Abstract
염증 전이에 암 발생 및 홍보, 결국 진행의 기초가 암의 특징이다. 따라서, 표준 암 연대에 소염제를 추가하는 것은 환자의 결과를 향상시킬 수있다. 그러한 약물 아스피린 (아세틸 살리실산, ASA)은, 암 화학 예방법 및 항 종양 활성에 대해 탐구되었다. 시클로 옥 시게나 제 2 축 프로스타글란딘 억제 외에 ASA의 항암 활동은 핵 인자 ĸB (NFĸB) 억제에 기인하고있다. ASA 장시간 사용이 위장관 독성을 유발할 수 있기 때문에, 프로 드럭 전략이 성공적으로 구현되었다. 이 전구 약물에 ASA의 카르 복실 산 마스크 추가 약물 조제가 통합되어 설계.
이 프로토콜은 우리가 아스피린 푸마르산 전구 약물 GTCpFE 합성 및 유방암 세포에서 NFĸB 경로의 억제를 그 특징으로하며 암의 감쇠 줄기 등 적절한 방법을 설명넥타이, 중요한 NFĸB 의존 표현형. ASA는 ASA 구조에 추가 푸마 상당히 활성에 기여하고 있음을 나타내는 임의의 억제 활성이 결여 반면 GTCpFE 효과적으로 유방암 세포주에서 NFĸB 경로를 억제한다. 면역 표현형 - 또한, GTCpFE는 mammosphere 형성을 차단하고 암 줄기 세포 관련 CD44 + CD24를 감쇠에 의해 상당한 항암 줄기 세포의 활동을 보여줍니다. 이들 결과는 화학적 예방 및 암 치료를위한 개선 된 항 - 염증 약물의 개발이 가능한 전략을 수립.
Introduction
염증은 전이 1 입사 및 승진, 결국 진행으로 종양의 여러 측면을, 기초가 품질 증명이다. 유방암이 더욱 전이 및 재발 모두 유방암 발병률 감소, 위험과 연관된다 (살리실산, ASA 아세틸) 고전적인 비 스테로이드 성 항 염증 약물 아스피린의 일정한 사용을 나타내는 역학 관측에 의해지지된다 2,3. ASA 주로 종종 유방암 4,5-에서 상향 조절된다 사이클로 옥 시게나 제 -2 활성을 억제함으로써 작용한다. 그러나, ASA의 항암 효과는 비정상적인 핵 인자 κB (NFκB) 6-8 시그널링의 억제에 의해 매개 될 수있다. 규제 완화 NFκB 경로는 치료 9-11로 종양 세포의 생존, 증식, 이동, 침윤, 혈관 신생, 및 저항을 촉진하기 때문에 중요하다. NFκB 경로의 활성화는 또한 장착 중요하다면역 반응. 따라서, 장기간 NFκB의 억제가 요구되는 항암 치료를 들어, 하나의 긴 지속 면역 억제와 관련된 해로운 부작용을 고려해야한다. 따라서, 치료는 ASA 최적화를위한 좋은 출발점이 될 수있다.
암 치료에 ASA 응용 프로그램에 대한 하나의 한계는 궤양과 위가 12, 13 출혈로 위장 독성과 관련된 사이클로 옥 시게나 제 2, NFκB 억제에 필요한 높은 용량입니다. 그러나, 에스테르 전구 약물로 ASA 변환, ASA의 위장 독성을 감소시킬 수있다. 상기 효능을 향상 및 / 또는 기능을 추가하는 추가적인 구성 요소 또는 부수적 인 약물 조제도 에스테르 프로 드럭 디자인에 혼입 될 수있다. 그러한 pharmacophore는 NFκB 경로가 푸마 레이트 인에 대해 우리가 이전에 NFκB 경로 억제 14,15 중요한 것으로 나타났습니다있는 ASA의 힘을 강화했다.
(15), GTCpFE 및 하이브리드 분자가 아직 NFκB 경로에 대한 강력한 안전 할 것이라는 가설을 세웠다. 우리는 유방암 세포에서의 항 NFκB 활성 및 NFκB 생존 및 성장을 위해 16-21 신호에 의존 유방암 줄기 세포 (CSC 추가) (15)을 차단하는 능력을 시험 하였다. 우리는 NFκB 경로에 대한 GTCpFE의 힘이 크게 ASA (15)을 통해 향상된다 찾을 수 있습니다. 또한, GTCpFE 블록 mammosphere 형성 및 CSC 표면 마커 CD44 + CD24 감쇠 - GTCpFE가 된 CSC (15)를 퇴치 할 수있는 것을 나타내는, 면역 표현형한다. 이러한 결과는 유방 암줄 기세포를 타겟팅 할 수있는 효과적인 소염제로서 아스피린 - 푸마 레이트의 전구 약물을 설정합니다. 유방암 치료의 관점에서, GTCpFE 공격적인 치명적인 질병을 치료할 수있는 가능성을 가지고있다.
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Protocol
아스피린 - 푸마 레이트 전구 약물 GTCpFE 1. 합성
- 메탄올 0.81 ㎖ (20 밀리몰)을 측정하고, 둥근 바닥 플라스크에서 10 ㎖의 물에 혼합 플라스틱 플런저 주사기를 사용. 빙수 욕에 플라스크를 놓고 0 ° C로 생성 된 혼합물을 냉각. 4- 히드 록시 벤질 알코올 (2.48 ㎎, 20 밀리몰)를 첨가하고, 용액이 깨끗해질 때까지 반응 혼합물을 교반 하였다.
- O의 -acetylsalicyloyl 클로라이드의 정량을 계량하고, 분리 플라스크 내의 용매에 용해시켜, 무수 톨루엔 (10 mL) 중의 O의 -acetylsalicyloyl 클로라이드의 용액 (3.77 ㎎, 19 밀리몰)을 준비한다. 플런저 플라스틱 주사기를 사용하여, 단계 1.1에서 제조 한 혼합물에이 용액을 첨가하고, 0 ℃에서 교반하여 반응을 떠난다.
- 박층 크로마토 그래피 (TLC)를 사용하여 반응을 모니터한다. TLC 판은 고정 위상 실리카가 있어야합니다.
- 20:80 에틸 아세테이트 (아세트산 에틸) / 헥산으로 이루어진 이동상을 준비한다. TLC 챔버 내의(또는 작은 용기)는 상기 챔버의 바닥을 덮 이동상 5 mL를 추가한다.
주 : 이동상의 양은 선택된 챔버에 의존한다. 항상 아래쪽을 덮도록 충분한 추가하지만, TLC가 내부에 배치되면, 용제 라인 화합물이 발견되는 높이를 능가한다. - 주사기 (0.2 ㎖)과의 반응의 샘플을 작은 바이알에 넣어 보관하고, 에틸 아세테이트 (3 방울)로 희석. TLC의 감시인으로 조심스럽게 희석 된 반응 혼합물의 샘플을 채취하고, TLC에 자리.
참고 : 관광 명소 1-2mm를해야하며, 이것은 TLC 판의 하부 1/4 인치에서 수행해야합니다. - 동일한 TLC에, 비교 O - 아세틸 클로라이드의 용액의 스폿 (아세트산 에틸 0.5 ㎖ 중의 0.2 mg)을 배치했다. 반점이 건조되면, 챔버에 배치하고, 용매를 전면는 TLC의 상단에 도달 거의 때까지 그것을 실행하자.
- 의 TLC를 가져가 건조하게하고 UV 램프 아래로 시각화. REAC오 -acetylsalicyloyl 염소 자리는 반응 혼합물로부터 사라지면 기이 완료됩니다.
- 반응이 완료되면, 빙수 욕을 제거하고 반응물을 20 시간 동안 실온에서 교반한다.
- 20:80 에틸 아세테이트 (아세트산 에틸) / 헥산으로 이루어진 이동상을 준비한다. TLC 챔버 내의(또는 작은 용기)는 상기 챔버의 바닥을 덮 이동상 5 mL를 추가한다.
- 매체의 다공성 프릿 디스크 흐너 깔때기를 사용하여 침전물을 필터. 섬광 바이알에있는 고체를 올려 실온에서 밤새 건조기에서 진공 하에서 화합물을 떠난다. 건조제로 오산화 인 (P 2 O 5)를 사용합니다.
- 이 반응을 설정하기 전에 적어도 이틀 동안 80 ℃에서 오븐에 배치하여 둥근 바닥 플라스크를 건조. 대안 적으로, 격막 플라스크를 밀봉하고, 진공 펌프 시스템에 연결된 바늘을 관통. 에 진공 펌프를 켜고 열 총을 사용하여 플라스크를 건조. 냉각 할 수 있도록 허용하고,이 단계를 2 회 이상 반복한다.
- 아르곤 가스를 이용하여 풍선을 팽창하고, 그 플런저 H 플라스틱 주사기 (에 연결바늘로) 제거로. 진공 펌프를 끄고 이제 건조 된 둥근 바닥 플라스크에 삽입에 연결된 바늘을 제거합니다. 둥근 바닥 플라스크를 밀봉 격막을 통해 아르곤 풍선에 연결된 바늘을 삽입합니다.
- (무수 테트라 히드로 푸란을 용해, 분리 플라스크에 2- acetyloxybenzoic 산 (100 ㎎, 0.349 밀리몰), 4- 디메틸 아미노 피리딘 (4 ㎎, 0.033 mmol) 및 트리 에틸 아민 (53 ㎎, 0.523 밀리몰) (5) 4- 히드 록시 메틸 에스테르를 추가 ㎖). 바늘에 부착 된 플라스틱 주사기, 밀봉 된 둥근 바닥 플라스크에이 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 빙수 욕에 플라스크를 놓고 0 ° C에 이르기까지 혼합물을 냉각.
- 이전의 혼합물에 무수 테트라 히드로 푸란 (5 mL) 중 에틸 니코틴산 클로라이드의 용액 (68 ㎎, 0.419 밀리몰)을 추가하고, 적가 10 분에 걸쳐. 2-4 시간 동안 0-5 ℃에서 얻어진 용액을 교반한다.
- 에틸 아세테이트 (100 mL) 및 염수 (50ml)로 반응 혼합물을 추출 하였다. <BR /> 주 : 염수는 염화나트륨 포화 용액이다. 그것을 준비하기 위해, 그것은 더 이상 용해되지 않을 때까지 염화나트륨을 (교반) 추가하기 시작 깨끗한 유리 용기에 200 ml의 물을 넣습니다.
- 추출 후, 수성 상을 분리하고, 후자 단계를 두 번 더 반복한다.
- 유리 제품을 교반 할 때, 고체가 응집하지 않을 때까지, 유기 상을 황산 나트륨을 첨가하여 혼합물을 건조. 프릿 디스크 다른 흐너 깔때기를 사용하여, 그 후, 황산나트륨을 제거 40 ° C로 설정 온도를 갖는 회전 증발기를 사용하여 증발 건고하는 둥근 바닥 플라스크에 상기 혼합물을 필터.
- TLC를 사용하여 컬럼 크로마토 그래피에 사용하기 적합한 이동상을 결정한다.
참고 : 본 실험 20:80 아세트산 에틸 / 헥산의 구배를 사용 하였다. - 실리카 겔 적절한 용매 상에 열을 준비합니다. 화합물을 첨가 한 후, PR 황산나트륨 (모래)의 층을 추가otect 용매로 열이 추가됩니다.
- 열이 실행되면, TLC에 의해 용출액을 모니터링 할 수 있습니다. 그들이 컬럼으로부터 수집 될 때마다 다른 시험관 스팟. 관심있는 제품이 용출되면 큰 둥근 바닥 플라스크에 순수한 생성물을 함유하는 모든 샘플을 혼합하고 40 ℃로 설정된 욕 온도로 회전 증발기를 사용하여 건조.
참고 : 제품은 백색 고체로 나타납니다.
- 열이 실행되면, TLC에 의해 용출액을 모니터링 할 수 있습니다. 그들이 컬럼으로부터 수집 될 때마다 다른 시험관 스팟. 관심있는 제품이 용출되면 큰 둥근 바닥 플라스크에 순수한 생성물을 함유하는 모든 샘플을 혼합하고 40 ℃로 설정된 욕 온도로 회전 증발기를 사용하여 건조.
- GTCpFE의 구조를 확인하려면 (각각 1 H 및 13 C) 제조업체의 지침에 따라 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼을 양성자와 탄소를 수집합니다.
참고 : 본 연구에서 400 MHz의 FT NMR 분광계는 1 H, 13 C 스펙트럼을 수집 하였다. 충분한 데이터의 해상도를 얻기 위해, 실온에서 적어도 25 스캔을 실행. 관찰 NMR 피크가 다음, 1 H NMR (CDCl3 중)를 같았다 : 1.29 (t, 3H, 3J = 7.0 ㎐, CH 3) δ; 2.31 (S, 3H, CH 3); 4.26 (Q, 2H, 3J = 7.0 ㎐, COOCH 2); 5.25 (S, 2 H, OCH 2); 6.89 (S, 2H, HC는 = CH); 7.19 (m, 3 H, AR); 7.42 (m, 3 H, AR); 7.65 (m, 1 H, AR); 8.22 (일, 1 H, 3J = 7.8, 4J = 1.2 Hz에서, AR). 13 C NMR (CDCl3 중)은 δ : 169.70, 164.86, 164.75, 162.89, 151.28, 150.69, 134.76, 134.32, 133.26, 133.16, 132.25, 129.81, 126.26, 124.11, 122.47, 122.04, 66.40, 61.43, 21.05, 14.15를. - 또한, 제조자의 지시에 따라, 정확한 중량 측정을위한 이온 트랩과 시간의 비행 기술 (LCMS-IT-TOF)와 함께 액체 크로마토 그래피 질량 분석법을 이용한 고해상도 질량 스펙트럼을 수집한다.
참고 : 본 연구에서는 (M + NH 4 +) 계산 : 430.1496을; 관찰 : 430.1477.
2. GTCPFE은 유방암 세포에 NFĸB 활성을 억제
- 문화 조건 셀
- 인간 유방암 세포주 유지 표준 셀 막힌 따라, MCF-7 및 MDA-MB-231스트럭처 기술 및 5 % CO 2, 37 ℃의 가습 인큐베이터 내에서 전파.
- 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된, 페놀 레드, 1 % 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 1 % 항생제 페니실린 - 스트렙토 마이신 1640 배지에서 MCF-7 세포의 배지를 준비 및 6 NG / ㎖ 인슐린. 5 % FBS, 1 % 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 1 % 항생제 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 향상 최소 필수 중간 (IMEM)에서 MDA-MB-231 세포 배지를 준비한다.
- 인간 유방암 세포주 유지 표준 셀 막힌 따라, MCF-7 및 MDA-MB-231스트럭처 기술 및 5 % CO 2, 37 ℃의 가습 인큐베이터 내에서 전파.
- NFκB-RE 루시 페라 제 리포터 분석
- 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신을 이용하여를 Trypsinize 유방암 MCF-7 세포 수동 웰 당 90,000 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에서 혈구 및 시드를 사용하여 계산.
- NFκB 응답 요소 (NFκB-RE) 루시 페라 구조, 1 μg의의 플라스미드 DNA와 다음 날, 공동 트랜 세포 / 웰, 알옹 promoterless 레 닐라 루시퍼 라제 구조, 0.2 μg의와 / 웰. 세중의 각 치료 그룹에 대한 형질을 수행합니다.
- PBS로 두 번 세포를 씻으하고, 플라스미드 DNA의 혼합물 및 무 혈청 배지에서 형질 전환 시약 (예를 들어, 리포 펙 타민)의 웰 당 1 μL에 품어. 6 시간 후, 일반 배지 1 ㎖에 (항생제 페니실린과 스트렙토 마이신없이) 매체를 변경합니다.
- 16 시간 후, 각 웰에 차량 또는 GTCpFE의 다른 주식 솔루션 또는 ASA 약 1 μl를 추가합니다. 1000 배 농도로 디메틸 술폭 시드 약물 스톡 용액 (100, 50, 20, 10 및 1 mm)를 녹인다. 약을 추가 한 후, 37 ℃에서 2 시간 동안 세포를 배양한다.
- NFκB 경로를 활성화하려면, 10 NG / ㎖의 최종 농도 각 우물에 친 염증성 사이토 카인 TNFα (10 μg의 / ㎖ 원액)를 추가하고 4 시간 동안 배양한다. TNFα 혼자 컨트롤을 포함합니다. 배지를 흡인하고, 세포를 저장할-80 ° C에서의.
- 제조자의 지시에 따라 루시퍼 라제 리포터 분석 시스템을 사용하여 루시 페라 제를 측정한다.
주 : 처음 루시퍼 라제 분석 시스템 (예를 들어 이중 루시퍼 라제 분석 시스템)을 사용하는 경우, 완충액 10 ㎖에 재 현탁하고 1 mL의 분취 액으로 -80 ℃에서 저장하여 루시퍼 라제 분석 시약의 용액을 제조 하였다.- 물로 5 배 스톡 버퍼 희석 1X 용해 버퍼를 준비한다. 각 웰 사용하여 100 ㎕의 1 배 용해 버퍼를 Lyse 세포. 중간 속도에서 15 분 동안 궤도 통에 번호판을 품어.
- 샘플 당 1.5 ml의 튜브 라벨. 실온 (샘플 당 50 μL가 필요합니다)와 호일을 유지하기위한 해동 루시 페라 제 분석 시약. 유리 병에 1 배 담금질 시약을 준비, 버퍼와 소용돌이에 1시 49분 희석은 (샘플 당 50 μL가 필요합니다).
- 레이블의 microcentrifuge 튜브에 세포 용 해물 10 μl를 추가합니다. 그 후 루시퍼 라제 분석 시약 50 μL를 추가 한부드럽게 소용돌이. 직후 홀더에 튜브를 배치하고 루미의 이중 루시페라아제 프로그램을 통해 발광을 측정한다. 선택하고 다음을 누릅니다 실행 메가 프로토콜 → 듀얼 저런 형광을 → OK.
- 시험관 부드럽게 소용돌이에 담금질 시약의 50 μl를 추가합니다. 발광을 측정합니다. 각 샘플에 대해 이러한 단계를 반복합니다.
- 레 닐라 내부 통제 (NFκB-RE / 레 닐라)에 NFκB-RE를 정상화하여 스프레드 시트를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. TNFα 억제제 전용 제어 데이터 (TNFα가 100 %로 설정)과 비교.
- NFκB-대상 유전자의 전사
- 종자 MCF-7 2.1 절에 기술 된 바와 같이 제조 된 2 ml의 매체 볼륨에 잘 당 250,000 세포에서 6 웰 플레이트 세포.
- 다음 날, 이전에 또 다른 2 시간 동안 TNFα 10ng / ㎖를 추가로 2 시간 동안 다른 GTCpFE 1000 배 주식 (100, 50, 20, 10, 1 ㎜) 2 μl를 추가합니다. 모든 치료를 실행세중있다. 차량과 TNFα 혼자 컨트롤을 포함합니다.
- RNA는 제조업 자 (22)의 지시에 따라 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 방법을 사용하여 격리. RNA 농도 (디 에틸 피로 카보에서 (DEPC) 처리 된 물) 및 분광 광도계를 사용하여 RNA의 순도를 결정합니다. -80 ° C에서 얼음 또는 상점에 RNA 샘플을 보관하십시오. RNA를 처리 할 때 만의 RNase없는 장벽 팁을 사용합니다.
- 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) 역전사 효소의 시판되는 키트를 사용하여 0.5 μg의 총 RNA를 역 전사.
참고 :이 키트는 5 배는의 dNTP 혼합물, 랜덤 헥사 혼합물과 함께, 버퍼 및 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 포함한다.- M-MLV 200 단위, 0.5 밀리미터의 dNTPs, 최종 10 ㎕의 반응 볼륨 랜덤 헥사 100 NG, 10 mM의 DTT, 1X 버퍼와 DEPC 물에 RNA 0.5 μg의 추가. 37 ° C에서 50 분에 대한 PCR 클러를 사용하여 역전사 반응을 수행 한 후 70 ℃에서 15 분간# 176; C는-열 불 활성화 효소를합니다.
- 이중 증류수 100 μL로 생성 된 cDNA 생성물을 희석하고, 각각의 후속 정량 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 반응을 2 μL를 사용한다.
- 앞으로 믹스와 1.25 μM 농도 각에서 관심의 유전자 프라이머 역. 이중 가닥 DNA의 검출을 가능하게하기 위해, 2 μL를 두 번 증류수로 1.25 μM 프라이머 믹스 1 μL와 염료의 2 배의 5 μl를 마스터 믹스를 준비합니다. 96 웰 PCR 플레이트로 cDNA를 2 μL 마스터 믹스의 8 μl를로드합니다.
- 데이터 제조업체의 지시에 따라 수동 분석 (40 사이클, 95 내지 60 °의 C)을 실시간 PCR 시스템을 이용하여 정량적 PCR을 수행한다.
주 : 검증 이전에보고되었다 (23)에 사용 된 모든 PCR 프라이머. - 리보솜 단백질 (36)과 함께 ΔΔCt 방법을 통해 스프레드 시트를 사용하여 유전자 발현 배의 변화를 계산내부 통제 (23)의 역할 B4의 mRNA.
3. GTCpFE는 시험관에서 유방암 줄기 세포를 금지합니다
- Mammosphere 형성의 분석
- 둘 베코의 변형 이글 중간을 보완하여 mammosphere (MS) 매체를 준비 : 1 %의 메틸 셀룰로오스와 영양 혼합물 F-12 (DMEM / F12) 페놀 레드 무료 매체. 부드러운 4 ℃에서 밤새 흔들어 용해 할 수 있습니다. 필터 매체를 살균 및 B27 (1X), 1 % 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 1 μg의 / ㎖의 하이드로 코르티손, 20 NG / ml의 재조합 인간 상피 성장 인자로 보충.
- 단층 배양 (37 ℃에서 5 분 동안 트립신, 0.25 %)의 소화를 트립신 MDA-MB-231 세포주의 단일 셀을 준비하고 메쉬 체를 통해 필터링. 수동 / 잘 400 셀의 밀도로 96 웰 매우 낮은 부착 판에 하나의 해리 세포와 플레이트를 계산합니다. 다음 날, GTCp의 다른 농도를 추가FE (예 GTCpFE 최종 농도 : 1, 10, 20, 50 μM) 최종 부피는 100 μL이다. 세중의 모든 치료를 실시한다.
- 인큐베이터에서 배양 7 일 후, 거꾸로 현미경을 사용하여 이미징 소프트웨어를 통해 이미지를 수집. 수동으로 직경이 수 MS> 75 μm의를 계산합니다. 차량 제어에 대한 약물 치료를 비교.
주 : MS> 75 ㎛의 직경이 상기 영상 소프트웨어를 사용하여 결정된다.
- CD44 + CD24 - CSC 면역 표현형
- 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 % 트립신으로 MDA-MB-231 세포를 Trypsinize. 2.1 절에 설명 된대로 10 ml의 매체에 접시 당 3 백만 세포에서 10cm 접시에서 혈구와 씨앗을 사용하여 계산합니다. 72 시간 동안 세포 차량 (10 μL 디메틸 설폭 사이드) 또는 GTCpFE (50 mM의 주식의 10 μl를) 추가합니다.
- 차량이나 GTCpFE 치료 그룹의 경우를 Trypsinize (단계 3.2.1에서와 같이) 세포 및 테스트 & # '에 100 만 세포를 배포39; 또는 1X 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 2 ㎖을 함유 통제 '5 ㎖ 폴리스틸렌 튜브는 2 % FBS가 보충 버퍼입니다.
- 표면 마커 CD44 및 CD24, 아래로 스핀 세포 염색 및 최종 100 μL 전체 볼륨에 튜브를 테스트하기 위해 20 각 복합 항체의 μL 및 HBSS + 2 % FBS를 추가하려면 (1 : 5 희석). 튜브를 제어하는 HBSS + 2 % FBS 100 μl를 추가합니다. CD44-APC 결합 된 항체 및 CD24-PE 항체 단일 얼룩 컨트롤 또는의 IgG immunoisotype 컨트롤을 포함합니다.
- 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 세포를 품어. 400 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운 2 % FBS 200 μl를 HBSS 버퍼에 재구성. 어둠 속에서 얼음에 세포를 유지합니다.
- 제조자의 지시에 따라 FACS 분석 기기를 사용하여 살아있는 세포의 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 수행한다. 각각의 튜브에 대한 최소 50,000 이벤트를 수집합니다. 세중에서 실행 트리트먼트.
참고 : 게이팅은 공동 (아무 염색에서 컨트롤을 기반으로ntrol 관), IgG의 immunoisotypes 및 CD44-APC 및 CD24-PE 단일 얼룩. - 가능한 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.
참고 : GTCpFE-처리 된 CD44 + CD24와 세포의 비율 (%) - 면역 표현형 추정 및 차량 제어에 비교된다.
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Representative Results
도 1에있어서, 사이토 카인에 대한 아스피린 푸마르산 전구 약물 GTCpFE, 그 저해 활성의 화학적 구조는 유방암 세포에서 NFĸB 경로를 유발하는 표시된다. GTCpFE는 세포 간 접착 분자 1 (ICAM1), 케모카인 CC 모티브 리간드 2 (CCL2), 및 종양 괴사 인자 (TNF) (그림으로 NFĸB 대상 유전자의 두 NFĸB 엔드 포인트, NFĸB-RE 루시 페라 제 활동 (그림 1B) 표현을 억제 MCF-7 유방암 세포에서 1C). 50 % 저해 농도를 계산 양쪽 엔드 포인트 (IC 50)의 값은 ~ 20 μM이다. IC 50 값은 그래프 소프트웨어를 사용하여 계산된다. 비교 ASA 자체도 200 μM (10 배 GTCpFE의 IC 50) 유방암 세포에는 저해 활성 (그림 1B, 파란색 선)를 보여줍니다으로. 이것은 ASA의 significa에 푸마 레이트 pharmacophore 추가의 전구 약물 전략을 나타낸다ntly 안티 - NFĸB 활동을 향상시킵니다.
안티 CSC의 활동을 측정하기 위해, 우리는이 분석을 사용하십시오 mammosphere (MS) 형성 분석 및 CD44 + CD24 발현하는 세포의 인구 - 면역 표현형, 유방암 (24)의 선의의 CSC 표면 마커를. GTCpFE는도 2a에 도시 된 용량 의존적으로 MDA-MB-231 유방암 세포의 MS의 형성을 억제한다. 접착 문화 NFĸB 경로 억제 마찬가지로, mammosphere 형성 용 IC 50 값은 20 μM ~하다. 이러한 일관성은 암줄 기세포가 NFĸB이 생존과 번식 16-21에 대한 신호에 의존 주어진 예상된다. MDA-MB-231 세포 집단 (도 2B) - 또한 GTCpFE 사전 처리는 CD44 + CD24의 상당한 붕괴 결과. 함께, 이러한 결과는 효과적으로 유방 암줄 기세포를 대상으로 GTCpFE의 기능을 설정합니다.
그림 1 : GTCpFE이 유방암 세포의 NFĸB 경로를 억제한다. (A) 아스피린 푸마 레이트 전구 약물 GTCpFE의 화학 구조. (B - C) MCF-7 세포는 전처리 2-4 시간 동안 TNFα로 처리하여 다양한 GTCpFE, ASA의 농도, 또는 차량 (10 NG / mL)로 2 시간이었다. (B) NFκB-RE 활성 이중 루시페라아제 리포터 분석법으로 측정 하였다. NFκB의 표적 유전자, ICAM1, TNF 및 CCL2의 (C) 발현은 RT-QPCR 측정 하였다. 약물 저해 활성 혼자 TNFα의 %로 꾸몄다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. 이 수치는 기준 (15)에서 수정되었습니다. 이 figu의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오레.
도 2 - 유방암 세포의 면역 표현형 GTCpFE는 mammosphere 형성과 CD44 + CD24을 억제한다. MDA-MB-231 세포 (A) Mammosphere (MS)가 형성 GTCpFE의 다양한 농도로 처리 한 후에 측정 하였다. MS의 성장 (왼쪽)와 20 배에서 MS의 대표 사진의 정량 (오른쪽) 표시됩니다. GTCpFE의 효과 % 차량 제어로 도시된다. (B)가 CD44 + CD24 - 인구는 72 시간 동안 50 μM GTCpFE 처리 MDA-MB-231 세포를 FACS 분석에 의해 측정 하였다. FACS (오른쪽) 각 인구 비율 (왼쪽)와 대표 산포도의 정량이 표시됩니다. 데이터는 SEM 및 통계 분석이 일원 분산 분석 FOLL의 ± 평균으로 표시하고 있습니다Tukey에의 사후 검사에 의해 빚진. *** P <0.001. 이 수치는 기준 (15)에서 수정되었습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Red Medium | Life Technologies | 11875-093 | Warm up to 37 °C before use |
| IMEM | Corning | 10-024-CV | Warm up to 37 °C before use |
| DMEM / F12 Medium | ThermoFisher | 21041-025 | Warm up to 37 °C before use |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| L-Glutamine 100x | Life Technologies | 25030-081 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Trypsin 2.5% 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| Methyl Cellulose | Sigma | M0262 | |
| B27 Supplement 50x | Gibco | 17504-044 | |
| EGF | Gibco | PHG0311L | |
| NFκB-RE Luciferase Construct | Clontech | pGL4.32 | |
| Renilla Luciferase Construct | Promega | pGL4.70 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
| StepOne Real Time PCR System | Thermo Scientific | ||
| Eclipse Microscope | Nikon | ||
| CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter | ||
| QCapture Software | QImaging | ||
| Summit Software | Beckman Coulter | ||
| GraphPad Software | Prism | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-013 | |
| 100 mM dNTP Set | Invitrogen | 10297-018 | |
| Random Hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
| Costar 96W, ultra low attachment | Corning | 3474 | |
| HBSS, 1x | ThermoFisher | 14025134 | |
| CD44-APC conjugated antibody | BD Pharmingen | 560990 | Store at 4 °C, protect from light |
| CD24-PE antibody | BD Pharmingen | 560991 | Store at 4 °C, protect from light |
| Recombinant Human TNFα | Fisher | 210TA100 | |
| CCL2 Primer Forward Sequence | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
| CCL2 Primer Reverse Sequence | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
| ICAM1 Primer Reverse Sequence | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
| ICAM1 Primer Forward Sequence | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
| TNF Primer Forward Sequence | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
| TNF Primer Reverse Sequence | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
| 36B4 Primer Forward Sequence | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
| 36B4 Primer Reverse Sequence | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 4-Hydroxybenzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 20806-10G | |
| O-Acetylsalicyloyl Chloride | Sigma-Aldrich | 165190-5G | |
| Phosphorous Pentoxide | Sigma-Aldrich | 79610-100G | |
| Ethyl Fumaroyl Chloride | Sigma-Aldrich | 669695-1G | |
| Sodium Sulfate | Sigma-Aldrich | 246980-500G | |
| 4-Dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 714844-100ML | 0.5 M in tetrahydrofuran |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886-100ML | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989-100ML | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757-2L | |
| 400 MHz FT NMR spectrometer | See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details |
References
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