Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה ואפיון של תהודה מגנטית dendrimeric חומר ניגוד (MRI) שנושא chelates macrocyclic המבוסס cyclen תיאום יוני גדוליניום פאראמגנטיים. בסדרת ניסויי MRI במבחנה, סוכן זה מיוצר אות MRI מוגברת בהשוואה האנלוגית monomeric הזמין המסחרי.
Abstract
מתחמי פאראמגנטיים של גדוליניום (III) עם אציקליות או chelates macrocyclic הם סוכנים בניגוד הנפוץ ביותר (CA) עבור הדמיה בתהודה מגנטית (MRI). מטרתם היא לשפר את שיעור הרפיה של פרוטונים מים ברקמות, ובכך להגדיל את הניגוד התמונה MR ואת הספציפיות של מדידות MRI. סוכנים בניגוד נוכחיים קליני שאושרו הם מולקולות משקל מולקולארי נמוכות, נמחקות במהירות מהגוף. שימוש dendrimers כנושאי chelators פאראמגנטיים יכול למלא תפקיד חשוב בהתפתחות העתידית של סוכנים בניגוד MRI יעילים יותר. באופן ספציפי, העלייה בריכוז המקומי של תוצאות מיני פאראמגנטיים ב ניגוד אות גבוה. יתר על כן, CA זה מספק זמן שמירת רקמות כבר בשל המשקל והגודל מולקולריים גבוהים. הנה, אנחנו מדגימים הליך נוח לעריכת חומר ניגוד MRI macromolecular מבוסס על פולי (amidoamine) (Pamam) dendrimers עם monomacrochelators DOTA מהסוג מחזורי (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). היחידה chelating צורף על ידי ניצול תגובתיות של isothiocyanate (NCS) הקבוצה כלפי קבוצות משטח אמין של dendrimer Pamam להקים גשרים thiourea. מוצרי Dendrimeric היו מטוהרים ונותחו באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית, ספקטרומטריית מסה, ואת ניתוח יסודי. לבסוף, ברזולוציה גבוהה תמונות MR הוקלטו ניגודי האות המתקבל מן dendrimeric המוכן וסוכני monomeric הזמינים המסחרי הושוו.
Introduction
הדמיית תהודה מגנטית (MRI) היא טכניקת הדמיה עוצמה בלתי מייננת בשימוש נרחב מחקר ביו לדיאגנוסטיקה רפואית בשל אופיו פולשנית והניגודיות הרקמות הרכות הפנימית מעולה. שיטות MRI הנפוצות ביותר לנצל את האות המתקבל פרוטונים במים, מתן תמונות ברזולוציה גבוהה ומידע מפורט בתוך הרקמות על בסיס הבדלים בצפיפות של אותות מים. עוצמת האות ואת הספציפיות של ניסויי MRI ניתן לשפר עוד יותר באמצעות סוכנים בניגוד (CA). אלה הם מינים פאראמגנטיים או פאראמגנטי המשפיעים על האורך (T 1) ו רוחבי (T 2) פעמים הרפיה, בהתאמה 1,2.
קומפלקסים של גדוליניום lanthanide יון עם polyamino הליגנדים חומצה polycarboxylic הם את רשויות T 1 הנפוץ ביותר. גדוליניום (III) מקצר את ההרפיה T 1זמן של פרוטונים במים, ובכך להגדיל את ניגוד האות בניסויי MRI 3. עם זאת, גדוליניום יוני הוא רעיל; גודלו מדמה את הסידן (II), וזה ברצינות משפיע בסיוע סידן איתות תאי. לכן, chelates אציקליות ו macrocyclic מועסקים לנטרל רעילות זו. הליגנדים multidentate שונים פותחו עד כה, וכתוצאה מכך גדוליניום (III) קומפלקסים עם יציבות תרמודינמית גבוהה אדישות הקינטית 1. אלה המבוססים על cyclen azamacrocycle-membered 12, ב DOTA נגזרת tetracarboxylic שלה בפרט (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate) הם חקרו ביותר ויישומי קומפלקסים של המעמד אישורים זו.
אף על פי כן, GdDOTA מסוג CAs הם מערכות נמוכות משקל מולקולריים, מוצגות חסרונות מסוימים כגון יעילות ניגודיות נמוכה והפרשה כליות מהר. Macromolecular ו CAs רב-ערכית עשוי להיות פתרון טוב לבעיות אלה 4. מאז CA biodistribution נקבעת בעיקר על ידי גודלם, קאש macromolecular להציג פעמי שמירה עוד הרבה זמן בתוך רקמות. לא פחות חשוב, multivalency של תוצאות סוכנים אלה ריכוז מקומי גדילה של חללית MR monomeric (למשל, מורכבות GdDOTA), באופן משמעותי לשיפור אות MR שנרכשה ואת איכות המדידה.
Dendrimers הוא בין הפיגומים המועדפים ביותר לעריכת CAs רב-ערכית עבור MRI 4,5. מקרומולקולות מאוד מסועפות עם גדלים מוגדרים היטב נוטות לתגובות צימוד שונות על פני השטח שלהם. בעבודה זו, אנו מדווחים על הכנה, טיהור, ואפיון של CA dendrimeric עבור MRI המורכב פולי 4 דור (G4) (amidoamine) (Pamam) dendrimer מצמידים chelates דמוי GdDOTA (DCA). אנו מתארים את הסינתזה של נגזר DOTA מגבה הצימוד שלה אל dendrimer Pamam. עם complexation עם אלוקים (III), אפיון physicochemical תקן proceduמחדש של DCA בוצע. לבסוף, ניסויי MRI בוצעו כדי להדגים את היכולת של DCA להפיק תמונות MR עם ניגוד חזק מאלה המתקבלים CAs משקל מולקולרי נמוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת DCA
- סינתזה של היחידה monomeric 4 6.
- סינתזה של 4- (4-nitrophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (2).
- ממיסים (טרט 4,7-בשדרת -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl -acetic חומצה טרט 1 (1.00 גר ', 1.94 מילימול) ב N, -dimethylformamide N ( DMF, 5 מ"ל), להוסיף אשלגן פחמתי (0.67 גר ', 4.86 מילימול, 2.5 equiv.) ומערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
הערה: מאקרו-ציקלי 1 הוכן cyclen ו טרט -butyl bromoacetate פי הנוהל שפורסם בעבר 7. - הוספת טרט -butyl-2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoate (0.87 גר ', 2.53 מילימול, 1.3 equiv.) Portionwise מעל 1 hr. המשך ערבוב לתערובת תחת tהוא באותו תנאי תגובה עבור 18 השעות הבאות.
הערה: טרט -butyl-2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoate הוכן מ 4- (4-nitrophenyl) חומצה -butyric, כלוריד Thionyl, וברום פי הנוהל שפורסם בעבר 8. - הסר DMF באמצעות זיקוק ואקום נורה אל הנורה ב 40-60 מעלות צלזיוס 9.
- לטהר את שאריות ידי כרומטוגרפיה בעמודה (ג'ל סיליקה, 7% מתנול / dichloromethane) כדי להשיג מוצר 2 כמו 10 (1.09 גר ', 72%) מוצק אמורפי חום.
- ממיסים (טרט 4,7-בשדרת -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl -acetic חומצה טרט 1 (1.00 גר ', 1.94 מילימול) ב N, -dimethylformamide N ( DMF, 5 מ"ל), להוסיף אשלגן פחמתי (0.67 גר ', 4.86 מילימול, 2.5 equiv.) ומערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
- סינתזה של 4- (4-aminophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (3).
- ממיסים את nitrobenzene נגזרת 2 (1.00 גר ', 1.28 מילימול) באתנול (10 מ"ל) ו -7 N פתרון אמוניה מתנול (150 μl). להוסיף פלדיום על פחם פעיל כזרז (Pd / C, 150 מ"ג, 15% WT) אל solutiעַל.
- לנער את התערובת הטרוגנית במשך 16 שעות תחת אווירת מימן (2.5 בר) במנגנון Hydrogenator הפאר.
- הכינו עוגה של כדור הארץ diatomaceous ידי השעייתו באתנול וסינון ההשעיה דרך משפך זכוכית sintered. יוצקים את ההשעיה מן 1.1.2.2 על העוגה מוכנה להסיר את הזרז Pd / C על ידי סינון.
- הסר את הממס על ידי זיקוק עדין על (טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) מאייד סיבובי להשיג במתחם 3 בתור (0.91 גר ', 95%) מוצק אמורפי חום.
- סינתזה של 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (4).
- להוסיף thiophosgene (0.124 מ"ל, 1.58 מילימול, 1.3 equiv.) אל תערובת של 3 (0.91 גר ', 1.22 מילימול) ו triethylamine (0.685 מ"ל, 4.87 מילימול, equiv 4.) ב dichloromethane (15 מ"ל).
- במרץ לערבב את התגובה מילxture עם בוחש מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות.
- הסר את הממס על ידי זיקוק עדין על (טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) מאייד סיבובי, ולאחר מכן לטהר את המוצר הגולמי ידי כרומטוגרפיה בעמודה (ג'ל סיליקה, 5% מתנול / dichloromethane) כדי לקבל את המוצר 4 כמו חום בהיר אמורפיות (0.51 גר ', 53%).
- סינתזה של 4- (4-nitrophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (2).
- סינתזה של DCA dendrimer.
- סינתזה של dendrimer 5.
- קח dendrimer G4-Pamam (667 מ"ג, 10% פתרון dendrimer מתנול, 4.67 μmol), לאדות את מתנול על ידי זיקוק עדין על המאייד סיבובית (הטמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C), ו לפזר את שאריות DMF (4 מ"ל) .
- להוסיף triethylamine (0.105 מ"ל, 0.75 מילימול, 160 equiv.), ומערבבים במשך 45 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, ולהוסיף isothiocyanate 4 (354 מ"ג, 0.45 מילימול, 1.5 equiv. ביחס לקבוצות משטח אמינו של dendrimer) אובה portionwiser 1 hr.
- מערבבים את תערובת התגובה עם בוחש מגנטי ב 45 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- הסר את הממס באמצעות זיקוק ואקום נורה אל הנורה ב- C ° 40-60.
- לטהר את שאריות ידי כרומטוגרפיה בגודל הדרה באמצעות מדיום מתנול סינון ג'ל lipophilic כמו eluent. כדי לארוז את הטור, להתנפח תקשורת סינון מתנול לפחות 3 שעות בטמפרטורת חדר (> 4 מיליליטר של מתנול לכל 1 גרם של אבקה) ללא הפעלת לחץ. בצע הפרדה הכביד על ידי איסוף 1 מיליליטר שברים.
- לנתח את השברים שנאספו עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC). לפתח את צלחת TLC ב 15% מתנול / dichloromethane (במקום הקוטבי ביותר היחיד הממוקם על קו הבסיס נגזר מוצר dendrimeric). לאדות את השברים שנאספו על ידי זיקוק עדין על מאייד סיבובי (טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) כדי להשיג מוצר 5 (270 מ"ג, 91%).
- סינתזה של dendrimer
- ממיסים את chelator dendrimeric מוגן 5 (270 מ"ג, 4.23 μmol) ב חומצה פורמית (5 מ"ל) ומערבבים את התערובת על 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- לאדות את החומצה פורמית על ידי זיקוק על מאייד סיבובי (~ 15 לחץ mbar, טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) ולהקפיא-לייבש את המוצר לתת 6 (לחץ ~ 0.2 mbar) 9.
- סינתזה של dendrimer 5.
- סינתזה של חומר ניגוד dendrimeric (DCA)
- ממיסים את chelator dendrimeric 6 (4.35 μmol) במים ולהתאים את ה- pH ל 7.0 עם 0.1 הידרוקסיד M נתרן.
- ממיסים GdCl 3 · 6H 2 O (מ"ג 113, 304 μmol) במים (1 מ"ל) ולהוסיף אותו dropwise לפתרון chelator 6 על פני תקופה של 4 שעות; לשמור על pH ב 7.0 עם פתרון סודיום הידרוקסיד מימי (0.05 מ ') על ידי מדידת pH עם מד pH.
- מערבבים את התערובת עם בוחש מגנטי חדר temperature למשך 24 שעות.
- הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 158 מ"ג, 426 μmol) אל portionwise הפתרון מעל 4 שעות כדי להסיר את עודפי ה '(III) תוך שמירה על pH ב 7.0 עם פתרון סודיום הידרוקסיד מימי (0.05 מ'). מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
- בצע כרומטוגרפיה בגודל הדרה להסיר את רוב GdEDTA ואת העודף של EDTA. השתמשו במדיית סינון ג'ל הידרופילי נפוחות במים לארוז הטור. להפחית את כמות נפח מתאים ולטעון הטור. Elute את העמודה עם מים ללא יונים ללא הפעלת לחץ.
- צנטריפוגה מדגם באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 3 kDa למשך 30 דקות XG ב צנטריפוגלי כוח 1,800 להסיר את שאריות של GdEDTA ו EDTA. חזור על שלב זה (בסביבות חמש פעמים) עד תסנין מעידה על העדר EDTA ו GdEDTA. מעבירים את המדגם לתוך הבקבוק, להתאדות זה, ולאחר מכן להקפיא-לייבש את הממס להשיג מוצר מחוץ לבן כמו DCA הסופי (186 מ"ג, 71%).
הערה: בדוק בהעדר EDTA ו GdEDTA באמצעות ESI-MS. - אשר בהעדר ה (III) כמו יון חינם באמצעות מבחן כתום xylenol. ממיסים את תסנין (0.5 מ"ל) ב פתרון חיץ אצטט (pH 5.8). הוסף כמה טיפות של פתרון כתום xylenol ולעקוב אחר השינוי בצבע (צהוב או סגול צבע מציין את העדר או נוכחות של הקב"ה חינם (III) יונים בתמיסה, בהתאמה) 11.
2. אפיון Vitro של מוצרי Dendrimeric
- הערכת מספר DOTA וואב macrocyclic מצמידים את dendrimer Pamam (הטעינה של dendrimer עם macrocycles DOTA דמוי)
- הערכה עם 1 H NMR (תמ"ג - ספקטרוסקופיה בתהודה המגנטית הגרעינית).
הערה: הליך זה אפשרי על dendrimers 5 ו -6, אבל לא על DCA.- רשום את הספקטרום 1 H NMR 12.
- שלב באזור ארומטי שני האזורים אליפטיות נפרד (1. אותות של dendrimer אליפטיות ופרוטונים macrocyclic; 2. אותות של קבוצות -Bu T) או סתם אזור אליפטיות עבור dendrimers 5 ו -6, בהתאמה.
הערה: אין אות נפרדת באזור אליפטיות שמקורה קבוצות -Bu t ב dendrimer 6 מאז הם כבר הידרוליזה. - השתמש Eq. 1 או משוואה. 2 להעריך את מספר יחידות macrocyclic (n), כאשר R = היחס בין אינטגרלים (אליפטיות / ארומטי ב EQ. 1 או אליפטיות-dendrimer / aliphatic- T- Bu ב EQ. 2), dend H = מספר הפרוטונים ב dendrimer, H Ar = מספר פרוטונים ארומטיים, H t Bu = מספר הפרוטונים בקבוצות -Bu t, ו- H מק = מספר הפרוטונים מאקרו-ציקלי אחד.
הערה: או משוואה. 1 או משוואה. 2 ניתן להשתמש FOr dendrimer 5, בעוד שרק Eq. 1 יכול לשמש dendrimer 6. מאז פרוטונים חליפיים (על אמינים, ואימידים, thioureas, או carboxylates) בדרך כלל מוחלפים דאוטריום, הם לא היו מניחים בחישובים. הנה, H dend = 1,128 (עבור 5) או 1,000 (עבור 6), H Ar = 4, ו- H מק = 27 היו בשימוש.
(1) 
(2)
- הערכה מ ניתוח יסודי באמצעות היחס בין החנקן והגופרית.
- בצע את ניתוח היסודות על מדגם dendrimeric המוצק (DCA בעבודה זו).
- השתמש Eq. 3 לאמוד את מספר יחידות macrocyclic (n), כאשר R = היחס בין N% נחוש% S, N dend או S dend = מספרחנקן או אטומי גופרית ב dendrimer, ו- N מק או מק = מספר אטומי חנקן או גופרית ביחידה macrocyclic אחד.
הערה: הגורם 2.29 מתקבל יחס בהמוניהם אטומי גופרית וחנקן. בעבודה זו, N dend = 250, S dend = 2, N מק = 5, ו- S מק = 1 שימשו.
(3)
- הערכת עם / desorption לייזר בסיוע מטריקס יינון הזמן של הטיסה (MALDI-TOF).
- בצע ניתוח MALDI-TOF MS 13.
- לחשב את מספר יחידות macrocyclic (n) על פי משוואה. 4, כאשר M z = המסה נצפתה (m / z), z = האישום של מינים, M dend = המסה של חלק dendrimeric, ו- M מק = המסה של יחידת macrocyclic אחד.
לאTE: M dend = 14,306 ו- M מק = 719 שימשו בעבודה זו.
(4)
- הערכה עם 1 H NMR (תמ"ג - ספקטרוסקופיה בתהודה המגנטית הגרעינית).
- קביעת ריכוז DCA ([DCA]): מדידת רגישות מגנטית גורפת (BMS)
- ממיסים DCA (5-10 מ"ג) במים (360 μl) בצינור בקבוקון פלסטיק ([DCA] ~ 5-10 מ"מ).
הערה: [DCA] צריכה להיות בטווח של 5-10 מ"מ, כדי למנוע חפיפה אפשרית של תהודות BuOH T- בריכוזים מדגמים> 15 מ"מ, עם התהודה של מי δ = 4.7 ppm. - הוסף 60 μl של D 2 O: T- תערובת BuOH (2: 1 v / v) אל בתמיסה מימית של DCA ומערבבים את הפתרון שהתקבל (420 μl) בעזרת מערבל מערבולת.
- העברת 400 μl של המדגם לתוך צינור NMR חיצוני ומניח צינור כנס NMR קואקסיאליים עם BuOH טי: H 2 O תערובת (10:90 v / v) לתוך הצינור המדגם.
- תקליטהספקטרום 1 H NMR ומדידת היסט תדירות בין אותות תהודה הנובעים T- BuOH בתוך צינורות NMR הפנימיים והחיצוניים (הפניה) 12.
- השתמש Eq. 5 כדי לקבוע את [DCA], שבו T = הטמפרטורה המוחלטת, Δχ = משמרת רשמה, מיקרון EFF = המומנט המגנטי יעיל יון lanthanide (μ EFF = 7.94 לאלוקים (III) 14, ו- s = מחסורו מתמיד על הצורה של המדגם ולמקומה השדה המגנטי (0, 1/3, 1/6 ו במקרה של כדור, גליל במקביל, גליל בניצב לשדה המגנטי, בהתאמה).
הערה: הערך המחושב שהתקבל עבור [DCA] צריך להיות מתוקן על הריכוז המקורי נובע מהוספה של D 2 O: T- פתרון BuOH (60 μl).
(5)
- ממיסים DCA (5-10 מ"ג) במים (360 μl) בצינור בקבוקון פלסטיק ([DCA] ~ 5-10 מ"מ).
- אור דינאמימדידות פיזור (DLS).
- כן פתרון DCA מסונן (0.2 מיקרומטר polytetrafluorethylene / מסנן PTFE, 0.75 מ"מ לכל ה (III)) ב 4- (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) חיץ (25 מ"מ, ה- pH 7.4) ולהעביר אותו לתוך קובט לשקילת DLS.
- מניח את קובט לתוך מנגנון DLS וכן להגדיר את הפרמטרים הבאים: 5 חזרות של 15 סריקות (1 סריקה = 12 שניות, מקדם שבירה = 1.345, קליטה = 1%) ללא עיכובים בין הסריקות ועם איזון טמפרטורה 30 שניות לפני ההקלטה .
- לייצא את הנתונים רכשו ולקבל את היסטוגרמה התפלגות גודל על ידי התוויית אוכלוסייה (%) כפונקציה של גודל (קוטר הידרודינמית).
- מדידה של relaxivities האורך הרוחבי.
הערה: הליך דומה כבר תואר באמצעות מנתח זמן הרפית 15; הליך זה בוצע באמצעות ספקטרומטר תמ"ג 300 MHz עם Topspinתוֹכנָה.- להכין סט של פתרונות DCA ב H 2 O: D 2 O (500 μl, 10% D 2 O ב H 2 O, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, ו -5.0 מ"מ, [HEPES ] = 25 מ"מ) מן מדגם מניות DCA (ראה סעיף 2.2).
- העבר 450 μl של פתרון לתוך צינור NMR ולמקם אותו לתוך המכשיר.
- מטב את פרמטרי הרכישה (90 ° משך דופק עירור (P1), ותדירות הקרנה לקזז (O 1)) ולאחר מכן לבצע את T 1 ו- T 2 ניסויים באמצעות התאוששות ההיפוך (IR) לבין רכב-פרסל-Meiboom-גיל (CPMG ) רצפים דופקים, בהתאמה.
- קביעת פעמים הרפיה T 1 ו- T 2.
- בחר את המדידה, תהליך הקליטה את ספקטרום 2D במימד F2, ולבצע את התיקון השלב אינטראקטיבי.
- בחר את הפרוסה המתאימה (שיא בעצמה מקסימלית) ב- Analysis / T
- בחר את פונקציית הולם המתאים (invrec או uxnmrt2 לניסויים IR ו CPMG, בהתאמה) כדי לקבל את פעמים הרפיה T 1 או T 2.
- חזור על שלבים 2.4.4.2-2.4.4.4 עבור כל הפעולות הנותרות [DCA].
- חשב את שיעורי הרפיה (R 1 ו- R 2) מן הערכים T 1 השיג (R 1,2 = 1 / T 1,2).
- מגרש R 1 ו- R 2 (sec -1) כפונקציה של הקב"ה (III) ריכוז מ"מ.
- קבע את relaxivities האורך רוחבי, r 1 ו R 2 (sec -1 מ"מ -1), מן השיפוע של הקו מצויד, כפי שהוגדר על ידי Eq. 6, כאשר R i, obs = האורך (i = 1) או רוחבי (i = 2) שיעור הרפיה diamagnetic שלמים בהיעדר מינים פאראמגנטיים ו [הקב"ה] = ריכוז ה (III) השתמשו בניסוי.
(6)
(1) 
(2) 
(3) 
(4) 
(5) 
(6) 3. במבחנה MRI; השוואה בין DCA ו GdDOTA
- הכנת רוחות רפאים צינור
- הכינו פתרונות מימית של DCA (4 x 350 μl) ו GdDOTA (4 x 350 μl) כמו גם דגימות מים (4 x 350 μl) עבור שני סטים של ניסויים בהם ריכוז של חומר ניגוד מחושב: (3.1.1.1) לכל ה (III) או (3.1.1.2) לכל מולקולה.
- הכינו שתי דגימות DCA ושני GdDOTA דוגמאות עם ריכוזים של 0.5 ו -1.0 מ"מ לכל ה (III), בהתאמה. בנוסף, להכין שתי דגימות מים (כמו צינורות שליטה).
- הכן שתי דגימות DCA (2.5 ו -5.0 מ"מימ לכל ה (III) או 0.05 ו -0.1 מ"מ לכל מולקולת dendrimeric), שתי דגימות GdDOTA (0.25, 0.5 מ"מ) ושתי דגימות מים (מערכות בכלצינורות l).
הערה: ריכוזי DCA ו GdDOTA המתאימים צריכים להיות מוכנים על ידי דילול דגימות מניות בהתאמה עם ריכוזים נקבעו באמצעות שיטת BMS (ראה סעיף 2.2) עם חיץ HEPES (pH 7.4). על מנת לפשט את החישובים, n = 50 הונח על המספר הממוצע של יחידות macrocyclic לכל מולקולה dendrimer. לכן, היחס של DCA: GdDOTA היה 1: 5, מחושב על בסיס לכל מולקולה.
- מניח את הדגימות 300 צינורות μl בקבוקון פלסטיק, הימנעות הנוכחות של בועות אוויר בתמיסה.
הערה: הגודל של צינורות בקבוקון פלסטיק תלוי בסוג וגודל של הסליל גלי רדיו בשימוש (כאן, דוגמה עם סליל נפח ניתנת). - הכנס את דגימות בתוך מזרק (60 מ"ל נפח), למלא אותו עם 1 מ"מ GdDOTA פתרון, ולמקם אותו בתוך הסורק.
הערה: דוגמאות הושמו בתמיסה המימית של GdDOTA כדי למנוע תופעות רגישות (וריאציות של השדה המגנטיtrength המתרחשת ממשקים ליד בין חומרים של רגישות מגנטית שונה).
- הכינו פתרונות מימית של DCA (4 x 350 μl) ו GdDOTA (4 x 350 μl) כמו גם דגימות מים (4 x 350 μl) עבור שני סטים של ניסויים בהם ריכוז של חומר ניגוד מחושב: (3.1.1.1) לכל ה (III) או (3.1.1.2) לכל מולקולה.
- אופטימיזציה והדמיה פרמטר.
- השתמש סריקה אנטומית (Localizer / Tripilot) כדי למקם את המזרק עם דגימות isocenter של המגנט.
- לחץ על הרמזור (סריקת התאמה) כדי לבצע התאמות עבור shimming (התאמת ההומוגניות שדה מגנטיות) של כל הנפח, התדירות המרכזית (O 1), מרוויח המקלט (RG), ורווח השידור (TX0 ו TX1).
- עבור T 1 משוקלל (T 1W) הדמיה, בחר נמוכה זווית ירו מהירה (FLASH) שיטה.
- בחר פרוסת העטרה עבור הדגימות להציב במאונך (מזרק אופקי) בתוך הסורק באמצעות סריקת Localizer.
- השתמש Eq. 7 לאופטימיזציה של ניגוד לרעש הרכישה (CNR) פרמטרים 16, שבו α = הזווית להעיף, TE = זמן ההד, TR =הזמן חזרה, ו- T 1, A, T 1, B = ה- T 1 פעמים של מדגם (T 1, א) ו מדגם B (T 1, B) שעבורם CNR צריך להיות מוגדל (באותו תקף T 2 פעמים: T 2, A ו- T 2, B).
הערה: T 1 והרפית T 2 פעמים צריכות להיות מוגדרות ערכים שהתקבלו המדידות של relaxivities האורך הרוחבי (סעיף 2.4), ואילו TE, TR, ו α יש לקבל את חישוב אופטימיזציה CNR.
(7) - רוכש את התמונה באמצעות הפרמטרים שהושגו בשלב הקודם (3.2.5).
- חשב את יחס אות לרעש (SNR).
- טענתי את תמונת T 1W רכש (סריקה) לתוך תצוגת תמונות & עיבודחלון, ולחץ על גדר באזור (ROI) ריבית.
- בחר ROI עגול ולצייר אותו במיקום מדגם והרקע. בהמשך לכך, לחץ על צג כדי להשיג את משרעת האות הממוצעת (אות S) ואת סטיית התקן של (רעש S) ברקע.
- חזור על שלב 3.2.7.2 עבור DCA, GdDOTA, דגימות מים.
- חשב את SNR באמצעות הנוסחה: SNR = האות S / S רעש.
- בעקבות הליך שונה במקצת, לבצע T 2 משוקלל (T 2W) הדמיה באמצעות הרכישה המהירה עם שיפור הרפיה (RARE) שיטה. עבור אופטימיזציה של הפרמטרים רכישת CNR, להשתמש Eq. 8.
(8)
(7) 
(8) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת DCA מורכב משני שלבים: 1) סינתזה של chelator DOTA מסוג monomeric (איור 1) ו -2) צימוד של chelator עם dendrimer G4 Pamam והכנת הבאות של הקב"ה dendrimeric (III) מורכבים (איור 2) . בשלב הראשון, chelator cyclen המבוסס DOTA מהסוג המכיל ארבע חומצות קרבוקסיליות וקבוצה מאונכת מתאימה שינויים סינטטיים נוספים הוכן. הכנת תחילתה 1 (DO3A- אסתר -butyl טרט) 7, אשר היה alkylated עם טרט -butyl 2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoate 8 לספק DOTA נגזרים 2. הידרוגנציה פלדיום-catalyzed מופחת הקבוצה ניטרו ארומטיים 2 להניב את אנילין 3. הסבת 3 עם thiophosgene הביאה isothiocyanate 4, whicח שימש בעבר כסוכן אמין-reactive לעריכת dendrimeric CAs 17.
בשלב הבא, מאקרו-ציקלי 4 שמש כיחידת monomeric הבסיסית תגובת צימוד אל dendrimer הזמין המסחרי G4 Pamam. קבוצות המשטח האמין של dendrimer להגיב עם קבוצות isothiocyanate של מונומר 4 בנוכחות בסיס. עודף 4 הוסר על ידי כרומטוגרפיה בגודל הדרה באמצעות מצע סינון ג'ל lipophilic עם מתנול כמו eluent. אסטרים טרט -butyl על המצומד dendrimer-macrocyclic השיג 5 היו הידרוליזה עם חומצה פורמית להניב 6, אשר לאחר מכן היה lyophilized והשתמשו בשלב הבא ללא טיהור. היווצרות של הקב"ה (III) קומפלקסים של macrocycles DOTA מסוג בוצעה על ידי הוספת GdCl 3 · 6H 2 O ל O בתמיסה מימיתf 6 תוך שמירה על pH בסביבות 7. עודף ה (III) היה ומורכב עם חומצת ethylenediaminetetraacetic chelator המשותף (EDTA). EDTA מורכבת עודף GdEDTA הוסרו מהמערכת באמצעות כרומטוגרפיה בגודל הדרה באמצעות מצע סינון ג'ל הידרופילי עם מים כמו eluent. זיהומים קטנים בגודל הנותרים הוצאו הפתרון על ידי צנטריפוגה באמצעות 3 יחידות סינון צנטריפוגלי kDa.
בעקבות הסינתזה של conjugates dendrimer-מאקרו-ציקלי, גישה אנליטית בשילוב הועסק לאפיין את המוצרים. כדי לקבוע את התפוסה האמינה-פני שטח של 5 ו -6, 1 ספקטרום NMR H כבר נותח. התוצאות הושוו ואישר עם המוצר הסופי (DCA), שבו הטעינה של dendrimer עם macrocycles הוערך באמצעות ניתוח יסודי ו ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF (איור3). שילוב של שלוש שיטות אלה הביא בממוצע 49 יחידות macrocyclic להיות מצומדת אל dendrimer G4, אשר תואם ~ 75% תפוסת קבוצת משטח אמין.
אפיון נוסף של המתחם dendrimeric נכלל בקביעת שוויים relaxivity, וכתוצאה מכך 6.2 ± 0.1 מ"מ -1 שניות -1 לכל ה (III) (או בערך כ -300 מ"מ -1 שניות -1 לכל dendrimer) עבור relaxivity האורך 30.5 ± 0.6 מ"מ -1 שניות -1 לכל ה (III) (כמעט 1,500 מ"מ -1 שניות -1 לכל dendrimer) עבור relaxivity הרוחבי. מדידות DLS הצביעו בקוטר הידרודינמית של 7.2 ± 0.2 ננומטר עבור DCA (איור 4).
לבסוף, כדי להדגים את ההשפעה של חומר ניגוד MRI dendrimeric, MR הדמיה בוצעה על שתי קבוצות של רוחות רפאים עם DCA והמרפאהברית זמין GdDOTA להשוואה (איור 5). הסט הראשון של רוחות רפאים הוכנו לצורך השוואת סוכנים בניגוד שני אלה הקב"ה זהים (III) ריכוזים, ואילו הסט השני נועד להדגים את השפעת בריכוזים מולקולה דומה של חומר ניגוד dendrimeric ו monomeric, בהתאמה.
איור 1: סינתזה של chelator DOTA מסוג macrocyclic 4. ריאגנטים, תנאים, והתשואות מבודדים: (i) טרט -butyl 2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoate, K 2 CO 3, DMF, 45 ° C hr, 16, 72%; (ii) H 2, Pd / C, EtOH, RT, 16 שעות, 95%; (iii) 2 CsCl, Et 3 N, RT, 2 שעות, 53%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של fi זה איור.
איור 2: סינתזה של חומר ניגוד MRI dendrimeric DCA ריאגנטים ותנאים: (i) 4, Et 3 N, DMF, 45 ° C, 48 שעות, 91%;. (Ii) חומצה פורמית, 60 ° C, 24 שעות, קוואנט; (iii) GdCl 3 ∙ 6H 2 O, pH 7.0, RT, 24 שעות, 71%. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. אפיון המוצר dendrimeric באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF ספקטרום המוני טיפוסי MALDI-TOF המתקבל עבור DCA.r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:.. אפיון מוצר dendrimeric באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) מדידת DLS של DCA (HEPES, pH 7.4) לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: בניסויים במבחנה MRI על רוחות רפאים הצינור ב 7 השדה המגנטי T (a, b) T 1-משוקלל ו- (ג, ד) T 2 משוקלל MRI של DCA ו GdDOTA.. כל ניסוי MRI בוצע שני ריכוזים שונים של חומר הניגוד: (א, ג) עם השוואת אלוקים (III) ריכוזים (HEPES, pH 7.4); (ב, ד) עם DCA: יחס ריכוז GdDOTA של 1: 5 (HEPES, pH 7.4). הריכוזים באים לידי ביטוי לכל מולקולה וערכי SNR מוצגים בסוגריים. הפרמטרים אשר שימשו הניסויים הללו היו: שדה של נוף (FOV) = 40 x 40 מ"מ 2, עובי פרוסה = 0.5 מ"מ, מספר את הריגושים (NEX) = 30; (א) גודל מטריצה (MTX) = 256 x 256, זמן החזרה (TR) = 100 msec, זמן הד (TE) = 2.95 מילי-שניות, זווית flip (FA) = 90 °, זמן הרכישה (ת"א) = 12 דקות 48 שניות ; (ב) MTX = 256 x 256, TR / TE = 20 / 2.95 מילי-שניות, FA = 90 °, ת"א = 2 דקות 34 שניות; (ג) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10,000 / 130 msec, גורם נדיר (RF) = 16, ת"א = 26 דקות 40 שניות; (ד) MTX = 512 x 512, TR / TE = 10,000 / 100 msec, RF = 16, ת"א = 26 דקות 40 שניות.776fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכנת חומר ניגוד MRI dendrimeric דורשת בחירה מתאימה של יחידת monomeric (כלומר, chelator לאלוקים (III)). הם מפחיתים את הרעילות של יון פאראמגנטיים זה, עד כה, מגוון רחב של אציקליות ו chelators macrocyclic לשרת מטרה זו 1-3. בין אלה, chelators DOTA מסוג macrocyclic להחזיק את היציבות התרמודינמית הגבוהה ביותר אדישות הקינטית, ומכאן, הם הבחירה המועדפת ביותר לעריכת חומר ניגוד MRI אינרטי 1,18. יתר על כן, הם נוטים טרנספורמציות סינטטיות שונות, אשר לגרום chelators bifunctional, מסוגלים קשר מולקולות פונקציונליות שונות (למשל, וקטורי מיקוד או נישא ננו) ועדיין להרכיב אלוקים יציב (III) קומפלקסים 19. לשם כך, יחידת monomeric מסוג DOTA המתוארים בהליך זה הוכן אסתר טרט -butyl DO3A-, המבשר נפוץ וזמין, ושל הנגזר ברומיד שלהחומצה butanoic 4- (4-nitrophenyl). מולקולה זו נגזרה DOTA ו בעל מבנה דומה לתאם אלוקים (III). השינוי הסינטטי שמטרתה להפוך chelator זה נוטה צימוד תגובות מולקולות נושאות פונקציונליות שונות. כלומר, הכנת תוצאות המולקולה השונה DOTA בתוך chelator עדיין עם ארבע קבוצות קרבוקסיליות זמינות לתיאום לאלוקים (III) כדי ליצור תסביך אינרטי וקבוצת nitrophenyl מאונכת, אשר בעת ההמרה מייחסת chelator זו אל פני שטח dendrimer. הליך זה גם מאפשר גמישות בבחירת הקבוצה תגובתי אורתוגונלי (למשל, NH 2 או COOH), אשר יכול לשמש כדי זוג אלוקי (III) chelator על מפעיל רצוי בצורה מועדפת.
Chelator bifunctional מתקבל ניתן מצמיד את המולקולות אחרות בשתי דרכים שונות (כלומר, נהלים סינטטיים). כשהקבוצה נטר מצטמצמת לקבוצת אמינו, אנילין וכתוצאה מכך יכול תחתללכת תגובת דחיסה עם הקבוצה חומצה קרבוקסילית של המולקולה 8 אחרים. יתר על כן, לקבוצה פונקציונלית אמינה העיקרי ארומטיים בנוכחות thiophosgene ניתן להמיר בקלות לתוך isothiocyanate, קבוצה אשר מגיבה בקלות עם אמינים בממסים קוטביים אורגניים כמו גם מים, והוא מציע אפשרויות תגובה יותר עבור הצימוד של יחידות monomeric כדי dendrimers 17 , 20,21.
עבור צימוד chelator bifunctional למוביל dendrimeric, פיגום dendrimeric מתאים צריך להיות מסומן. מספר גורמים הקשורים למבנה המצומד dendrimer הסופי ואת היישום הרצוי יטופלו בשלב זה. בשל זמינות מסחרית רחבה של ספקי dendrimeric, מוצרים עם מבני ליבה שונים, קבוצות תגובתי-פני שטח, או דורות יכולים להיבחר. כתוצאה מכך, תגובת הנטייה תהיה תלויה בקבוצת השטח של dendrimer והקבוצה המאונכת של chelator, בעודהמצומד הסופי עשוי להיות נייטרלי, טעונה, או יש בגדלים שונים (עד 15-20 ננומטר, בהתאם הדור dendrimer) 22. כל ההיבטים הללו צריכים להילקח בחשבון לפני הכנת CA dendrimeric, שכן הם עלולים להשפיע על מסיסות, relaxivity (שיפור אות MRI), דיפוזיה, ומאפיינים pharmacokinetic אחרים של חומר ניגוד, אשר יכול לסכן את יישומו MRI. למשל, dendrimers קטיוני עשוי להפגין רעילות במערכות ביולוגיות. עם זאת, אפקט זה יכול להיות מופחת על ידי נטיה של קבוצות בעלי מטען שלילי על פני השטח dendrimer, ובכך להפחית מטען חיובי הכולל שלהם 23.
בפרוטוקול זה, הכנו את חומר ניגוד dendrimeric DCA באמצעות ההליך בו קבוצת isothiocyanate של מאקרו-ציקלי monomeric 4 הייתה מצמיד את קבוצות משטח אמינות מסחרי cystamine ליבות G4-Pamam מצויד 64 עיקריות. הטיהור הראשונית של hydrophobic dendrimeric המוצר 5 בוצע על ידי כרומטוגרפיה ג'ל באמצעות טור עם מדיום מתנול סינון ג'ל lipophilic כמו eluent כדי להסיר את רוב יחידות monomeric unreacted. הידרוליזה של אסטרים t -butyl עם חומצה פורמית היא פשוטה, וכתוצאה מכך מוצר dendrimeric מסיסים במים שניתן מטוהרים עם כרומטוגרפיה בגודל הדרה באמצעות מצע סינון ג'ל הידרופילי. Complexation של chelators Multimeric ו dendrimeric עם אלוקים (III) בוצע תוך שמירה על הפתרון ב- pH ניטראלי על מנת להקל על ההיווצרות המורכבת. אחרת, complexation של הקב"ה (III) (מוסף כמו מלח כלוריד) מפחית את רמת החומציות, להאט את התגובה. לבסוף, ראוי לציין כי קבוצות אמינות בליבת dendrimer גם נוטות לתאם עם האלוקים (III), אבל רק עם העודף שלא ניתן היה chelated עם יחידות DOTA. הימנעות בנוכחות הקב"ה (III) מחוץ chelator DOTA חיוני משום leakage של הקב"ה (III) מן CA עשויות להיות השפעות בלתי רצויות; כלומר, זה יכול לגרום לרעילות in vivo 18. אלוקי העודף (III) ניתן להסיר ביעילות על ידי complexation עם EDTA ואחריו אולטרה סינון של GdEDTA ו EDTA בחינם באמצעות 3 משקל מולקולרי kDa חתוך מסננים (MWCO). מסנני MWCO תחתונים עשויים לשמש כאשר conjugates dendrimeric מקבלות משקל מולקולרי נמוך.
ישנן שתי בעיות פתרון בעיות עיקריות הקשורות בהכנת DCA. בשל ההשפעה הרחבה גדולה של הקב"ה (III) על אותות תמ"ג, הניתוח של DCA באמצעות ספקטרוסקופיית NMR הוא לא אינפורמטיבי. במקום זאת, ניתוח זה צריך להתבצע בשלבים מוקדמים יותר (תרכובות 5 ו -6). לאחר מכן, הנטייה של יחידות monomacrocyclic אל פני שטח dendrimer לא מושגת באמצעות 100% מרה, אך היא עשויה להיות בין 50-90% (ראה להלן). בדרך כלל, תשואות התגובה יכולות להיות מוגברות על ידי הוספת מנה נוספת של monomeriג יחידת תגובתי לאחר הנטייה הראשונה של dendrimer ויחידת monomeric הושלמה 24. עם זאת, כל תוצאות יצוו הכנה במספרים ממוצעים שונים במקצת של chelators מצומדות על פני שטח dendrimer, גם כאשר יחידות dendrimer ו DOTA זהות משמשות כחומריות עבור צימוד. למרות הסכום הסופי של הקב"ה (III) נוכחי DCA ניתן לקבוע באופן עצמאי באמצעות שיטת BMS (ראה סעיף 2.2), לאפיון טוב יותר של conjugates dendrimeric, יש צורך לבצע הערכת יחידות monomeric כבולות בכל פעם קבוצה חדשה של DCA מוכן (ראה 2.1 דיון בהמשך).
האפיון אנליטי של מוצרי dendrimeric המבודדים יכול להתבצע באמצעות 1 ספקטרוסקופיה H NMR (רק על מוצרים 5 ו -6), לניתוח חומרים, MALDI-TOF MS. תשואות אופייניות עבור ההמרה של קבוצות שטח אמינו לשקר בין 50-90%, תלוי generati dendrimerעל, סוג chelator, ואת תנאי התגובה בשימוש (ממס וטמפרטורה) 6,20,24,25. במקרה הספציפי הזה, ההמונים המחושבים המתקבלים ניתוחים המשולבים מתאימים לרמה ממוצעת של 49 chelates monomeric להיות מצמידים את dendrimer (כלומר, ~ 75% תפוסים של אמיני משטח dendrimer). למרות אי-התאמה קלה במספר הסופי של קבוצות אמינו הגיבו שצפוי בין מתודולוגיות אלה 25, ההשוואה הישירה שלהם מספקת ראיות סבירות להיווצרות של DCA הרצוי עם מספר ממוצע מסוים של יחידות chelating מצורפות.
האפיון במבחנה במטרה להעריך את הפוטנציאל של DCA כדי לשפר את הניגודיות בניסויי MRI כלל DLS, relaxometric, וניסויי MRI. הקוטר הידרודינמית של DCA היה נחוש בדעתו להיות 7.2 ± 0.2 ננומטר ידי מדידות DLS, אשר עולה בקנה אחד עם conjugates שדווח בעבר מסוג זהעם G4 דור 4 Pamam dendrimers 26. קביעת relaxivity האורך של DCA על פי הנוהל שתואר לעיל 15 וחשף את הערך של 6.2 ± 0.1 מ"מ -1 שניות -1 לכל ה (III). כ -50% של שיפור ב- r 1 של פאראמגנטיים אלוקים (III) יחסית DCA למולקולות בגודל קטן מסוג דומה (למשל, GdDOTA) יכול להיות מוסבר עם גודל ביניים של חומר ניגוד dendrimeric. כלומר, התנועה המופחתת של הקב"ה-chelates מחוברת אל פני שטח dendrimer מאריכה את זמן מתאם הסיבוב, ומכאן, r 1; אפקט זה יכול עדיין להיות שנצפה שדות מגנטיים גבוהים עבור סוכנים בגודל ננו קטנים. אחרת, הגידול בזמן מתאם סיבוב תורם דומיננטי לשיפור r 1 ב שדות מגנטיים נמוכים 27. מצד השני, את גודל חומר ניגוד dendrimeric הייתה השפעה בולטת על רלה הרוחביxivity 28, וכתוצאה מכך שווי של 30.5 ± 0.6 מ"מ -1 שניות -1 לכל ה (III). לסיכום, שיטות הערכה במבחנה של DCA הם פשוט דורשים הכנה מדגם זהיר בלבד, ולכן אין קשיים צפויים בעת רכישת נתונים וניתוח התוצאות.
כדי להדגים את הביצועים של חומר ניגוד dendrimeric וכוחה להשפיע על ניגודיות התמונה, ביצענו ניסויים MRI על רוחות רפאים צינור עם חומר ניגוד מוכן החדש DCA. כמו כן השתמשו פתרון של זמינים מסחריים ואושר קליני חומר ניגוד MRI, GdDOTA, בתור השוואה וצינורות מים כביקורת. בראשון T 1 משוקלל הניסוי MRI, כאשר הקב"ה שווים (III) ריכוזים שימשו (0.5 או 1 מ"מ של הקב"ה (III) ב DCA או GdDOTA), ה- SNR של צינורות עם DCA היה כבר עד 12% גבוה יותר עקב לעלייה של כ -50% ב relaxivity האורך של DCA לעומת GdDOTA (Figure 5a). ניסוי MRI המשוקלל השני T 1 נועד להדגים את ההשפעה של DCA כאשר הריכוזים חושבו לכל מולקולה. למרות 5 פעמים פחות DCA יושמה לעומת GdDOTA (50 לעומת 250 מיקרומטר או 100 לעומת 500 מיקרומטר DCA לעומת GdDOTA, בהתאמה), עם טעינה גבוהה של DCA עם אלוקים (III) הביא תוספת משמעותית את הניגוד תמונה, אשר בתורו הביא ערכי SNR הנצפים להיות לפחות שלוש פעמים גבוהות יותר צינורות הפנטום מלאים DCA. כצפוי, הוא T 2 משוקלל ניסויי MRI הציגו גדולים (3-20 פעמים) הבדלי SNR בין צינורות פנטום מלאים DCA ו GdDOTA.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר הכנה נוחה של CA dendrimeric עבור MRI באמצעות נהלים סינטטיים נפוצים לספק DCA עם תכונות משופרות בהשוואה ל- CAS בגודל קטן. תערוכות DCA העדיפו יציבות תרמודינמית אדישות הקינטית כשמשוויםכדי אנלוגים CA monomeric שלה. עם זאת, multivalency של DCA, ומכאן, את הריכוז המקומי הגבוה של המינים פאראמגנטיים באזור היעד גורם ניגודיות גבוהה של תמונות MR. בהתחשב תכונות pharmacokinetic העדיפות לעתים קרובות (למשל, זמן שמירה רקמה יותר) לעומת אנלוגים CA monomeric שלהם, או את היכולת לבצע פונקציות נוספות (למשל, וקטורים ממוקדים), conjugates dendrimeric-מאקרו-ציקלי אלה מייצג סוג מבטיח ובעל ערך של סוכנים בניגוד עבור MRI העתידי שונה ויישומי הדמיה מולקולריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7 N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15% wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS - 297 | 10% wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | Version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, É The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , Wiley. (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. Vogel's textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , Longman. (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , Wiley-VCH. (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , Wiley. (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , Wiley-VCH. (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let's meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
