritalama Kurma

Not:., Optik eşleme sisteminin ayrıntılı bir açıklama temin edilmiştir 12

  1. Bir tem bir kamera kullanın2.000 kare / sn veya daha yüksek, ve kondansatör lens serisi temporal çözünürlük 100 mm / piksel veya daha yüksek uzaysal çözünürlüğü ulaşmak için. Bu SAN aktivasyonu ve intranodal yayılmasını yeniden gereklidir.
  2. titreşimli çözümden hareket paraziti azaltmak için, kalp / izole atrial hazırlık üzerine çözeltinin yüzeyinde küçük bir cam kapak düzeltmek.
  3. Bir sabit akım, düşük gürültü halojen lamba tarafından sağlanan uyarma ışık (520 ± 45 nm dalga boyu) kullanın. esnek çatallı ışık kılavuzu ile hazırlanması üzerine filtrelenmiş ışık demetini yönlendirin.
  4. Uzun geçiş filtresi (> 715 nm) tarafından yayılan floresan filtre. Toplamak dijital ortama aktarmak ve kamera üreticisi tarafından sağlanan bir bilgisayar kullanarak yazılım üzerinde elde edilen floresan sinyal kaydedin.

5. Veri İşleme

NOT: Optik eşleme verileri toplanır ve farklı zaman noktalarında floresan yoğunluğu matrisler bir dizi olarak depolanır. Her piksel hukBelirli bir zaman noktasında doku hazırlanması belirli bir konuma toplanan floresan yoğunluğu bir ölçü NTS. Arkaplan floresan otomatik olarak membran voltaj değişiklikleri ile üretilen ve mikroelektrot sistemleri tarafından ölçülen aksiyon potansiyeli (AP) ile haberleşmek için ters floresan değişiklikleri daha iyi görünüm için izin piksel başına kaldırılır. Görüntü segmentasyonu, uzamsal filtreleme, zamansal filtreleme ve bazal sürüklenme kaldırılması da dahil olmak üzere optik görüntüleme verileri, işleme farklı adımların Detaylar odaklanmış gözden verilmiştir. 15

  1. El ile ya da doku sınırlarını belirlemek için özel bir algoritma (örneğin, bir eşikleme veya kenar algılama) 15 kullanılarak, 1 (dahil piksel) ve 0 (hariç piksel) bir ikili maske oluşturmak ve sırayla her kareye maske uygulayın. Bu işlem daha sonraki işlemler için ilgi alanları vurgular ikili görüntü oluşturur.
  2. opt sinyal-gürültü oranını geliştirmek için,ical veri, seçilmiş alanlarda dahilinde sinyalleri filtre. Bunun için, örneğin, Butterworth, Chebyshev türü ve / veya zamansal filtreleme ((gürültülü veriler, 5 x 5 için, örneğin 3 x 3, istenen evrişim bin ya da çekirdek tarafından tanımlanan komşu floresan piksellerin yani ortalamasını veya) uzaysal kullanın 1, Chebyshev tip 2, Eliptik vs) (Şekil 2). verileri yorumlarken akılda süzülmüş kaynaklı eserler olasılığını tutun. Daha fazla bilgi için, bkz:. 15
  3. gerektiğinde (orijinal sinyale yüksek geçiren filtreleme ya da polinom uydurma kullanarak) optik kayıtlarında bazal sürüklenme çıkarın ve sonra 0 (minimum floresan) 1 (azami floresan) her piksel sinyali normalleştirmek.
  4. Tek bir AP yayılımı için tüm piksellerin aktivasyon süreleri kapsayan bir zaman penceresini seçin. F flüoresan maksimum upstroke türevinin zaman (dF / dt max, her pikselin kendi aktivasyon zamanı atamace yoğunluk). tüm piksel aktivasyon süreleri kullanarak, eş zaman aktivasyon haritası yeniden. Her isochron böylece aynı anda aktif piksel gösterecektir.
  5. Her piksel (repolarizasyon, APD 80% 80 gibi) repolarizasyon belirli bir düzeyde aktivasyon zaman ve arasındaki süresini hesaplamak için, AP süresi (AKB) dağılım haritası yeniden inşa etmek. tüm piksel APD değerlerini kullanarak, AKB dağıtım eş zaman haritayı yeniden. Her isochron böylece aynı AKB pikselleri gösterir.
  6. AP yayılması için iletim hızını hesaplamak için, 5.4 hesaplanan aktivasyon zamanlı veri hazırlama bir yüzey uygun. Bunun için, polinom yüzey uydurma veya yerel çekirdek yüzey pürüzsüzleştirme kullanmak ve daha sonra takılan yüzeyin degrade yerel iletim hızı vektörleri hesaplar.
  7. Repolarizasyon harita oluşturmak için, her pikselin kendi repolarizasyon süresini atamak, maksimum ikinci türevi olarak tanımlandığı (d 2 F / dt2) OAP veya% 90 repolarizasyon süresinin sonunda optik sinyalin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Langendorff-perfüze Kalpten bozulmamış SAN Optik Haritalama
Spontan sinüs ritmi için yeniden bir RA aktivasyon kontur haritası tipik bir örnek, bir Langendorff-perfüze fare kalp için Şekil 3'te gösterilmiştir. Erken aktivasyon noktası SAN anatomik tanımlanan SVC yakın intercaval bölge içinde yer almaktadır. 1.0 ve 0.5 milisaniye örnekleme hızında elde edilen 3,16 İki RA aktivasyon kontur haritaları Şekil 3B gösterilmiştir.

SAN işleyişini değerlendirmek için, biz 10-12 Hz en az 1 dakika boyunca RAA pili sonra SAN iyileşme süresini (SANRT). 9 ölçülen elektriksel stimülasyon durduruldu ve SANRT son çekilen AP arasındaki zaman aralığı olarak hesaplanmıştır ilk spontan AP (Şekil 3C). SANRT kalp hızı (yani SANRT <için düzeltilmiştirSANRT ve temel döngüsü uzunluğu arasındaki fark hesaplanarak sub> c). Buna ek olarak, ilk post-pace kalp pilinin yeri tespit edilmiştir. Bu örnek için, SANRTc yaklaşık 49 msn.

İzole Atria ve SAN Aktivasyon
Spontan sinüs ritmi sırasında izole atrial hazırlanması aktivasyonu Şekil 4A'da gösterilmiştir. Bu septal yönüne üst ve alt SAN kenarları ve tam blok yakınında iki tercihli iletim yön ile, RA boyunca eşyönsüz yayılmış geniş bir dalga ön SVC yakınlarındaki SAN tanımlanan anatomik kökenli (Şekil 4A aktivasyon haritalarında işaretlenmiş) . 1 msn örnekleme hızında elde edilen aktivasyon haritası erken aktivasyon geniş bir alanı göstermektedir. 0.5 msn 0.3 msn örnekleme oranında bir artış bizi lider kalp pili konumu hassas bölgeyi tanımlamak için izin verir. WE gözlenen tipik bir atımdan-dövmek önce cam Mikroelektronlar 17 ve optik haritalama 8-11,18,19 tarafından yanı sıra connexin45 ve HCN4 için immunolabeling ile elektrofizyolojik karakterize primer kalp pili alanına karşılık gelen kalp pilinin istikrarlı monofokal konumunu . 6,16

Yavaş artan SAN bileşeni ve atriyal miyokardın hızla yükselen yukarı doğru vuruş (atriyal bileşen) (Şekil 4B), 20 ışık yayılmasına bağlı olarak. Daha önce gösterildiği gibi, SAN, optik aksiyon potansiyeli iki ayrı bileşeni içerir, iki fazlı sinyali oluşmaktadır işlemler, OAB doku içindeki hücrelerin çok katmanlı kaynaklanan bir ortalama elektrik aktivitesi gösterir. saçılma derinliği ve genişliği ışık saçılması ve emme özellikleri ile belirlenir ve 1.5-2 mm kadar ulaşabilir bir uzay sabiti, tarafından yönetilir. Çünkü SAN Condu arasındaction gecikmesi, SAN AP daima fizyolojik aktivasyon (Şekil 4B) sırasında atriyal aktivite önce gelir. Atriyuma SAN geçişi hesaplamak için (yani SAN iletim süresi, Sanct), biz çift bileşenli SAN sinyali 50 SAN bileşeni genlik% ya da iki-tepe ilk zirveye ulaşır zaman noktasını ya kullanılan OAB, ilk türevi (dF / dt). RA en erken SAN aktivasyon bölgesinden Sanct cam mikro elektrod ile ölçülen benzer ~ 5 msn oldu.

SAN Toparlanma Süresi
Benzer şekilde, SANRT izole atrial hazırlanması (Şekil 4D) 'de ölçülmüştür. Bunun için, atriyal preparasyonlar en az 1 dakika boyunca RAA köşesinde bulunan bir düzenleme elektrotu ile 12 Hz tempolu. 9 Bu örnekte, SANRTc Langendorff perfüze ölçülen ile karşılaştırılabilir yaklaşık 34 msn oldu kalp (Şekil 3C). Buna ek olarak, ilk post-pace kalp pilinin yeri tespit edilmiştir.

Kalp Ritim ve Floresan Sinyal Kararlılık Zamanla
Cerrahi ve boya yükleme prosedürleri uygun takip edilirse, atrium fizyolojik özelliklerinde önemli bir değişiklik olmamalıdır. Şekil 5'te, önceki ve atriyal izolasyon prosedürü sonra 3 saat perfüzyon sırasında ölçülen kalp ritmi sunulmuştur. kalp hızının anlamlı bir değişiklik atrium izolasyonu sırasında veya boya yüklemeden sonra ya gözlendi.

arteryel boyama bir boya büyük bir miktarda gerektirebilir de, San bölgesindeki doku floresan sinyalinin stabilitesi, bu yükleme yöntemi kullanarak daha iyi olduğu görülmektedir. Şekil 6, biz hem koroner ve yüzey boyama için zamanla sinyal yoğunluğu çürümesine sunuyoruz. t O SAN doku, (sinyal yoğunluğu% 50 vefat etti süreyi gösterir) IC 50 neredeyse iki kat daha uzun yüzey boyanma olduğu gibi koroner boyamadan sonra yaklaşık 107 dakika vardır.

Şekil 1
Şekil 1:. Fare Atriyal Hazırlanışı izolasyonu (A) Cerrahi girişimler fare atriyal hazırlık izole etmek için yapıldı. kalbin arka görünümü gösterilir. Tüm kesimler noktalı kırmızı çizgilerle gösterilen ve yapılan sırayla numaralarıyla etiketlenir. Metinde ayrıntılara bakın. (; Gri oval etiketli SAN) (B) sol ve sağ atriyal ekleri trabeküler yapının yanı sıra Çin-atriyal düğümün konumu dahil olmak üzere ana anatomik özelliklerini gösteren izole fare atriyal hazırlık şematik anahat. Tüm kısaltmalar şekilde açıklanmıştır.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. 0.3, 0.5 ve 1 milisaniye / karede kaydedilen ham ve işlenmiş sinyaller Ham sinyaller tek bir piksel tahsil edilir. 3 x 3 binning sonra sinyaller alçak geçiren Butterworth algoritması kullanılarak süzülür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. SAN (A) Sol Tüm kalp Optik Haritalama, bozulmamış kalbinden SAN haritalama için kullanılan tipik bir hazırlık fotoğraf. mavi kare optik alanını gösterirgörünümü (6 mm 6 mm). Sağ, görüş optik alan kamera ile çekilen ve anatomik yerler ile üst üste. SVC ve IVC: superior ve inferior vena kava; RAA: sağ kulakçık; RV ve LV: sağ ve sol karıncıklar; PV'ler: pulmoner venler. (B) Renk kontur aktivasyon haritaları (solda) 1.0 msn 0.5 msn (sağda) örnekleme oranıyla satın aldı. Her haritanın sağında, atriyal aktivasyon zamanı gösteren karşılık gelen renk zaman ölçeği gösterilir (erken aktivasyon noktasından kırmızı ile gösterilen son aktivasyon noktasına, mavi gösterilmiştir). erken atriyal aktivasyon sitesi bir yıldızla işaretlenmiştir. (C) SAN toparlanma zamanı (SANRT) bütün kalp hazırlık ölçtük. son ilerleme hızı uyarıcı (S1) ve ilk pacing sonrası atriyal yendi (A1) için yeniden atriyal aktivasyon kontur haritaları temsili örnekleri üstünde temsili OAB iz seçilen atım için gösterilmiştir.erken atriyal aktivasyonun Siteler bir yıldızla işaretlenmiştir. BCL. Temel döngü uzunluğu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: İzole Atria Endokardial Surface adlı Fare Çin-atriyal düğüm (SAN) Yüksek çözünürlüklü optik haritalama tipik bir fare SAN hazırlık (6 mm x 6 mm) (A) Fotoğraf ve karşılık gelen aktivasyon kontur haritaları. 1.0 ms, 0.5 milisaniye ve 0.3 msn örnekleme oranları elde. SAN ve komşu blok bölge oklarla gösterilmiştir. Renk zaman ölçekleri atriyal aktivasyon zamanı gösterir. yıldız önde gelen kalp pilinin konumunu belirtir. RAA: sağ kulakçık, SVC ve INC: üst ve alt vena kava, RV: sağ ventrikül, Avj: atriyo-ventrikül ar kavşak, CT: crista terminalis, IAS: arası atriyal septum. (B) Fare SAN alanından OAB kayıt çift bileşenlerinin Mekanizması. Metinde ayrıntılara bakın. . (C) OAPs SAN alanı (mavi), erken atriyal uyarma sitesi (yeşil) ve en son RA aktivasyon sitesinden (kırmızı) merkezinden kaydedildi Insets: 5 eşit bir toplam iletim süresi ile atriyal dalga formuna düğüm geçiş msn. 11 msn eşit toplam RA aktivasyonu için gecikme süresi ile karşılaştırın. (D) SAN toparlanma zamanı (SANRT) izole atrial hazırlık ölçtük. son ilerleme hızı uyarıcı (S1) ve ilk pacing sonrası atriyal yendi (A1) için yeniden atriyal aktivasyon kontur haritaları temsili örnekleri gösterilmiştir. erken atriyal aktivasyonun bir site bir yıldızla işaretlenmiştir. BCL - Temel döngü uzunluğu.k "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Kalp Ritim Öncesi ve Atriyal İzolasyon Prosedürü (A) sonra ve 3 saat Perfüzyonunun (B) sırasında ölçülmüştür. (A) Spontan atan kalp hızı öncesi ve atriyal lekelenme iki tip atriyal izolasyon sonra gösterilmektedir: atriyal izolasyon öncesi yüzey boyama izolasyon sonra (önceden koroner boyama) ve koroner boyanma. 3 saat perfüzyon üzerine (B) Spontan kalpte ritim istikrar olmayan lekeli atriyal hazırlıkları için ve floresan boya için gösterilen ve lekeli atriyal hazırlıkları blebbistatin edilir. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6:. Sinyal Şiddeti Çürüme Zaman İçinde hem yükleme yöntemleri sinyallerin şiddetleri (koroner yükleme kırmızı belirtilen ve yüzey yükleme mavi belirtilen) ölçülen ve zamanla çizildi. trabecula (TRAB), sinüs düğümü (SAN), sağ atrium uzantısı (RAA) ve koroner sinüs (CS): sinyal yoğunlukları sağ atrium dört tipik yerlerde 7 7 piksel alanı ortalamaları alındı. IC50 değerleri hesaplanır ve tüm bozunma eğrileri etiketli bulundu. Her iki yükleme yöntemleri sinyal yoğunluğu çürüme TRAB ve RAA benzerdi. CS arteriyel yükleme IC 50 yaklaşık 20 dk daha uzundu. SAN, arteriyel yükleme bu değer arteriyel yükleme yöntemleri SAN Tiss boyanın daha iyi denge sonuçlandı belirten yüzey yükleme kıyasla yaklaşık iki kat daha büyüktüzamanla ue. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Langendorff-perfüze bütün kalbi 1) bozulmamış SAN, ve 2) SAN izole olarak, atriyal hazırlık açtı: Burada, fare SAN hazırlıkları iki tür sundu. hazırlık Bu iki tip farklı deneysel amaçlara hizmet eder. Langendorff perfüze bütün kalp hazırlanmasında, sağlam atriyal yapısı mümkün evresel taşiaritmileri sırasında San ve atriyum arasındaki karmaşık atriyal atriyal fibrilasyon gibi aritmiler gibi etkileşimler üzerinde çalışmak için yapar korunur. 6 aksine, izole edilmiş atriyal hazırlanmasında , atrium üç boyutlu anatomik demetleri rahatsız sözde iki boyutlu bir yapı halinde açılır ve düzleşir. Bu atriyal aritmogenez çalışmak için ideal değil izole atriyal hazırlık yapar evresel yollarının anatomisini etkileyebilir. Ancak, bu hazırlık türü, önde gelen kalp pili (lar) siteleri, intranodal iletim konumunu ve AP yayılım p kullanarakattern doğru görüntülenmiştir ve ayrıntılı olarak incelenmiştir edilebilir. izole edilmiş preparasyon, bütün atriyal yüzeyli optik eşleme için kullanılabilir Buna ek olarak, sağlam kulakçıklar posterior görünümü ile sınırlı görünmektedir.

Ayrıca, izole edilmiş atriyal hazırlanması Şekil 4'te görüldüğü gibi, trabeküler ağ kompleks mikro çözümleyerek atrium yapısal-fonksiyonel haritalama sağlar. Bunun için, yüksek uzaysal (100 mikron / piksel veya daha yüksek) ve temporal (2.000 FPS ya da daha yüksek) çözünürlükleri Bundan başka, karşılık gelen yapıları ile üst üste edilebilir hem de atriyal ve SAN aktivasyon örüntüleri, zikretmek için önemli olduğu için kullanılmalıdır. 1000 fps zamansal çözünürlük (10 sürer - 20 msn) atriyal aktivasyon yeniden minimum olabilir iken, 2000 fps ~ 5 ms sürer ve böylece düşük cevapsız olabilir intranodal iletim (asgari temporal çözünürlük olarak kabul edilmelidir çözünürlükler) ve SAN hareketŞekil 4'ten görüldüğü gibi ivation ölçümleri. Bu yüksek fibrozis olanlar ile önemli fonksiyonel biçimlenme bölgelerin süperpozisyon ortaya çıkabileceğini atriyal fibrilasyon / flutter sırasında aritmojen "sıcak noktalar" (örneğin ektopik odakların veya demirlemiş iniş gibi) lokalizasyonu izin verebilir ve / veya azaltılmış hücre-hücre bağlantı. Buna ek olarak 21,22, açıklanan yaklaşım SAN çıkış blokları, duraklamalar, taşikardi-bradikardi aritmiler, hasta sinüs sendromu vb dahil SAN anomalilerinin elektrofizyolojik mekanizmaları, incelemek için kullanılabilir.

ikinci (hatta üçüncü) floresan prob tanıştırarak, kalsiyum taşıma yanı sıra metabolik ve diğer değişikliklerle birlikte elektriksel aktivitenin çok parametrik optik haritalama yapmak mümkün olacaktır. boyalar farklı kombinasyonları aynı anda gerilim kalsiyum, rasyometrik gerilim / kalsiyum veya mitokondriyal potansiyel görüntüleme için kullanılabilir.

kısa fluorofor toplama dönemi nedeniyle yüksek zamansal çözünürlüklü optik haritalama için, daha zayıf bir sinyal-gürültü oranı sinyalleri takdir olabilir. Gerektiğinde Bu nedenle, bir ortalama alma işleme prosedürü sinüs kalp ritim sinyalleri veya ilerleme hızı serisi sinyallere uygulanır. DF / dt max uzun bir süre kayıtta her sinyal için tespit edilir. Bu aktivasyon süresi noktalar daha sonra hizalanır. Gerektiğinde, bu zaman noktalarında merkezli kayıt bir ayar süresi APS kesilmiş ve ortalama her veya seçilir.

Enstrümantasyon doğru kullanımı ve doğru boyama işlemi ile, iletim hızı (Şekil 3C ve 4D S1 aktivasyon haritalar karşılaştırmak), spontan SAN ritim ve SAN hazırlık (Şekil 5) uzun ömürlü olmak üzere atriyal elektrofizyolojik parametreler için sabit kalır, hangi etkilenmez 3 ya da daha fazla saat. Önemli bir şekilde, sürekli bir MonitEKG ORing kalbin normal elektrik fonksiyonunu sağlamak için tüm boyama işlemi üzerinde yapılmalıdır. Blebbistatin uygulaması geçici kalp hızı yavaşlama neden olabilir, ama bunun dışında, aynı zamanda daha önce tarif edildiği gibi AP morfoloji kalp pili sitelerini veya değişikliklere yol açan herhangi bir vardiya yol açmaz. 13

İzole atriyal hazırlık yüzey boyama kritik bir adımdır. Bunun için, doku yüzeyi üzerine seyreltilmiş boyanın hızlı uygulama kaçınılmalıdır; yerine boya nedeniyle boya ve blebbistatin dilüsyonları her ikisi için kullanılan DMSO yüksek yoğunluk, serbestçe hazırlanması düşmek gerekir. dramatik kalp hızı değişikliklere neden etmeyecek şekilde uygun toplam yükleme miktarı ve hızı ayarlanabilir olmalıdır. Sinyal makul bir seviyeye ulaşana kadar boyama işlemi birkaç kez uygulanabilir. Boya doğrudan uygulama SAN dokuya zarar ve pacem etkileyebilecek unutulmamalıdıraking. Bu nedenle, boya seyreltilmelidir ve uygulanan miktar, dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir. Uygun yüzey boyama karşılaştırılabilir kalp hızı ve iletim hızının tarafından değerlendirilir hazırlık veya SAN 23 zarar vermemelidir.

Alternatif boyama protokolleri de dikkate alınmalıdır. Bu 35 ± 1 ° C 10,19 voltaj duyarlı bir boya (RH-237 ya da di-4-ANEPPS) SAN / atriyal preparatın 10-15 dakika Superfusion veya preparatın 30 dakikalık bir inkübasyon da içerebilir voltaja duyarlı gösterge ihtiva eden bir Tyrode çözeltisi içinde, oda sıcaklığında (20-22 ° C). 11

Langendorff-perfüze tüm kalbinden SAN optik haritalama için, önemli enstrümantasyon adımlar LV içine küçük bir tüp yerleştirilmesini ve SVK ve IVC kapatılması sayılabilir. Eski sonraki i yanı sıra uzun vadeli deneyler sırasında çözüm tıkanıklığı bir basınç artışı önlerPerfüzyon çözeltisinin blebbistatin ve asitleştirme ile ventriküler kasılma bastırılması sonra schemia gelişimi. İkincisi, böylece perfüzyon çözeltisi ile atrium doldurma ve optik haritalama için tüm SAN alanını ortaya çıkarmak için intercaval bölgeyi düzleşme intra-atriyal basınç belli bir düzeyde tutmak için RA sağlar.

Son olarak, koroner boyama, boya yükleme alanı yanı sıra, önemli ölçüde daha önceki çalışmalarda kullanılan saf yüzey boyama ile karşılaştırıldığında daha uzun sürebilir SAN OAPs yoğunluğunu arttırabilir. 8,9

blebbistatin kullanımı için, dikkatle kullanılan, düşük toksisite, daha az belirgin yan etkiler ve yıkama direnci dahil olmak üzere diğer elektromekanik eşleşmeyenler kıyasla çok avantajlara sahiptir. O sıcaklıklarda çözülür az 37 ° C. 14 Blebbistatin kristalleri yerel neden böylece normal vasküler akışını kesmek olabilir ve zaman Blebbistatin çökeltileriiskemi ve provoke aritmik olaylar. Buna ek olarak 24, GFP veya diğer yeşil / sarı boyaların kullanımı çalışmalarda, blebbistatin yağış dikkate alınmalıdır etiketli hücreleri için yanlış olabilir. Çökeltme blebbistatin önlenmesi, yani basittir, tek bir 37 (a önceden ısıtılmış blebbistatin çözmek için var ° C ve daha yüksek) ve kuvvetli bir şekilde karıştırıldı ortam.

APD, (10 uM) blebbistatin yüksek konsantrasyonda kullanılabilir. 13,14,25 analiz etmek. kasılmayı arttıran herhangi bir ilaç kullanılması durumunda Benzer şekilde, blebbistatin ek uygulama tavsiye edilir.

Fare SAN elektriksel aktivitesini, düşük çözünürlüklü çoklu elektrot dizisi (bir kare 8 x 8 64 ayrı elektrotlar, 0.55 mm'lik bir elektrot arası mesafe ile konfigürasyonu) 26 arasındaki kısa mesafe yapılan ardışık cam mikroelektrot kayıtları incelemek için alternatif bir yöntem olarak impalements vs kadar 50 mikron / piksel çözünürlüğe sahip haritalama) ve AP morfoloji ya da eş zamanlı voltaj ve kalsiyum optik haritalama) gibi çok parametrik görüntüleme (için analiz etmek kullanılamaz. Cam mikroelektrot kayıtları AP genlik ve dinlenme potansiyelinin mutlak değerler de dahil olmak üzere AP morfolojisi hakkında daha fazla bilgi sağlamak olsa da, aynı zamanda düşük uzaysal çözünürlüğü ile sınırlıdır. Bu nedenle, sadece önde gelen kalp pilinin kararlı konumu için kullanılan ve lider kalp pili konumda atımdan-atıma değişiklikleri yakalamak için geçerli değildir olabilir. Aynı zamanda, daha önce 3,20 gösterdi ve bu çalışmada vurgulanan SAN OAB COiki fazlı bir sinyalin nsists whichincludes SAN ve atriyal miyokard AP parçaları (Şekil 4B) hem de. Bu nedenle saf SAN sinyali ayıklamak ve doğru SAN AP morfolojisi tahmin etmek zor hale getirir. Bu amaçla, cam Mikroelektronlar 17 veya izole SAN miyositler mevcut kelepçe yaklaşımı dikkate alınmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water jacket Radnoti 1660 Series Tissue Bath for Large Organ or Single Cell Isolation Procedures
water bath / circulator Fisher Scientific 1016S
pressure amplifier AD Instruments MLT0670
EMD Millipore Nylon Net Filters Fisher Scientific NY1102500
Pressure transducer AD Instruments MLT0670
Stainless Steel Minutien Pins - 0.1 mm Diameter Fine Science Tools 26002-10 
Perfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4LS
Superfusion pump World Precision Instruments PERIPRO-4HS
Vannas Tubingen scissors  World Precision Instruments 503379
Dumont forceps World Precision Instruments 501201, 500085
Mayo scissors World Precision Instruments 501750
Kelly hemostatic forceps World Precision Instruments 501241
Iris forceps World Precision Instruments 15917
Iris scissors World Precision Instruments 501263
ECG 12 mm needle (29-gauge) electrodes (monopolar)  AD Instruments MLA1203
in-line Luer injection port Ibidi 10820
Ultima-L CMOS camera  SciMedia MiCAM-05 
halogen lamp Moritex USA Inc MHAB-150W
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
RH237 ThermoFisher Scientific S1109
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
  2. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).
  3. Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).
  4. Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure. Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).
  5. Glukhov, A. V., et al. Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness. Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).
  6. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex. Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).
  7. John, R. M., Kumar, S. Sinus Node and Atrial Arrhythmias. Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).
  8. Swaminathan, P. D., et al. Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).
  9. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).
  10. Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).
  11. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  12. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. (55), e3275 (2011).
  13. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
  14. Swift, L. M., et al. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).
  15. Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).
  16. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).
  17. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).
  18. Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).
  19. Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).
  20. Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha. Nat Commun. 6, 6018 (2015).
  22. Hansen, B. J., et al. Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts. Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).
  23. Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart. J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).
  24. Kanlop, N., Sakai, T. Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations. J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).
  25. Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).
  26. Wu, J., et al. Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).

Tags

Biyofizik Sayı 118 optik haritalama Çin-atriyal düğüm fare kalp aksiyon potansiyeli
Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lang, D., Glukhov, A. V.… More

Lang, D., Glukhov, A. V. High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node. J. Vis. Exp. (118), e54773, doi:10.3791/54773 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter