preparação e<em> In Vitro</em> Caracterização de agentes de contraste à base de dendrímeros para Ressonância Magnética
Summary
Este protocolo descreve a preparação e caracterização de um agente de contraste dendrimérico ressonância magnética (MRI), que transporta os quelatos macrocíclicos baseados-ciclen coordenação iões paramagnéticos gadolínio. Numa série de experiências de ressonância magnética in vitro, este agente produzido um sinal de ressonância magnética amplificado quando em comparação com o análogo monomérico comercialmente disponível.
Abstract
complexos paramagnéticos de gadolínio (III) com acíclico ou quelatos macrocíclicos são os agentes de contraste mais comumente utilizados (CAS) para imagens de ressonância magnética (MRI). O seu objectivo é melhorar a taxa de relaxação dos protões da água no tecido, aumentando assim o contraste da imagem MR e a especificidade das medições de ressonância magnética. agentes de contraste actuais clinicamente aprovados são moléculas de baixo peso molecular que são rapidamente eliminados do corpo. O uso de dendrímeros como transportadores de agentes quelantes paramagnéticas podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento futuro de agentes mais eficazes de contraste para IRM. Especificamente, o aumento na concentração local das espécies paramagnéticas resultados em um sinal de contraste mais elevado. Além disso, esta CA fornece um tempo de retenção mais longo do tecido devido ao seu elevado peso molecular e tamanho. Aqui, demonstramos um processo conveniente para a preparação de agentes de contraste macromoleculares de MRI à base de poli (amidoamina) (PAMAM) dendrímeros com monomacrocíclicos do tipo quelantes DOTA (DOTA – 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acetato). A unidade quelante foi anexado ao explorar a reactividade do grupo isotiocianato (NCS) para os grupos amina na superfície do dendrímero PAMAM para formar pontes de tioureia. dendriméricos produtos foram purificados e analisados por meio de espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa e análise elementar. Finalmente, as imagens de RM de alta resolução foram registados e os contrastes sinal obtido a partir do dendrimérico preparada e os agentes monoméricos disponíveis comercialmente foram comparados.
Introduction
A ressonância magnética (MRI) é uma técnica de imagem poderosa e não-ionizante amplamente utilizado na investigação biomédica e diagnóstico clínico devido à sua natureza não invasiva e excelente contraste de tecidos moles intrínseco. Os métodos de ressonância magnética mais comumente utilizados utilizar o sinal obtido a partir de protões da água, fornecendo imagens de alta resolução e a informação detalhada dentro dos tecidos com base em diferenças na densidade dos sinais de água. A intensidade do sinal e a especificidade das experiências de ressonância magnética pode ser ainda melhorada utilizando agentes de contraste (CAs). Estas espécies são paramagnéticos ou superparamagnéticos que afectam o longitudinal (T1) e transversal (T2) dos tempos de relaxação, respectivamente 1,2.
Complexos do gadolínio lantanídeos íon com poliaminoácidos ligandos de ácidos policarboxílicos são as mais comumente usadas T 1 CAs. Gadolínio (III) encurta o t um relaxamentotempo dos protões da água, aumentando assim o contraste do sinal em MRI experiências 3. No entanto, o gadolínio iónico é tóxico; o seu tamanho, que se aproxima de cálcio (II), e isto afecta gravemente a sinalização em células assistida-cálcio. Portanto, acíclicos e macrocíclicos quelatos são empregadas para neutralizar esta toxicidade. Vários ligandos multidentados têm sido desenvolvidos até ao momento, resultando em complexos de gadolínio (III) com elevada estabilidade termodinâmica e inércia cinética 1. Aqueles com base nos ciclen azamacrocycle de 12 membros, em particular, o seu derivado de DOTA tetracarboxílico (1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acetato) são os complexos mais investigados e aplicadas desta classe CA.
No entanto, GdDOTA tipo CAs são sistemas de baixo peso molecular, exibindo certas desvantagens, como a baixa eficiência de contraste e excreção renal rápido. Macromolecular e multivalente CAs pode ser uma boa solução para estes problemas 4. Desde CA biodistribução é determinada principalmente pelo seu tamanho, CAs macromoleculares exibir tempos de retenção muito mais longos dentro dos tecidos. Igualmente importante, o multivalência destes agentes resulta em uma concentração local aumentada da sonda monomérica MR (por exemplo, complexo GdDOTA), melhorando substancialmente o sinal MR adquirida ea qualidade da medição.
Dendrímeros estão entre os andaimes mais preferidos para a preparação de CAs multivalente de MRI 4,5. Estas macromoléculas altamente ramificada, com dimensões bem definidas são propensos a várias reacções de acoplamento na sua superfície. Neste trabalho, relatamos a preparação, purificação e caracterização de uma CA dendrimérico para MRI consistindo de um 4 (G4) poli geração (amidoamina) (PAMAM) dendrimer acoplado a quelatos GdDOTA-like (DCA). Descreve-se a síntese do derivado de DOTA reactivo e o seu acoplamento ao dendrímero PAMAM. Após complexação com Gd (III), a caracterização físico-química padrão procedure da DCA foi realizada. Finalmente, as experiências de MRI foram realizadas para demonstrar a capacidade de DCA para produzir imagens de RM com um contraste mais forte do que os obtidos a partir de baixo peso molecular CAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preparação do agente de contraste para IRM dendrimérico requer selecção adequada da unidade monomérica (isto é, o quelante de Gd (III)). Eles reduzem a toxicidade do ião paramagnético e, até à data, uma ampla variedade de acíclicos e quelantes macrocíclicos servir para este fim 1-3. Entre estes, os quelantes macrocíclicos-DOTA tipo possuem a maior estabilidade termodinâmica e inércia cinética e, portanto, são a escolha preferida para a preparação de agentes de contraste para IRM i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Materials
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
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