förberedelse och<em> In Vitro</em> Karakterisering av dendrimer baserade kontrastmedel för magnetisk resonanstomografi
Summary
Detta protokoll beskriver framställningen och karakteriseringen av en dendrimer magnetisk resonanstomografi (MRT) kontrastmedel som bär cyklen-baserade makrocykliska kelater samordnande paramagnetiska gadolinium-joner. I en serie av MRI-experiment in vitro, producerade detta medel en förstärkt MRI signal jämfört med den kommersiellt tillgängliga monomera analogen.
Abstract
Paramagnetiska komplex av gadolinium (III) med acykliska eller makrocykliska kelater är de vanligaste kontrastmedel (CAS) för magnetisk resonanstomografi (MRT). Deras syfte är att öka relaxationshastigheten av vattenprotoner i vävnad, vilket således ökar MR bildkontrasten och specificiteten av mätningarna MRI. Nuvarande kliniskt godkända kontrastmedel är lågmolekylära molekyler som elimineras snabbt från kroppen. Användningen av dendrimerer som bärare av paramagnetiska kelatorer kan spela en viktig roll i den framtida utvecklingen av effektivare MR-kontrastmedel. Speciellt ökningen i lokal koncentration av de paramagnetiska resultat arter i en högre signal kontrast. Vidare tillhandahåller denna CA en längre vävnads retentionstid grund av dess höga molekylvikt och storlek. Här visar vi ett bekvämt förfarande för framställning av makromolekylära MRI-kontrastmedel baserade på poly (amidoamin) (PAMAM) -dendrimerer med monomacrocykliska DOTA-typ kelatorer (DOTA – 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraacetat). Den kelatbildande enheten bifogades genom att utnyttja reaktiviteten hos isotiocyanat (NCS) grupp mot amin ytgrupper av PAMAM-dendrimer att bilda tiourea broar. Dendrimera produkterna renades och analyserades med hjälp av kärnmagnetisk resonansspektroskopi, masspektrometri och elementaranalys. Slutligen var högupplösta MR-bilder registreras och signal kontraster som erhållits från den förberedda dendrimera och kommersiellt tillgängliga mono medel jämfördes.
Introduction
Magnetisk resonanstomografi (MRT) är en kraftfull och icke-joniserande bildteknik används i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning och klinisk diagnostik på grund av dess icke-invasiv karaktär och utmärkt inneboende mjukvävnad kontrast. De vanligaste MRI metoder utnyttjar den signal som erhålls från vattenprotoner, vilket ger högupplösta bilder och detaljerad information i vävnaderna baserade på skillnader i densitet av vatten signaler. Signalintensiteten och specificiteten för de MRI experiment kan förbättras ytterligare med användning av kontrastmedel (CA). Dessa är paramagnetiska eller superpara arter som påverkar längd (T 1) och tvärgående (T2) relaxationstider, respektive 1,2.
Komplex av lantanider jon gadolinium med polyaminopolykarboxylsyra ligander är de vanligaste T 1 CA. Gadolinium (III) förkortar T en avkopplingtidpunkten för vattenprotoner, vilket ökar signal kontrast i MRI experiment 3. Men är jonisk gadolinium giftigt; dess storlek ungefär som kalcium (II), och det allvarligt påverkar kalcium assisterade signalering i celler. Därför är acykliska och makrocykliska kelater som används för att neutralisera denna toxicitet. Olika flertandade ligander har utvecklats hittills, vilket resulterar i gadolinium (III) komplex med hög termodynamisk stabilitet och kinetisk tröghet 1. De som är baserade på 12-ledade azamacrocycle cyklen, i synnerhet dess tetrakarboxylsyra derivat DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraacetat) är de mest undersökta och tillämpade komplex av denna CA klass.
Ändå GdDOTA-typ CA är lågmolekylära system, som uppvisar vissa nackdelar såsom låg kontrasteffektivitet och snabb renal utsöndring. Macro och multivalenta CA kan vara en bra lösning på dessa 4 problem. Eftersom CA biodistribution bestäms huvudsakligen av deras storlek, makromolekylära CA visa mycket längre retentionstider inom vävnader. Lika viktigt är det multivalens av dessa medel resulterar i en ökad lokal koncentration av den monomera MR sonden (t.ex. GdDOTA komplex), att väsentligt förbättra den förvärvade MR-signalen och mätningen kvalitet.
Dendrimerer är bland de mest föredragna ställningar för framställning av multivalenta CA för MRI 4,5. Dessa i hög grad grenade makromolekyler med väldefinierade storlekar är benägna att olika kopplingsreaktioner på sin yta. I detta arbete, vi rapporterar beredning, rening och karakterisering av en dendrimer CA för MRI består av en generation 4 (G4) poly (amidoamin) (PAMAM) dendrimer kopplad till GdDOTA-liknande kelat (DCA). Vi beskriver syntesen av det reaktiva DOTA-derivat och dess koppling till PAMAM-dendrimer. Vid komplexbildning med Gd (III), standarden fysikal-kemiska egenskaper procedure av DCA utfördes. Slutligen, var MRI experiment för att demonstrera förmågan hos DCA att producera MR-bilder med en starkare kontrast än de som erhålls från lågmolekylärt CA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framställningen av den dendrimera MRI kontrastmedlet kräver lämpligt val av den monomera enheten (dvs. kelatorn för Gd (III)). De minskar toxicitet paramagnetisk jon och hittills en mängd olika acykliska och makrocykliska kelatorer tjäna detta ändamål 1-3. Bland dessa makrocykliska DOTA-typ kelatorer har den högsta termodynamisk stabilitet och kinetisk tröghet och därmed är den mest självklara valet för framställning av inert MR-kontrastmedel 1,18. Dessutom är de benägna a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Materials
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, &. #. 2. 0. 1. ;. . The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. . Vogel’s textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. . Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. . Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. . MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let’s meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
