Denne protokollen beskriver utarbeidelse og karakterisering av en dendrimere magnetic resonance imaging (MRI) kontrastmiddel som bærer cyclen-basert makrosykliske chelater koordinerende para gadolinium-ioner. I en serie av MRI-eksperimenter in vitro, blir dette middel ga en forsterket MRI-signal i forhold til de kommersielt tilgjengelige monomere analog.
Paramagnetiske komplekser av gadolinium (III) med asyklisk eller makrosykliske chelater er de mest brukte kontrastmidler (CAS) for magnetisk resonans imaging (MRI). Deres formål er å forbedre avslapning frekvensen av vann protoner i vev, og dermed øke MR bildekontrast og spesifisiteten av MR-målinger. Nåværende klinisk godkjent kontrastmidler er lavmolekylære molekyler som er raskt fjernet fra kroppen. Bruken av dendrimerer som bærere av paramagnetiske chelatorer kan spille en viktig rolle i den fremtidige utviklingen av mer effektive MRI-kontrastmidler. Nærmere bestemt, er økningen i lokale konsentrasjon av den paramagnetiske type resulterer i en høyere signal kontrast. Videre tilveiebringer dette en lengre CA vev retensjonstid på grunn av sin høye molekylvekt og størrelse. Her viser vi en praktisk fremgangsmåte for fremstilling av makromolekylære MRI-kontrastmidler basert på poly (amidoamin) (PAMAM-dendrimerer) med monomacrosykliske DOTA-type gelatorer (DOTA – 1,4,7,10–1,4,7,10-tetraacetate). Den chelaterende enheten ble tilføyd ved å utnytte reaktiviteten av isotiocyanatet (NCS) -gruppe mot aminoverflategruppene av PAMAM dendrimer å danne thiourea broer. Dendrimere produkter ble renset og analysert ved hjelp av kjernemagnetisk resonansspektroskopi, massespektrometri, og elementanalyse. Til slutt ble høyoppløselige MR-bilder registreres og signal kontrastene oppnådd fra den preparerte dendrimere og de kommersielt tilgjengelige monomere midler ble sammenlignet.
Magnetic resonance imaging (MRI) er en kraftig og ikke-ioniserende avbildningsteknikk mye brukt i biomedisinsk forskning og klinisk diagnostikk på grunn av sin ikke-invasiv natur og utmerket kontrast iboende soft-vev. De mest brukte MR metoder anvender signalet som oppnås fra vannprotonene, noe som gir bilder med høy oppløsning og detaljert informasjon i vev basert på forskjeller i tetthet av vann signaler. Den signalintensitet og spesifisiteten av de MRI-eksperimenter kan bli ytterligere forbedret ved bruk av kontrastmidler (CAS). Disse er paramagnetiske eller superparamagnetiske art som påvirker den langsgående (T 1) og tverrgående (T 2) relaksasjonstider, henholdsvis 1,2.
Komplekser av lantanid ion gadolinium med polyaminopolykarboksylsyre ligander er de mest brukte T 1 CAer. Gadolinium (III) forkorter T 1 avslapningtidspunktet for vannprotonene, noe som øker således signalet kontrasten i MRI-eksperimenter 3. Imidlertid er ionisk gadolinium giftig; dens størrelse er tilnærmet lik den for kalsium (II), og det alvorlig påvirker kalsium-assistert signalering i celler. Derfor er acykliske og makrocykliske chelater som anvendes for å nøytralisere denne toksisitet. Forskjellige flertannede ligander har blitt utviklet hittil, noe som resulterer i gadolinium (III) komplekser med høy termodynamisk stabilitet og kinetisk inerte en. De som er basert på 12-leddede azamacrocycle cyclen, spesielt dens tetracarboxylic derivat DOTA (1,4,7,10–1,4,7,10-tetraacetate) er de mest undersøkte og anvendte komplekser av denne CA klassen.
Likevel GdDOTA-type instanser er lavmolekylære systemer, viser visse ulemper som lav kontrast effektivitet og rask renal utskillelse. Macromolecular og flerverdige instanser kan være en god løsning på disse problemene 4. Siden CA biodistribusjon er i hovedsak bestemt av sin størrelse, makromolekylære instanser vise mye lengre oppholdstider innenfor vev. Like viktig er det multivalency av disse midler resulterer i en økt lokal konsentrasjon av den monomere MR sonden (f.eks GdDOTA kompleks), i vesentlig grad forbedrer den ervervede MR-signalet og målekvaliteten.
Dendrimerer er blant de mest foretrukne stillasene for fremstilling av flerverdige CAer for MRI 4,5. Disse høyt forgrenede makromolekyler med godt definerte størrelser er utsatt for forskjellige koblingsreaksjoner på overflaten. I dette arbeidet, rapporterer vi forberedelse, rensing og karakterisering av en dendrimere CA for MR består av en generasjon 4 (G4) poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimer koblet til GdDOTA-lignende chelater (DCA). Vi beskriver syntesen av det reaktive derivat DOTA og dens kobling til PAMAM dendrimer. Ved kompleks med Gd (III), standard fysisk-kjemiske karakter procedure av DCA ble utført. Til slutt ble MRI-eksperimenter utført for å demonstrere evnen til DCA for å produsere MR-bilder med en sterkere kontrast enn de som oppnås fra lav molekylvekt CAer.
Fremstilling av den dendrimere MRI-kontrastmiddel krever passende valg av den monomere enhet (dvs. den chelator for Gd (III)). De reduserer giftigheten av denne paramagnetisk ion, og til dato, et bredt utvalg av acykliske og makrosykliske chelatdannere tjene dette formålet 1-3. Blant disse makrocykliske DOTA-type chelatorer har den høyeste termodynamisk stabilitet og kinetisk inerte og, følgelig, er de mest foretrukne valg for fremstilling av inert MRI-kontrastmidler 1,18. Videre er de …
The authors have nothing to disclose.
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Cyclen | CheMatech | C002 | |
tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
Diethyl ether | any source | ||
Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
n-Hexane | any source | For column chromatography | |
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
Methanol | any source | For column chromatography | |
Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
Sintered glass funnel | any source | ||
Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
Magnetic stirrer | any source | ||
PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
Lophylizer | any source | ||
Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
pH meter | any source | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
Centrifuge | any source | ||
NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
Topspin | Bruker | version 2.1 | |
Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
Vortex mixer | any source | ||
Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
Plastic tube vials | any source | ||
Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |