الماوس المجهرية تسريب تقنية لالمستهدفة المواد تسليم في الجهاز العصبي المركزي Published: January 31, 2017 doi: 10.3791/54804

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Ana R. Leda¹, Levy Dygert¹, Luc Bertrand¹, Michal Toborek^1,2

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, ²The Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

Introduction

في النماذج الحية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) أمراض تتطلب التنفيذ الفعال للمواد الخارجية، مثل المخدرات، ومسببات الأمراض، أو exosomes، في الدماغ. ولذلك، ينبغي أن يسبب طريقة التسليم المثالي الحد الأدنى من الصدمة للحيوان، والحفاظ على سلامة الشبكة العصبية، وتحقيق تركيزات المواد عالية في الدماغ ^1.

وقد وصفت العديد من الطرق الجراحية لتسليم مادة المحلي، بما في ذلك داخل غمد، داخل المخ، والحقن داخل البطين أو يزرع ^{2، 3، 4، 5.} هذه الطرق، ومع ذلك، تعتبر الصدمة على الجهاز العصبي المركزي، وتسمح إدارة كميات منخفضة فقط من المواد المثيرة للاهتمام. وعلاوة على ذلك، فقد قيل أن المواد الخارجية يمكن إزالتها بسرعة عن طريق السائل النخاعي ⁶ 7 عندما تستخدم التقنيات المذكورة أعلاه. وتستخدم طرق التسليم النظامية، مثل الفم والرئة، تحت الجلد، وطرق الوريد، وهو الأكثر شيوعا في النماذج الحيوانية، على الرغم من أنها تظهر فعالية منخفضة في إيصال المواد إلى الجهاز العصبي المركزي، وذلك بسبب امتصاص من قبل الأجهزة الأخرى ^{8 و 9.} وبالتالي، هذه المسارات التسليم تتطلب جرعات مرتفعة من المواد التي يديرها، وزيادة خطر الآثار الجانبية والسمية ^{10 و 11.}

هنا، نحن تصف تقنية جراحة الماوس التسريب، والتي توفر بشكل فعال المواد مباشرة إلى الدماغ عن طريق الشريان السباتي الداخلي. بالإضافة إلى استهداف التسليم إلى الجهاز العصبي المركزي، وهذا الأسلوب لا تجاوز الحواجز الفيزيولوجية الطبيعية، وبالتالي يتصل اتصالا وثيقا البيولوجيةعمليات لتر المشاركين في مقاطع من العلاجات أو مسببات الأمراض في الدماغ.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات المتعلقة في بروتوكول التالي من جامعة ميامي المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC). وبالإضافة إلى ذلك، تجرى جميع الإجراءات في المرافق التي وافقت عليها الجمعية للتقويم والاعتماد للرعاية الحيوان المعملية الدولية (AAALAC).

1. إعداد الفئران لجراحة

1. تخدير الماوس مع isoflurane مختلطة مع الأكسجين، وذلك باستخدام نظام التخدير المختبر. استخدام الأيزوفلورين في وضع بين 4-5٪ وتدفق الأوكسجين في 2 لتر / دقيقة على آلة التجارية (راجع المواد الجدول). نقل الحيوان إلى سطح الجراحة، تحت مجهر تشريحي، والحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف (استخدام الأيزوفلورين وضع 1،5-2،5 وتدفق الأوكسجين في 2 لتر / دقيقة).
   1. تأكد من أن معدل التنفس الماوس حوالي 1-2 التنفس / ثانية دون يلهث. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن هذا الحيوان لا يحمل رد فعل التحفيز شعرات ودواسة صeflex (قرصة أخمص قدميه). مراقبة معدل التنفس والجهد أثناء الجراحة، على الأقل كل 5 دقائق. اتبع محددة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة والمبادئ التوجيهية البيطرية لرصد القوارض التخدير.
2. تطبيق قطرة من زيوت التشحيم العيون على كل عين باستخدام مسحة معقمة لمنع جفاف. ويوصى إدارة المضادة للالتهابات والمسكنات لتخفيف الانزعاج.
3. مع الحيوان ملقى على ظهره، والحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف.
4. تنظيف منطقة الرقبة الحيوان عن طريق محو المنطقة ثلاث مرات مع الإيثانول 70٪ والكلورهيكسيدين. حلاقة منطقة جراحة الحيوان باستخدام شفرة حلاقة (مفصلة أدناه).

2. تشريح الشريان السباتي المشترك (CCA)

1. تنفيذ الإجراء المجهرية بأكمله تحت مجهر تشريحي. باستخدام مقص جراحي وملقط أداء شق خط الوسط الضحلة في الرقبة، من فوق عظمة الصدر إلى أقل من طنانه الفك (حوالي 3-4 سم).
2. باستخدام ملقط الدهنية منفصل بعناية والنسيج الضام لفضح القصبة الهوائية.
3. ضع وسادة (وجوه مستديرة، حوالي 0.5 سم وقطرها) على الجزء الخلفي من الرقبة من الماوس لتمديد العنق، مما يعرض المنطقة.
4. فصل الأنسجة باستخدام إما ضام الأنسجة أو السنانير.
5. على الجانب الحيوان الأيسر من القصبة الهوائية، ينتف الريش بعناية بعيدا النسيج الضام لفضح CCA اليسار.
6. باستخدام ملقط إزالة بعناية كل النسيج الضام لفضح التشعب التقييم القطري المشترك، وبداية كل الشرايين السباتية الداخلية والخارجية.

3. إعداد التقييم القطري المشترك لتسريب المواد المخدرة

1. إدراج جزأين من الخيط النايلون (حوالي 1 سم لكل منهما) تحت الشريان السباتي الخارجي (ECA)، وذلك باستخدام ملقط.
2. وضع عقدة دائمة في أعلى نقطة ممكنة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
3. عند أدنى نقطة ممكنة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، وعلى الفور فوق التشعب التقييم القطري المشترك، ومكانعقدة القابلة للإزالة. وينبغي أن تكون هذه العقدة فضفاض بالمقارنة مع عقدة العليا.
4. إغلاق التقييم القطري المشترك باستخدام مقطع السفينة، عند أدنى نقطة ممكنة.
5. إغلاق الشريان السباتي الداخلي (ICA) باستخدام مقطع السفينة.
6. باستخدام مقص الربيع تسليخ مجهري أداء قطع صغيرة في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (حوالي 2 مم)، وبين عقدة اثنين.

4. تسريب المواد المخدرة عبر ICA

1. تجميع نظام الحقن في الوريد. نعلق 6 بوصات من الأنابيب الشعرية (أبعاد مثالية: 2.5 مم × 1.2 مم) إلى حقنة السلين تحتوي على 250 ميكرولتر من المادة المراد غرست (المخدرات، ومسببات الأمراض، والحويصلات خارج الخلية، وغيرها)، وإدراج غيض شعري بلطف في شق تنفيذ في الخطوة 3.6.
2. الاستمرار في الانزلاق على شعري حتى تصل إلى نقطة الوسط بين التشعب ومقطع إغلاق التقييم القطري المشترك.
3. التعادل لأسفل انخفاض اللجنة الاقتصادية لأفريقيا عقدة. تحقق من أن عقدة فضفاضة بما يكفي للسماح الشعرية سيولة وضيقة بما يكفي لمنع تتسربز.
4. إزالة مقطع من الإدارة المدنية الإسرائيلية.
5. تطبيق الضغط بلطف على حقنة مكبس السماح مادة ضخ في ما يقرب من 10 ميكرولتر في الثانية الواحدة.

5. إجراءات تسريب المشاركة

1. مكان مقطع مرة أخرى على ICA.
2. إزالة بلطف الأنابيب الشعرية.
3. التعادل لأسفل انخفاض اللجنة الاقتصادية لأفريقيا عقدة تماما.
4. إزالة لقطات من ICA والتقييم القطري المشترك.

6. شق الإنتهاء والعناية بعد العملية

1. إزالة ضام أو الأنسجة السنانير وسادة.
2. منطقة خياطة نظيفة باستخدام محلول ملحي معقم.
3. إغلاق شق باستخدام النايلون خياطة / إبرة وملقط.
4. إدارة المضادة للالتهابات والمسكنات لتخفيف الانزعاج بعد الجراحة.
5. وضع الحيوانات في قفص وضعها على وسادة التدفئة لا يقل عن 1 ساعة والانتعاش الشاشة.

Representative Results

هذه التقنية المجهرية الماوس ضخ الموصوفة هنا هي متعددة للغاية، واستخدمت لتقديم مواد مختلفة مباشرة في الدماغ، بما في ذلك تسليم الخلايا السرطانية في نموذج تمثيلي لتكوين ورم خبيث في الدماغ ^{1 و 12.}

هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لتقييم الجوانب المرضية لمسببات الأمراض المختلفة في الجهاز العصبي المركزي. في نموذج الفأر من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، وكان يستخدم في جراحة ضخ لحقن الجزيئات الفيروسية مباشرة في التقييم القطري المشترك. لقد وجدنا أنه بعد 7 أيام من الجراحة، وكان الجهاز العصبي المركزي إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق الوقت الحقيقي PCR. وعلاوة على ذلك، فإن العدوى نصف الكرة المماثل 6-10 أضعاف أعلى من نصف الكرة الأرضية المقابل (الشكل 2).

نهج آخر مناسب لعملية جراحية ضخ الموصوفة هنا هو تقديم الحويصلات خارج الخلية (المتغيرات المناخية الأساسية)، وذلك أساسا exosomes، في الجهاز العصبي المركزي. ويبين الشكل 3 وجود CD63، وهي علامة للحصول على exosomes، وصفت مع الأخضر بروتين فلوري (GFP) في الدماغ المماثل من الفأرة 24 ساعة بعد الحقن في الوريد.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي للتسريب من خلال الشريان السباتي الداخلي. في إدراج (أ) و (ب) تصور توطين عقدة العلوية والسفلية، على التوالي؛ (ج) تمثل قطع صغير في اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، التي من خلالها يتم إدخال أنابيب الشعرية (خط رمادي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4804fig2.jpg "/>
الشكل 2: الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية من قبل في الوقت الحقيقي PCR بعد تسريب الفيروسي عن طريق الشريان السباتي الداخلي. الحانات وتشير متوسط مستويات فيروس نقص المناعة البشرية الحمض النووي المأخوذة من الفئران 7 آخر أيام التسريب عبر الشريان السباتي الداخلي الأيسر. أشرطة الخطأ تصور الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): المناعي من GFP الموسومة ماوس الدماغ القسم تصور CD63، وهي علامة Exosome، بعد المتغيرات المناخية الأساسية التسريب عن طريق الشريان السباتي الداخلي. صورة تمثيلية تصور microvessel الماوس الدماغ المرتبطة المتغيرات المناخية الأساسية CD63 التعبير (الخضراء). شريط الحجم: 50 ميكرون.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد أثبت المجهرية ضخ الموصوفة هنا أن تكون ناجحة جدا في إيصال المواد الخارجية من مختلف الخصائص البيولوجية في الجهاز العصبي المركزي، ومنع نشر غير المرغوب فيها في جميع أنحاء الجسم ^{1، 12.} تعطيل حاجز الدم في الدماغ هو سمة المرضية من العديد من الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي؛ ولتقييم العلاقة بين المواد الخارجية مع حاجز الدم في الدماغ هو من أهمية كبرى والفائدة.

هذا نموذج لعملية جراحية قدمت يسبب الصدمة تقتصر على الحيوانات ويرتبط مع انخفاض وفيات جدا ^{1، 12.} وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء لا تتداخل مع وظيفة الجهاز العصبي المركزي أو الدماغي تدفق الدم ^{1، 12.} الجانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو إجراء خفض الصحيح في اللجنة، والتي ينبغي أن تسمح فقطإدخال الأنابيب الشعرية. وهناك قطع أوسع يسبب تسرب المادة المراد حقنها، والتي تتطلب جراحة اللجنة الاقتصادية لأفريقيا آخر على موقع المعاكس. من أجل منع هذه الحالة، ينبغي أن يكون الأنابيب الشعرية قطرها أكبر من قطع، ويجب أيضا أن يكون لها حافة حادة من أجل تسهيل دخولها من خلال الشريان. فيما يتعلق بالجانب الفني، وأفراد مدربين تدريبا كاملا غير قادرة على أداء هذه الجراحة في غضون 20 دقيقة.

الحد الأكبر من هذه التقنية هو إمكانية ضخ مرة واحدة فقط خلال نفس ICA. للتسليم مادة المتكررة في الجهاز العصبي المركزي، سفينة microport يحتاج إلى أن تستخدم وصفت سابقا ^1. وتقنية الموضحة هنا لديه القدرة على المساعدة في دراسات حول التفاعلات الإيجابية والسلبية جديدة داخل BBB، وكذلك لتقديم مسببات الأمراض والمخدرات وكلاء الفسيولوجية في الدماغ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia instrument	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine Science Tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine Science Tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine Science Tool	00109-11
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-08
Nylon suture	Braintree Scientific	SUT-S 104
Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.)	Braintree Scientific	MRE01050
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherScientific	50-121-8005