Préparation et<em> In vitro</em> Caractérisation des agents de contraste à base de dendrimères pour imagerie par résonance magnétique
Summary
Ce protocole décrit la préparation et la caractérisation d'une imagerie par résonance magnétique (IRM), l'agent de contraste dendrimère qui porte des chelates macrocycliques à base Cyclen coordinants des ions paramagnétiques de gadolinium. Dans une série d'expériences d' IRM in vitro, cet agent a produit un signal d' IRM amplifié par rapport à l'analogue monomère disponible dans le commerce.
Abstract
complexes paramagnétiques de gadolinium (III) avec acyclique ou chélates macrocycliques sont des agents de contraste les plus couramment utilisés (CA) pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Leur but est d'améliorer la vitesse de protons de l'eau dans les tissus de relaxation, augmentant ainsi le contraste de l'image MR et la spécificité des mesures d'IRM. Les agents de contraste actuels cliniquement approuvés sont des molécules de faible poids moléculaire qui sont rapidement éliminées de l'organisme. L'utilisation de dendrimères en tant que porteurs de chélateurs paramagnétiques peut jouer un rôle important dans le développement futur des plus efficaces agents de contraste IRM. Plus précisément, l'augmentation de la concentration locale des résultats des espèces paramagnétiques dans un contraste de signal plus élevé. En outre, cette AC fournit un plus long temps de rétention du tissu en raison de sa masse moléculaire élevée et leur taille. Ici, nous démontrons une procédure commode pour la préparation d'agents d'IRM macromoléculaires de contraste à base de poly (amidoamine) (PAMAM), les dendrimères monomacrocycliques chélateurs de type DOTA (DOTA – 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétra-acétate). L'unité de chélation a été ajoutée en exploitant la réactivité du groupe isothiocyanate (NCS) vers les groupes de dendrimère PAMAM de surface de type amine pour former des ponts de thiourée. dendrimères produits ont été purifiés et analysés par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, spectrométrie de masse et analyse élémentaire. Enfin, la haute résolution des images RM ont été enregistrées et les contrastes des signaux obtenus à partir du dendrimère préparé et les agents monomères disponibles dans le commerce ont été comparés.
Introduction
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique d'imagerie puissante et non-ionisant largement utilisé dans la recherche biomédicale et le diagnostic clinique en raison de sa nature non invasive et un excellent contraste des tissus mous intrinsèque. Les méthodes d'IRM les plus couramment utilisés utilisent le signal obtenu à partir de protons de l'eau, fournissant des images à haute résolution et des informations détaillées dans les tissus en fonction des différences dans la densité des signaux d'eau. L'intensité du signal et la spécificité des expériences d'IRM peut être encore améliorée en utilisant des agents de contraste (CA). Ce sont des espèces paramagnétiques ou superparamagnétiques qui affectent le sens longitudinal (T 1) et transversale (T 2) des temps de relaxation, respectivement de 1,2.
Les complexes de gadolinium ion lanthanide avec polyamino ligands acides polycarboxyliques sont 1 OPN les plus couramment utilisés T. Gadolinium (III) réduit la relaxation T 1temps de protons de l' eau, augmentant ainsi le contraste du signal lors d' expériences d' IRM 3. Cependant, le gadolinium ionique est toxique; sa taille se rapproche de celle du calcium (II), et elle affecte sérieusement la signalisation dans les cellules assistées de calcium. Par conséquent, acycliques et macrocycliques chélates sont utilisés pour neutraliser cette toxicité. Divers ligands polydentés ont été développés jusqu'à présent, ce qui entraîne gadolinium (III) ayant une stabilité thermodynamique élevée et l' inertie cinétique 1. Ceux qui sont fondés sur les cyclen azamacrocycle 12 chaînons, en particulier son tétracarboxylique DOTA dérivé (1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétate) sont complexes les plus étudiés et appliqués de cette classe de CA.
Néanmoins, GdDOTA de type CA sont des systèmes de faible poids moléculaire, présentant certains inconvénients, tels que la faible efficacité du contraste et de l'excrétion rénale rapide. Macromoléculaires et multivalent CA peuvent être une bonne solution à ces problèmes 4. Depuis CA biodistribution est principalement déterminée par leur taille, les CA macromoléculaires affichent beaucoup plus longs temps de rétention dans les tissus. Tout aussi important, la polyvalence de ces résultats , des agents à une concentration locale accrue de la sonde monomère MR (par exemple, un complexe GdDOTA), ce qui améliore sensiblement le signal RM acquises et la qualité de la mesure.
Les dendrimères sont parmi les échafauds les plus préférés pour la préparation des multivalent CA pour l' IRM 4,5. Ces macromolécules hautement ramifiées ayant des dimensions bien définies sont sujettes à diverses réactions de couplage sur leur surface. Dans ce travail, nous rapportons la préparation, la purification et la caractérisation d'un CA dendrimères pour l'IRM consistant en une génération 4 (G4) poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimère couplé à chélates GdDOTA-like (DCA). On décrit la synthèse du dérivé réactif du DOTA et son couplage avec le dendrimère PAMAM. Sur complexation avec Gd (III), la caractérisation physico-chimique norme procedure de DCA a été réalisée. Enfin, des expériences d'IRM ont été réalisées pour démontrer la capacité de DCA pour produire des images IRM avec un contraste plus fort que ceux obtenus à partir de bas poids moléculaire AR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Préparation de l'agent de contraste IRM dendrimère nécessite une sélection appropriée de l'unité monomère ( par exemple, le chélateur Gd (III)). Ils réduisent la toxicité de cet ion paramagnétique et, à ce jour, une grande variété de chélateurs macrocycliques acyclique et servent à cette fin 03/01. Parmi ceux – ci, des chélateurs macrocycliques de type DOTA possèdent la stabilité thermodynamique plus élevée et l' inertie cinétique et, par conséquent, sont le choix p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Materials
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
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