Denne protokol beskriver fremstillingen og karakterisering af en dendrimer magnetisk resonans imaging (MRI) kontrastmiddel, som bærer cyclen baserede makrocykliske chelater koordinerende paramagnetiske gadolinium ioner. I en række MRI eksperimenter in vitro, denne agent produceret et amplificeret MRI-signal i forhold til det kommercielt tilgængelige monomere analoge.
Paramagnetiske komplekser af gadolinium (III) med acykliske eller makrocykliske chelater er de mest almindeligt anvendte kontrastmidler (CAS) for magnetisk resonans (MRI). Deres formål er at forbedre afslapning på vand protoner i væv, hvilket øger MR billedet kontrast og specificiteten af MRI målinger. Aktuelle klinisk godkendte kontrastmidler er lavmolekylære molekyler, der hurtigt udskilles fra kroppen. Brugen af dendrimerer som bærere af paramagnetiske chelatorer kan spille en vigtig rolle i den fremtidige udvikling af mere effektive MRI-kontrastmidler. Specifikt stigning i den lokale koncentration af de paramagnetiske resultater arter i et højere signal kontrast. Desuden er denne CA tilvejebringer en længere retentionstid væv gang på grund af den høje molekylvægt og størrelse. Her viser vi en bekvem fremgangsmåde til fremstilling af makromolekylære MRI-kontrastmidler baseret på poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimerer med monomacrocykliske DOTA-typen chelatorer (DOTA – 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetat). Det chelaterende enhed blev vedlagt ved at udnytte reaktiviteten af isothiocyanatet (NCS) gruppe mod amin overfladegrupper af PAMAM dendrimer til dannelse thiourinstof broer. Dendrimere produkterne blev oprenset og analyseret ved hjælp af kernemagnetisk resonansspektroskopi, massespektrometri og elementaranalyse. Endelig blev høj opløsning MR-billeder optaget og signalet kontraster opnået fra den forberedte dendrimere og de kommercielt tilgængelige monomere midler blev sammenlignet.
Magnetisk resonans (MRI) er en stærk og ikke-ioniserende billeddannelsesteknik meget udbredt i biomedicinsk forskning og klinisk diagnostik grundet dens invasiv karakter og fremragende iboende bløddele kontrast. De mest almindeligt anvendte MRI-fremgangsmåder udnytter signalet opnået fra vandprotoner, der giver billeder i høj opløsning og detaljerede oplysninger inden for de væv baseret på forskelle i densiteten af vand signaler. Signalet intensitet og specificiteten af MRI eksperimenter kan forbedres yderligere ved hjælp af kontrastmidler (CAS). Disse er paramagnetiske eller superparamagnetiske arter, der påvirker den langsgående (T 1) og tværgående (T2) relaksationstider henholdsvis 1,2.
Komplekser af lanthanidionen gadolinium med polyaminosyrer polycarboxylsyreestere ligander er de mest almindeligt anvendte T 1 CA'er. Gadolinium (III) forkorter afslapning T 1tid af vand protoner, hvilket øger signal kontrast i MRI eksperimenter 3. Men ionisk gadolinium er giftigt; dens størrelse tilnærmer at calcium (II), og det har alvorlige konsekvenser for calcium-assisteret signalering i celler. Derfor er acykliske og makrocykliske chelater anvendes til at neutralisere denne toksicitet. Forskellige multidentate ligander er blevet udviklet hidtil, hvilket resulterer i gadolinium (III) komplekser med høj termodynamisk stabilitet og kinetisk inerthed 1. De er baseret på de 12-leddede azamacrocycle cyclen, især dens tetracarboxylsyre derivat DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododecan-1,4,7,10-tetraacetat) er de mest undersøgte og anvendte komplekser af denne CA klasse.
Alligevel GdDOTA-typen CA'er er lavmolekylære systemer, der udviser visse ulemper, såsom lav kontrast effektivitet og hurtig renal udskillelse. Makromolekylær og multivalente CA'er kan være en god løsning på disse problemer 4. Da CA biodistribution er primært bestemt af deres størrelse, makromolekylære CA'er vise meget længere opholdstider inden væv. Lige så vigtigt, at multivalensen af disse midler resulterer i en forøget lokal koncentration af det monomere MR probe (f.eks GdDOTA kompleks), væsentligt forbedrer erhvervet MR-signalet og kvaliteten måling.
Dendrimerer er blandt de mest foretrukne stillads til fremstilling af multivalente CA'er til MRI 4,5. Disse stærkt forgrenede makromolekyler med veldefinerede størrelser er tilbøjelige til forskellige koblingsreaktioner på deres overflade. I dette arbejde, rapporterer vi forberedelse, rensning og karakterisering af en dendrimer CA for MRI bestående af en generation 4 (G4) poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimer koblet til GdDOTA-lignende chelater (DCA). Vi beskriver syntesen af den reaktive DOTA-derivat og dets kobling til PAMAM dendrimeren. Efter kompleksdannelse med Gd (III), standard fysisk-kemiske karakterisering Procedure af DCA blev udført. Endelig blev udført MRI eksperimenter for at demonstrere evnen af DCA til at producere MR-billeder med en stærkere kontrast end dem, der opnås fra lav molekylvægt CA'er.
Fremstilling af dendrimere MRI-kontrastmiddel kræver passende udvælgelse af den monomere enhed (dvs. chelatoren for Gd (III)). De reducerer toksicitet af denne paramagnetiske ion og til dato, en bred vifte af acykliske og makrocykliske chelateringsmidler tjener dette formål 1-3. Blandt disse makrocykliske DOTA-typen chelatorer besidder den højeste termodynamiske stabilitet og kinetisk inerthed og dermed er de mest foretrukne valg til fremstilling af inert MRI kontrastmidler 1,18. Endvi…
The authors have nothing to disclose.
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Cyclen | CheMatech | C002 | |
tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
Diethyl ether | any source | ||
Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
n-Hexane | any source | For column chromatography | |
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
Methanol | any source | For column chromatography | |
Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
Sintered glass funnel | any source | ||
Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
Magnetic stirrer | any source | ||
PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
Lophylizer | any source | ||
Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
pH meter | any source | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
Centrifuge | any source | ||
NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
Topspin | Bruker | version 2.1 | |
Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
Vortex mixer | any source | ||
Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
Plastic tube vials | any source | ||
Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |