Summary
このプロトコルは、常磁性のガドリニウムイオンを配位シクレンベースの大環状キレートを担持デンドリマー磁気共鳴イメージング（MRI）造影剤の調製および特徴付けを記載します。市販の単量体のアナログと比較した場合、in vitroでのMRI一連の実験では、このエージェントは、増幅されたMRI信号を生成しました。
Abstract
非環状または大環状キレートとガドリニウム（III）の常磁性錯体は、磁気共鳴画像（MRI）のために最も一般的に使用される造影剤（CAS）です。その目的は、このようにMR画像のコントラストとMRI測定の特異性を増加させる、組織中の水プロトンの緩和速度を高めることです。現在臨床的に承認された造影剤は、急速に身体から除去される低分子量分子です。常磁性キレートのキャリアとしてのデンドリマーの使用は、より効率的なMRI造影剤の将来の発展に重要な役割を果たすことができます。具体的には、より高い信号は対照的に、常磁性種の結果の局所濃度の増加。さらに、このCAは、その高い分子量およびサイズによる長い組織滞留時間を提供します。ここでは、ポリ（アミドアミン）に基づく高分子MRI造影剤（PAMAM）monomacro有するデンドリマーの調製のための便利な手順を示します巡回DOTA型キレート剤（DOTA - 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン1,4,7,10-四酢酸）。キレート化ユニットは、チオ尿素架橋を形成するために、PAMAMデンドリマーのアミン表面基に対してイソチオシアネート（NCS）基の反応性を利用することによって付加しました。デンドリマー生成物を精製し、核磁気共鳴分光法、質量分析、および元素分析によって分析しました。最後に、高解像度のMR画像を記録し、準備デンドリマー及び市販のモノマー剤から得られる信号のコントラストを比較しました。
Introduction
磁気共鳴イメージング（MRI）は、その非侵襲的性質と優れた固有の軟組織のコントラストに広く生物医学研究および臨床診断に使用される強力な非イオン化イメージング技術です。最も一般的に使用されるMRI法は、水信号の密度の差に基づいて組織内の高解像度画像と詳細情報を提供し、水のプロトンから得られる信号を利用します。信号強度およびMRI実験の特異性は、さらに、造影剤（CAを）使用して向上させることができます。これらは、それぞれ、長手方向（T 1）と横方向（T 2）緩和時間に影響を与える常磁性または超常種、1,2です。
ポリアミノポリカルボン酸リガンドとランタニドイオンのガドリニウム錯体は、最も一般的に用いられるT 1のCAです。ガドリニウム（III）は、T 1緩和を短縮します水プロトンの時間、従ってMRI実験3における信号のコントラストを増加させます。しかし、イオンガドリニウムは有毒です。そのサイズは、カルシウム（II）のことを近似し、それが真剣に細胞内のカルシウム補助シグナル伝達に影響を与えます。したがって、非環状および大環状キレートは、この毒性を中和するために使用されます。様々な多座配位子は、高い熱力学的安定性と運動不活性1とガドリニウム（III）錯体が得られ、これまでに開発されてきました。特に12員azamacrocycleシクレン、そのテトラ派生DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン1,4,7,10-四酢酸）に基づくものは、ほとんど調査され、このCAクラスの複合体を適用しています。
それにもかかわらず、GdDOTA型CAは、このような低コントラスト効率および高速腎排泄のようなある種の欠点を表示する、低分子量のシステムです。高分子および多価CAは、これらの問題4への良好な溶液であってもよいです。 CA biodistribuので、ションは、主にそのサイズによって決定され、高分子CAは組織内はるかに長い保持時間を表示します。実質的に収集されたMR信号と測定品質を向上させる、モノマーMRプローブ（ 例えば、GdDOTA複合体）の増加した局所濃度におけるこれらの薬剤の結果の多価性、同様に重要。
デンドリマーは、MRI 4,5のための多価CAの製造のための最も好ましい足場中にあります。明確に定義されたサイズを有するこれらの高度に分岐した巨大分子は、その表面上の様々なカップリング反応を受けやすいです。本研究では、第4世代（G4）は、ポリ（アミドアミン）GdDOTAのようなキレート（DCA）に結合された（PAMAM）デンドリマーからなるMRI用デンドリマーCAの準備、精製、および特徴付けを報告します。我々は、反応性DOTA誘導体の合成とPAMAMデンドリマーへの結合について説明します。 Gd（III）、標準的な物理化学的特性評価との複合体形成時に。手順DCAの再実施しました。最後に、MRI実験は、低分子量のCAから得られるものよりも強いコントラストでMR画像を生成するDCAの能力を実証するために行きました。
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Protocol
DCAの調製
- モノマー単位4 6の合成。
- 4-の合成（4-ニトロフェニル）-2-（4,7,10-トリス- ターシャ -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10--tetraazacyclododec -1-イル）酪酸tert-ブチルエステル（2）。
- （4,7-ビス- ターシャの -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-テトラアザ- cyclododec -1-イル） -酢酸tert-ブチルエステル1（1.00 gであり、1.94ミリモル）のN、N-ジメチルホルムアミド（中に溶解DMF 5 ml）を、0.67 gであり、4.86ミリモル、2.5当量（炭酸カリウムを加える）し、45分間室温で混合物をかき混ぜます。
注：大環状化合物1は、シクレンから調製した及びtert-以前に公開されている手順7に従ってブロモ酢酸ブチル。 - tert-ブチル2-ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタノエート追加（0.87 gであり、2.53ミリモル、1.3当量）を1時間にわたって一部分ずつ。トンの下で混合物を攪拌し続けます彼は次の18時間、同じ反応条件。
注：-tert-ブチル-2-ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタノエートを、以前に公開された手順8に従って、4-（4-ニトロフェニル） -酪酸、塩化チオニル、および臭素から調製しました。 - 40-60°Cの9でバルブ・ツー・電球真空蒸留によってDMFを除去します。
- 褐色の無定形固体（1.09 gの72％）10として生成物2を得るために、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、7％メタノール/ジクロロメタン）により残渣を精製します。
- （4,7-ビス- ターシャの -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-テトラアザ- cyclododec -1-イル） -酢酸tert-ブチルエステル1（1.00 gであり、1.94ミリモル）のN、N-ジメチルホルムアミド（中に溶解DMF 5 ml）を、0.67 gであり、4.86ミリモル、2.5当量（炭酸カリウムを加える）し、45分間室温で混合物をかき混ぜます。
- 4-の合成（4-アミノフェニル）-2-（4,7,10-トリス- ターシャ -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10--tetraazacyclododec -1-イル）酪酸tert-ブチルエステル（3）。
- ニトロベンゼン誘導体2エタノール中の（1.00 gであり、1.28ミリモル）（10ml）およびメタノール（150μL）中の7 Nアンモニア溶液に溶解します。 solutiの触媒（Pd / Cを、150mgの、15重量％）と活性炭上のパラジウムを追加に。
- パール水素化装置で水素雰囲気（2.5バール）下で16時間不均一な混合物を振ります。
- エタノールに懸濁し、焼結ガラス漏斗を通して懸濁液を濾過することにより珪藻土のケーキを準備します。濾過によりPd / C触媒を除去するために準備されたケーキの上に1.1.2.2からサスペンションを注ぎます。
- 褐色の非晶質固体（0.91グラム、95％）として化合物3を得るために、ロータリーエバポレーター（水浴温度〜40°C）で穏やかな蒸留により溶媒を除去します。
- 4-（4-イソチオシアナトフェニル）-2-（4,7,10-トリス- ターシャ -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec -1-イル）酪酸tert-ブチルエステル（4）の合成。
- （0.685 mlの4.87ミリモル、4当量）3（0.91 gであり、1.22ミリモル）の混合物に、チオホスゲン（0.124 mlであり、1.58ミリモル、1.3当量）を加え、トリエチルアミン、ジクロロメタン（15ml）に。
- 激しく反応マイルをかき混ぜます16時間室温でマグネチックスターラーを固定装置。
- ロータリーエバポレーター（水浴温度〜40℃）で穏やかに蒸留により溶媒を除去し、次いで固体無定形淡褐色の生成物4を得るために、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、5％メタノール/ジクロロメタン）によって粗生成物を精製します（0.51 gであり、53％）。
- 4-の合成（4-ニトロフェニル）-2-（4,7,10-トリス- ターシャ -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10--tetraazacyclododec -1-イル）酪酸tert-ブチルエステル（2）。
- デンドリマーDCAの合成。
- デンドリマー5の合成。
- （4ミリリットル）G4-PAMAMデンドリマーを取る（667 mgを、メタノール中10％デンドリマー溶液を、4.67マイクロモル）、ロータリーエバポレーター（水浴温度〜40°C）で穏やかな蒸留によりメタノールを蒸発させ、そしてDMF中で残留物を溶解。
- トリエチルアミンを追加（0.105ミリリットル、0.75ミリモル、160当量）を、60℃で45分間撹拌し、イソチオシアネート4追加（354ミリグラム、0.45ミリモル、1.5当量を。デンドリマーのアミノ表面基に対して）ずつのオベR 1時間。
- 48時間45℃でマグネチックスターラーを用いて反応混合物を撹拌しました。
- 40-60℃でバルブ・ツー・電球真空蒸留により溶媒を除去します。
- 溶離液として、親油性ゲル濾過媒体とメタノールを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって残留物を精製します。列をパックするために、圧力を加えることなく、室温（>粉末1gあたりのメタノール4ミリリットル）で少なくとも3時間、メタノール中に濾過媒体を膨潤させます。 1mlの画分を回収することにより比重分離を実行します。
- 薄層クロマトグラフィー（TLC）で回収した画分を分析します。 （ベースライン上に位置する唯一の最も極性のスポットは樹枝状生成物から誘導される）15％メタノール/ジクロロメタン中のTLCプレートを開発。生成物5（270 mgを、91％）を得るために、ロータリーエバポレーター（水浴温度〜40℃）で穏やかに蒸留によって回収した画分を蒸発させます。
- デンドリマーの合成
- ギ酸（5ml）中の保護されたデンドリマーキレート剤5（270 mgを、4.23モル）を溶解し、24時間60℃で混合物をかき混ぜます。
- ロータリーエバポレーター（〜15ミリバールの圧力、水浴温度〜40℃）で蒸留によりギ酸を蒸発させ、凍結乾燥製品を6（圧力〜0.2ミリバール）9を得ました。
- デンドリマー5の合成。
- デンドリマー造影剤の合成（DCA）
- 水中でのデンドリマーキレート剤6（4.35マイクロモル）を溶解し、0.1M水酸化ナトリウムでpHを7.0に調整します。
- 水（1ml）中のGdCl 3・6H 2 O（113 mgを、304マイクロモル）を溶解し、4時間かけキレート剤6の溶液に滴下し加えます。 pHメーターでpHを測定することにより、水酸化ナトリウム溶液（0.05 M）でpHを7.0に維持します。
- 部屋トンでマグネチックスターラーで混合液を撹拌24時間emperature。
- 水酸化ナトリウム水溶液（0.05 M）でpHを7.0に維持しながらのGd（III）の過剰を除去するために4時間かけて溶液ずつにエチレンジアミン四酢酸（EDTA、158ミリグラム、426モル）を加えます。 24時間、室温で混合物を撹拌しました。
- GdEDTAの過半数とEDTAの過剰を除去するために、サイズ排除クロマトグラフィーを実行します。列をパックするために、水中で膨潤した親水性ゲル濾過媒体を使用してください。適切な音量に混合物を削減し、列をロードします。圧力を加えることなく、脱イオン水でカラムを溶出します。
- GdEDTA及びEDTAの残留物を除去するために遠心力1,800×gで30分間、3 kDaの遠心フィルターユニットを用いて試料を遠心。ろ液をEDTAとGdEDTAの不在を示すまで（5回程度）、この手順を繰り返します。最終的なDCAをオフホワイトの生成物を得るために、フラスコに試料を移すことを蒸発させ、次いで溶媒を凍結乾燥（186 mgを、71％）。
注：ESI-MSを用いてEDTAおよびGdEDTAの不在を確認してください。 - キシレノールオレンジテストを用いて遊離イオンとしてのGd（III）が存在しないことを確認してください。酢酸緩衝液（pH 5.8）中の濾液（0.5ml）に溶解します。 11（黄色や紫の色はそれぞれ、溶液中の遊離のGd（III）イオンの有無を示す）キシレノールオレンジ溶液を数滴を追加し、色の変化を追跡します。
デンドリマー製品のインビトロ特徴2.
- （DOTAのような大環状化合物とデンドリマーのローディング）PAMAMデンドリマーに結合された大環状DOTA-単位数の推定
- 1 H NMR（ -核磁気共鳴分光法NMR）で推定。
注：この手順では、デンドリマー5と6上ではなく、DCAで可能です。- 1 H NMRスペクトル12を記録します。
- それぞれ、デンドリマー5および6のためか、単に脂肪領域と、芳香族領域と二つの別々の脂肪族領域（ トン -buグループの2信号脂肪族デンドリマーおよび大環状プロトンの1信号）を統合します。
注：彼らが加水分解されているので、脂肪族領域は、デンドリマー6にトンの -buグループから発信さに全く別個の信号がありません。 - 式を使用してください。 1または式。図2は、Rは、積分の比=大環状ユニットの数（n）は 、推定する（式1または脂肪族-デンドリマー中の芳香族脂肪族/ /脂肪族式のT-富栄。2）、Hの DEND =プロトン数デンドリマーに、H Arは芳香族プロトンの数は、H トン Buは トンの -buグループ内のプロトンの数を= =、およびH マックは、1マクロサイクルでプロトンの数を=。
注：いずれかの式。 1または式。図2は、foを使用することができますRデンドリマー5、唯一の式ながら。図1は、デンドリマー6のために使用することができます。交換可能なプロトンは、（アミン、アミド、チオ尿素、またはカルボキシレートで）、典型的に重水素で置換されているので、計算で想定されていませんでした。ここで、Hは、DEND（5用）= 1,128又は千（6）H のAr = 4、及びH MAC = 27を使用しました。
（1） 
（2）
- 硫黄と窒素の比を用いて元素分析から推定。
- 固体デンドリマーサンプル（この作業でDCA）の元素分析を行います。
- 式を使用してください。図3は、Rが決定％のNおよび％S、Nの DEND またはS DENDの比=大環状ユニットの数（N）、=の数を推定します窒素または硫黄原子デンドリマーであり、N MACまたはS マック = 1大環状単位中の窒素または硫黄原子の数。
注：係数2.29は、硫黄及び窒素の原子質量における比から得られます。この研究では、Nの DEND = 250、Sの DEND = 2、N MAC = 5、およびS MAC = 1を使用しました。
（3）
- マトリックス支援レーザー脱離/飛行（MALDI-TOF）のイオン化時間で推定。
- MALDI-TOF MS分析13を実行します 。
- 式に従った大環状ユニットの数（n）を計算します。 4、M zは = =デンドリマー部分の質量、およびM Macは 1大環状ユニットの質量を観測質量（のm / z）はz =種の電荷、Mの DEND =。
NOTE：Mの DEND = 14306およびM MAC = 719は、この作業で使用しました。
（4）
- 1 H NMR（ -核磁気共鳴分光法NMR）で推定。
- DCA濃度の決意（[DCA]）：バルク磁化率測定（BMS）
- プラスチックバイアルチューブ（[DCA]〜5-10 mM）の水（360μL）中のDCA（5-10 mg）を溶解させます。
注：[DCA]δ= 4.7 ppmの水の共鳴で、> 15 mMの試料濃度でT-BuOHの共鳴の可能な重複を避けるために、5〜10 mMの範囲にあるべきです。 - DCAの水溶液に：（1 V / V 2）とボルテックスミキサーを使用して得られた溶液（420μl）を混ぜT-BuOHの混合物を：D 2 O60μlのを追加します。
- 外NMRチューブにサンプルの400μLを移し、T-BuOHのと同軸NMR挿入管を配置する：H 2 O混合物（10:90 v / v）のサンプル管に。
- 記録1 H NMRスペクトル内外NMRチューブ中のBuOH（基準）12 T-由来共鳴信号との間の周波数シフトを測定します。
- 式を使用してください。 5 Tは絶対温度= [DCA]を決定するために、Δχは、記録されたシフト=のGd（III）14、およびs =定数に依存するためのランタニドイオンのためEFF =有効磁気モーメント（μEFF = 7.94、μサンプルの形状や磁場（それぞれ0、1/3、および磁場に垂直な球体に気筒パラレル、およびシリンダーの場合は1/6、）内のその位置に依存します。
注：BuOHを溶液（60μl）をT-：[DCA]に対して得られた計算値が原因でD 2 Oの添加に元の濃度に補正する必要があります。
（5）
- プラスチックバイアルチューブ（[DCA]〜5-10 mM）の水（360μL）中のDCA（5-10 mg）を溶解させます。
- 動的光散乱（DLS）測定。
- 濾過DCA溶液を調製（0.2μmのポリテトラフルオロエチレン/ PTFEフィルター、Gdの当たり0.75ミリ（III））、4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液（25mMの、pHが7.4）にそれを転送しますDLS測定用キュベット。
- DLS装置にキュベットを配置し、以下のパラメータを設定します。記録に30秒前にスキャンの間および温度平衡との遅延なし15スキャン（1スキャン= 12秒、屈折率= 1.345、吸収= 1％）の5回繰り返しを。
- 取得したデータをエクスポートし、サイズ（流体力学直径）の関数としての人口（％）をプロットすることにより、サイズ分布ヒストグラムを得ます。
- 縦及び横緩和の測定。
注：同様の手順は、既に緩和時間分析器15を用いて説明しました。この手順では、トップスピンを持つ300MHzのNMR分光計を用いて行きましたソフトウェア。- H 2 O中のDCAソリューションのセットを準備します：D 2 O（500μL、H 2 O中10％のD 2 O、[DCA] = 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、および5.0 mMの、[HEPES ] = 25 mM）のDCAストックサンプルから（セクション2.2を参照）。
- NMRチューブに溶液を450μLを移し、機器にそれを置きます。
- （（O 1）オフセット90°励起パルスの持続時間（P1）、および照射周波数）取得パラメータを最適化し、その後、反転回復（IR）を使用し、カー・パーセル・Meiboom-ギルT 1およびT 2実験を行う（CPMG ）パルスシーケンス、それぞれ。
- T 1及びT 2緩和時間の決意。
- F2次元で記録された測定、プロセスの2Dスペクトルを選択して、インタラクティブな位相補正を行います。
- 分析/ Tに適切なスライス（最大強度を有するピーク）を選択します
- T 1またはT 2緩和時間を得るために、適切なフィッティング関数（IRおよびCPMG実験用invrecまたはuxnmrt2、それぞれ）を選択します。
- すべての[DCA]残りの解決のための手順を繰り返し2.4.4.2-2.4.4.4。
- 得られたT 1値から緩和速度（R 1とR 2）を計算する （R 1,2 = 1 / T 1,2）。
- mMの中のGd（III）濃度の関数としてプロットR 1及びR 2（秒-1）。
- 式で定義されるように、近似直線の傾きから、縦方向および横方向の緩和を決定し、R 1およびR 2（MM -1秒-1）。 6、R I、OBS =の長手方向（I = 1）または横（I = 2）反磁性緩和速度実験に用いた常磁性種が存在しないと[Gdの] =のGd（III）の濃度で水。
（6）
（1） 
（2） 
（3） 
（4） 
（5） 
（6） インビトロ MRI 3.。 DCAとGdDOTAの比較
- チューブファントムの作製
- 造影剤の濃度が算出される2セットの実験のためのDCA（4×350μlの）とGdDOTA（4×350μlの）だけでなく、水試料（4×350μlの）の水溶液を準備します（3.1.1.1）をGd（III）または（3.1.1.2）ごと分子当り。
- 2 DCAサンプルおよび2 GdDOTAを準備します それぞれのGd（III）、0.5及び1.0 mMの濃度を有するサンプル。さらに、（対照チューブなど）は、2つの水試料を準備します。
- 2 DCAサンプル（2.5及びGd（III）または0.05あたり5.0ミリモルおよびデンドリマー分子あたり0.1ミリモル）、2 GdDOTAサンプル（0.25、0.5 mMの）と2つの水試料を準備し（制御リットル管）。
注：適切なDCAとGdDOTA濃度は、HEPES緩衝液（pH7.4）で（セクション2.2を参照）BMS法により測定された濃度で、それぞれの株式のサンプルを希釈することにより調製されるべきです。計算を簡単にするために、N = 50がデンドリマー分子あたり大環状単位の平均数を想定しました。従って、DCAの比、分子ごとに計算し、5：GdDOTA 1でした。
- 溶液中の気泡の存在を回避し、300μlのプラスチックバイアルチューブ内のサンプルを配置します。
注：プラスチックバイアルチューブのサイズは、使用無線周波数コイルの種類とサイズによって異なります（ここでは、ボリュームコイルとの例が与えられています）。 - シリンジ（60ミリリットルの容量）内部のサンプルを挿入し、1 mMのGdDOTAでそれを埋めます 解決策は、スキャナに配置します。
注：サンプルは、磁場の中で感受性の影響（変動を避けるために、GdDOTAの水溶液に入れました異なる磁化率の物質間の近くのインターフェイスを発生trength）。
- 造影剤の濃度が算出される2セットの実験のためのDCA（4×350μlの）とGdDOTA（4×350μlの）だけでなく、水試料（4×350μlの）の水溶液を準備します（3.1.1.1）をGd（III）または（3.1.1.2）ごと分子当り。
- パラメータ最適化およびイメージング。
- 磁石のアイソセンタにサンプルでシリンジを配置するために、解剖学的スキャン（ローカライザー/ Tripilot）を使用します。
- ボリューム全体、中心周波数（O 1）、受信機ゲイン（RG）、および送信利得（TX0とTX1）の（磁場均一の調整）をシミングするための調整を行うための交通信号灯（調整スキャン）を押します。
- T 1強調（T 1ワット ）イメージングでは、高速ローアングル（FLASH）メソッドを選択します。
- ローカライザーのスキャンを使用してスキャナーに（シリンジ水平）垂直に配置サンプルのための冠状スライスを選択してください。
- 式を使用してください。コントラスト対雑音（CNR）取得の最適化のための7はα=フリップ角は、TEはエコー時間を= 16、パラメータ、TR =繰り返し時間、T 1、A、T 1は、Bは、（CNRが最大化されるべき対象の試料A（T 1、A）のT 1時間、サンプルB（T 1、Bを ）=同じことが有効ですT 2回：T 2、A及びT 2、B）。
注：T 1およびT 2緩和時間はTE、TRながら、縦方向と横方向の緩和（セクション2.4）の測定から得られた値に設定する必要があり、そしてαは、CNRの最適化計算から得られるべきです。
（7） - 前のステップ（3.2.5）において得られたパラメータを用いて画像を取得します。
- 信号対雑音比（SNR）を計算します。
- 画像表示＆処理に取り込まT 1ワット画像（スキャン）をロードウィンドウ、および関心領域 （ROI） を定義します ]をクリックします。
- 円形ROIを選択して、試料位置とバックグラウンドでそれを描きます。続いて、平均信号振幅（S 信号 ）とバックグラウンド（S ノイズ ）の標準偏差を得るために、 表示をクリックしてください。
- DCA、GdDOTA、および水試料のための手順を繰り返し3.2.7.2。
- 式を用いてSNRを計算します。SNR = S 信号 / S ノイズ 。
- わずかに変更された手順に従って、緩和強化（RARE）メソッドを使用して迅速な取得を使用して、T 2強調（T 2ワット ）撮影を行います。 CNR取得パラメータの最適化のために、式を使用します。 8。
（8）
（7） 
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Representative Results
DCAの調製は、2つのステージから構成：1）モノマーDOTA型キレート剤の合成（ 図1）及びG4のPAMAMデンドリマーと複合体デンドリマーのGd（III）の後続の製造とキレート剤の2）カップリング（ 図2） 。第一段階では、4つのカルボン酸を含有するシクレン系DOTA型キレート剤およびさらなる合成修飾に適した直交群を作製しました。 tert-ブチル2-ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタノエート8でアルキル化した1（DO3A- tert-ブチルエステル）7から開始し調製は、2 DOTA誘導体を提供します。パラジウム触媒水素化は、アニリン3を得2芳香族ニトロ基を減少させました。チオホスゲンと3の変換はwhic、イソチオシアネート4をもたらしましたhは以前にデンドリマーのCA 17の調製のためのアミン反応剤として使用しました。
次の段階では、大環状化合物4は、市販G4 PAMAMデンドリマーにカップリング反応に塩基性モノマー単位として使用しました。デンドリマーのアミン表面基は、塩基の存在下でモノマー4のイソチオシアネート基と反応します。 4の過剰は、溶離液としてメタノールを用い、親油性ゲル濾過媒体を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去しました。得られたデンドリマー大環状複合体5のtert-ブチルエステルは、次いで、凍結乾燥し、精製せずに次の工程に使用した6を生成するギ酸で加水分解しました。 DOTA型大環状分子ののGd（III）錯体の形成は、水溶液OへのGdCl 3・6H 2 Oを添加することによって行いましたF 6のGd（III）の約7過剰でpHを維持しながら、共通のキレート剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）と複合体を形成しました。 GdEDTA複合体および過剰のEDTAを溶離液として水を用いて親水性ゲル濾過媒体を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって、システムから除去されました。残りの小型不純物を3 kDaの遠心濾過ユニットを用いて遠心分離により溶液から除去しました。
デンドリマー - 大環状複合体の合成に続いて、合わせた分析的アプローチは、製品を特徴付けるために使用されています。 5と6の表面アミンの占有率を決定するために、1 H NMRスペクトルは、分析されています。結果を比較し、大環状化合物とデンドリマーのローディングを元素分析及びMALDI-TOF質量分析法を用いて推定された最終製品（DCA）、（ 図で確認しました。3）。これらの3つの方法の組み合わせは、〜75％のアミン表面基の占有率に対応G4デンドリマーに共役さ49大環状単位の平均値をもたらしました。
デンドリマー複合体のさらなる特徴付けは、6.2±0.1縦緩和のためのGd（III）（またはおおよそ約300 mMの-1秒-1のデンドリマーあたり）あたりmMの-1秒-1および30.5±で、その結果、緩和能値の決意を含ま0.6 mMの-1秒-1のGd（III）（ほぼ1500 mMの-1秒-1のデンドリマーあたり）あたりの横緩和能のために。 DLS測定は、DCA（ 図4）、7.2±0.2nmでの流体力学直径を示しました。
最後に、デンドリマーのMRI造影剤の効果を実証するために、MRイメージングは、DCAとクリニックでファントムの二組で行いました比較のために味方利用可能GdDOTA（ 図5）。第二の組は、それぞれ、デンドリマーおよび単量体造影剤の同等の分子濃度で効果を発揮するように設計している間にファントムの最初のセットは、同一のGd（III）濃度でこれら二つの造影剤の比較のために調製しました。
図1： 大環状DOTA型キレート剤4試薬、条件、および単離された収率の合成 ：（I）-tert-ブチル2-ブロモ-4-（4-ニトロフェニル）ブタン、K 2 CO 3、DMF、45°C 、16時間、72％; （II）H 2、Pd / Cを、EtOH中、室温、16時間、95％。 （iii）のCSCL 2、Et 3 Nを、RT、2時間、53％。 このFiのの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。グレ。
図2： デンドリマーMRI造影剤DCAの合成試薬および条件：（ⅰ）4、Et 3 Nを、DMF、45℃、48時間、91％; （ii）のギ酸、60℃、24時間、定量。 （ⅲ）のGdCl 3∙6H 2 O、pHが7.0、RT、24時間、71％。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：MALDI-TOF 質量分析法により樹枝状生成物の特性 DCAについて得られた典型的なMALDI-TOF質量スペクトル。目標確認= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 動的光散乱（DLS）によるデンドリマー製品の特性 DCA（HEPES、pH7.4）でのDLS測定は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：7 Tの磁場で管ファントム上の インビトロ MRI実験 DCAとGdDOTAの（a、b）は T 1強調及び（c、d）の T 2強調MRI。各MRI実験を用いて行きました造影剤の二つの異なる濃度：（C）同等のGd（III）濃度（HEPES、pH7.4）で。 1のGdDOTA濃度比：DCAと（B、D）5（HEPES、pHは7.4）。濃度は、分子当たりに発現され、SNR値は括弧内に表示されています。視野（FOV）= 40×40 mm 2の、スライス厚= 0.5 mmであり、励起（NEX）= 30の数、これらの実験で使用されるパラメータでした（a）は、マトリクスサイズ（MTX）= 256×256、繰り返し時間（TR）= 100ミリ秒、エコー時間（TE）= 2.95ミリ秒、フリップ角（FA）は90°、取得時間（TA）= 12分48秒= ; （b）は MTX = 256×256、TR / TE = 20 / 2.95ミリ秒、FA = 90°、TA = 2分34秒。 （c）は MTX = 512×512、TR / TE =万/ 130ミリ秒、レア因子（RF）= 16、TA = 26分40秒。 （d）の MTX =×512 512、TR / TE =万/ 100ミリ秒、RF = 16、TA = 26分40秒。776fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
デンドリマーのMRI造影剤の調製は、モノマー単位の適切な選択を必要とする（ すなわち、Gdのためのキレート剤（III））。彼らは、この常磁性イオンの毒性を低減し、これまでに、非環式の多種多様な大環状キレート剤は、この目的の1-3を果たします。これらの中で、大環状DOTA型キレート剤は、最も高い熱力学的安定性及び速度論的不活性を有し、従って、不活性なMRI造影剤1,18の製造のための最も好ましい選択です。さらに、それらは依然として安定したGd（III）19複合体を形成しながら（ベクターまたはナノキャリアをターゲティングなど ）様々な機能性分子に結合可能な二官能性キレート剤をもたらす種々の合成変換、やすいです。この目的のために、この手順で説明したDOTA型のモノマー単位がDO3A- tert-ブチルエステルを、一般的で容易に入手可能な前駆体、及び臭化物誘導体から調製しました。4-（4-ニトロフェニル）ブタン酸。この分子は、DOTAから誘導及びGd（III）を調整するために類似の構造を保有します。合成修飾は、様々な機能性分子および担体へのカップリング反応に、このキレート剤が起こりやすいことを目指します。すなわち、キレート剤でDOTA-修飾された分子の結果の準備がまだのGdへの調整のために利用可能な4カルボキシル基と（III）不活性複雑で、変換時にデンドリマーの表面に、このキレート剤を添付直交ニトロフェニル基を形成します。この手順はまた、好ましい方法で所望のキャリアに結合するためのGd（III）キレート剤を提供することができ、直交反応性基（ 例えば、NH 2またはCOOH）、の選択に柔軟性を可能にします。
得られた二官能性キレート剤は、二つの異なる方法（ すなわち、合成手順）中の他の分子に結合することができます。ニトロ基をアミノ基に還元された場合、得られたアニリン下缶他の分子8のカルボン酸基との縮合反応を行きます。また、チオホスゲンの存在下で、芳香族第一級アミン官能基は容易にイソチオシアネート、容易にデンドリマー17モノマー単位の結合のために、より反応の可能性を提供し、極性有機溶媒ならびに水でアミンと反応する基に変換することができます、20,21。
デンドリマーキャリアに二官能性キレート剤を結合するために、適切な樹枝状の足場を選択する必要があります。最終的なデンドリマー複合体の構造と所望のアプリケーションに関連するいくつかの要因が、この段階で考慮されるべきです。デンドリマー担体の幅広い商業的利用可能性のために、異なるコア構造、表面反応性基、または世代を有する製品を選択することができます。つつ、結合反応は、デンドリマーとキレート剤の直交群の表面基に依存します最終的な複合体は、荷電、中性、または22（デンドリマー世代に応じて、15〜20ナノメートルまで）異なるサイズを有していてもよいです。これらは溶解性、緩和（MRIシグナル増強）、拡散、及び潜在的にMRIでの応用を危険にさらすことができ、造影剤の他の薬物動態学的特性に影響を与える可能性があるので、すべてのこれらの態様は、前デンドリマーCAの調製に考慮されるべきです。例えば、カチオン性デンドリマーは、生物系に毒性を示すことができます。しかしながら、この効果は、それにより、それらの全体として正の電荷23を減少させる、デンドリマーの表面上の負に荷電した基の結合によって減少させることができます。
このプロトコルでは、我々は、単量体の大員環4のイソチオシアネート基が64第一級アミン表面基を搭載した商用シスタミンコアG4-PAMAMに結合された手順を使用して、DCAデンドリマー、造影剤を用意しました。 hydrophの最初の精製OBICデンドリマー生成物5は、未反応のモノマー単位の大部分を除去するために、溶離液として、親油性ゲル濾過媒体及びメタノールを用いてカラムを用いたゲルクロマトグラフィーにより行いました。ギ酸でのtブチルエステルの加水分解は、親水性ゲル濾過媒体を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することができる水溶性デンドリマー生成物が得られ、簡単です。 Gd（III）を有する多量体及びデンドリマーキレート剤の錯体は、複合体形成を促進するために、中性pHで溶液を維持しながら行いました。それ以外の場合は、（塩化物塩として添加される）のGdの錯体（III）は、反応が遅く、pH値を低下させます。最後に、それは、だけDOTA単位でキレート化することができませんでした過剰のデンドリマーコア内のアミン基ものGd（III）と調整する傾向があることは注目に値します。 DOTAキレート剤外のGd（III）の存在を回避することは、ルので、必須ですCAからのGd（III）のakageは望ましくない効果を有していてもよいです。すなわち、それは、 インビボ 18 において毒性を誘導することができます。過剰のGd（III）が効果的にGdEDTAの限外ろ過及び3 kDaの分子量カットオフ（MWCO）フィルターを用いて遊離EDTA、続いてEDTAとの錯体形成によって除去することができます。デンドリマー複合体は、より低い分子量を有する場合より低いMWCOフィルターを使用してもよいです。
DCAの準備に関連する2つの主要な問題のトラブルシューティングがあります。 NMR信号上のGd（III）の大きな広がりの効果に、NMR分光法を用いたDCAの分析は有益ではありません。代わりに、この分析は、前工程（化合物5及び6）において実行されるべきです。次に、デンドリマー表面にmonomacrocyclic単位の結合は、100％の転化率で達成されることはないが、（下記参照）50％〜90％の間である可能性があります。典型的に、反応収率はmonomeriの第2の部分を追加することによって増加させることができますC反応性単位デンドリマーとモノマー単位の最初の結合は、24を完了した後。しかし、キレート剤の多少異なる平均数ですべての準備バッチの結果は、同一のデンドリマーとDOTA単位はカップリングのための材料として使用されている場合でも、デンドリマー表面にコンジュゲート。 DCAに存在するのGd（III）の最終的な量は、BMSのメソッドを介して独立して決定することができますが、デンドリマー結合体の優れた特徴付けのため、（セクション2.2を参照）、毎回の新しいバッチ結合したモノマー単位の推定を行う必要がありますDCAは、（下記2.1との議論を参照）を用意します。
単離された樹枝状生成物の分析的特徴づけは、元素分析、およびMALDI-TOF MS（製品のみ5,6に）1 H NMR分光法により行うことができます。アミノ表面基の変換のための典型的な収量は、デンドリマーに応じて、50％〜90％の間にあるgeneratiキレート化剤の種類、および使用される反応条件（溶媒、温度）6,20,24,25、オン。この特定の場合では、組み合わせた分析から得られた計算された質量は、デンドリマーに結合さ49モノマーキレートの平均値に対応する（ すなわち、〜デンドリマー表面アミンの75％の占有率）。反応したアミノ基の最終的な数のわずかなミスマッチがこれらの方法論25の間に期待することができるが、その直接の比較は、添付のキレート単位の特定の平均数を有する所望のDCAの形成のための合理的な証拠を提供します。
MRI実験のコントラストを高めるために、DCAの可能性を評価することを目的インビトロ特徴付けはDLS、relaxometric、およびMRI実験からなりました。 DCAの流体力学的直径は、この種の以前に報告された複合体と一致するDLS測定により、7.2±0.2nmであることが決定されましたG4の生成と4 PAMAMデンドリマー26。 DCAの縦緩和の決意は、前述の手順15に続き、6.2±0.1 mMの-1秒-1のGd（III）あたりの値を明らかにしました。同様のタイプ（ 例えば、GdDOTA）の小型分子にDCA比べにおける常磁性のGd（III）のR 1における増強の約50％が、デンドリマー、造影剤の中間のサイズで説明することができます。すなわち、デンドリマーの表面に付着したGdキレートの減少運動は、回転相関時間を増加させ、したがって、R 1。この効果は、さらに小さなナノサイズ剤のための高磁場で観察することができます。それ以外の場合は、回転相関時間の増加が支配的に低磁場27のR 1向上に寄与する。一方、デンドリマー造影剤の大きさは、横RELAに顕著な効果を有しました30.5±0.6 mMの-1秒-1のGd当たり（III）の値が得られxivity 28、。要約すると、DCAのin vitro評価のための方法は簡単であり、唯一の慎重なサンプル調製を必要とするので、データを取得し、結果を分析するときに困難が予想されていません。
画像のコントラストに影響を与えるためにデンドリマー造影剤及びその電力の性能を実証するために、我々は、新たに調製した造影剤DCAと管ファントムのMRI実験を行いました。我々はまた、対照としての水と比較して、チューブのように、商業的に入手可能であり、臨床的に承認されたMRI造影剤、GdDOTAの溶液を使用します。最初のT 1では、MRI実験を-重み付け同等のGd（III）濃度が（DCAまたはGdDOTA中のGdの0.5または1 mMの（III））を用いた場合、DCAとチューブ内のSNRはすでに最大12％高いためでしたGdDOTAに比べDCAの縦緩和で約50％の増加（Fへigure図5a）。第2のT 1強調MRI実験は濃度が分子ごとに計算されたDCAの効果を実証するために設計されました。 5回以下DCAがGdDOTA（それぞれGdDOTA対50対250μMまたは100対500μMDCA）と比較して適用したが、Gdを持つDCA（III）の高負荷は、画像コントラストの大幅な増加をもたらしましたこれは、次に、DCAが充填されたファントムチューブにおける少なくとも3倍である観測SNR値が得られました。予想通り、両方のT 2強調MRI実験は、DCAとGdDOTAで満たされたファントムの管の間のSNRの大きい（3-20倍）の違いを示しました。
結論として、このプロトコルは、小型のCAと比較して改善された特性を有するDCAを提供する一般的な合成手順を使用してMRI用デンドリマーCAの便利な調製を記載します。比較すると、DCAの展示は、熱力学的安定性と運動不活性を好まそのモノマーCAのアナログに。それにもかかわらず、従ってDCAの多価とは、標的領域内の常磁性種の高い局所濃度は、MR画像において高いコントラストを誘導します。その単量体CAの類似体、またはさらなる機能（ 例えば、対象となるベクトル）を運ぶ能力に比べて多くの場合、望ましい薬物動態学的特性（ 例えば、より長い組織保持時間）を考慮すると、これらのデンドリマー、大環状化合物の結合体はのための造影剤の有望な、貴重なクラスを表します今後の様々なMRIおよび分子イメージングアプリケーションに最適です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7 N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15% wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 10% wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | Version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
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