Introduction
In vivo-modeller av sentralnervesystemet (CNS) sykdommer krever en effektiv levering av eksogene substanser, slik som medikamenter, patogener, eller exosomes, inn i hjernen. Derfor bør en ideell leveringsmåte forårsake minimal skade på dyret, bevare integriteten av den neuronale nett, og oppnå høye stoffkonsentrasjoner i hjernen 1.
Mange kirurgiske fremgangsmåter for lokal stoffavgivelsen er blitt beskrevet, inkludert intra kappe, intracerebral, og intraventrikulære injeksjoner eller implantater 2, 3, 4, 5. Disse tilnærmingene er imidlertid anses traumatisk på sentralnervesystemet, og tillate tilførsel av kun lave mengder av substansen av interesse. Videre har det blitt foreslått at eksogene substanser hurtig kan fjernes ved hjelp av cerebrospinalvæske 6 7 når de ovennevnte teknikker anvendes. Systemiske leveringsmetoder, for eksempel oral, pulmonal, subkutan og intravenøs vei, er mer vanlig i dyremodeller, selv om de oppviser lav effektivitet i å levere substanser til CNS, på grunn av opptak av andre organer 8, 9. Derfor er disse ruter av arrangementet krever forhøyede doser av administreres stoffer, som øker risikoen for bivirkninger og giftighet 10, 11.
Her beskriver vi en mus infusjon mikro teknikk, noe som effektivt gir stoffer direkte inn i hjernen via arteria carotis interna. I tillegg til å målrette levering til CNS, denne teknikken ikke omgå normale fysiologiske barrierer og er derfor svært relevant for biological prosessene som er involvert i de avsnitt av terapeutiske eller patogener inn i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De som er involvert i følgende protokoll prosedyrer har blitt godkjent av University of Miami Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). I tillegg er alle prosedyrer blir utført i anlegg som er godkjent av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. Utarbeidelse av mus for kirurgi
- Bedøve mus med isofluran blandet med oksygen, ved bruk av en laboratorie-anestesi system. Bruk isofluran ved å sette mellom 4-5% og oksygen på 2 l / min på kommersiell maskin (Se Materials tabell). Overfør dyret til operasjonen overflaten, under et stereomikroskop, og opprettholde anestesi ved hjelp av en nesekonus (bruk isofluran innstilling 1.5 til 2.5 og oksygen ved 2 l / min).
- Kontroller at musen respirasjonsfrekvens er rundt 1-2 åndedrett / sek uten gisper. I tillegg sikre at dyret ikke viser værhår stimulering reaksjon og pedal reflex (tå klype). Overvåk respirasjonsfrekvens og innsats under operasjonen, minst hver 5 min. Følg bestemt Institutional Animal Care og bruk komité og veterinær retningslinjer for gnager anestesi overvåking.
- Påfør en dråpe oftalmisk smøremiddel på hvert øye ved bruk av en steril vattpinne for å hindre tørrhet. Administrering av anti-inflammatorisk og smertestillende for å lindre ubehag anbefales.
- Med dyret ligger på ryggen, opprettholde anestesi ved hjelp av en nesekonus.
- Rengjør dyrets nakke området ved å tørke av området tre ganger med etanol 70% og klorheksidin. Barbere dyrets kirurgi området ved hjelp av en barberhøvel (beskrevet nedenfor).
2. Disseksjon av arteria carotis communis (CCA)
- Utfør hele mikro prosedyren under et stereomikroskop. Ved hjelp av kirurgiske sakser og tenger utføre et grunt midtlinjesnitt i halsen, fra over brystbenet til under than kjeven (ca 3 til 4 cm).
- Bruk pinsett nøye separat fettstoffer og bindevev å avsløre luftrøret.
- Plassere en pute (rund gjenstand, ca 0,5 cm i diameter) på baksiden av halsen på mus for å forlenge halsen, ytterligere utsette området.
- Skill vev ved hjelp av enten en vev retractor eller kroker.
- På dyrets venstre side av luftrøret, forsiktig tweeze hverandre bindevevet for å eksponere den venstre CCA.
- Bruk pinsett forsiktig fjerne alt bindevev å avsløre CCA delinger, og i begynnelsen av både eksterne og interne carotis.
3. Klargjøring av CCA for Substance Infusion
- Sett to segmenter av nylon sutur (ca 1 cm hver) under ekstern arteria carotis (ECA), ved hjelp av tang.
- Plasser en permanent knute på det høyeste punktet mulig av ECA.
- På det laveste punktet mulig av ECA, rett over CCA delinger, steden flyttbar knute. Denne knuten skal være løs i forhold til den øvre knute.
- Lukk CCA bruker et fartøy klipp, på det laveste punktet.
- Lukke arteria carotis interna (ICA) ved hjelp av et fartøy klips.
- Ved hjelp av fjær mikrodisseksjon saks utføre et lite snitt i ECA (ca. 2 mm), mellom de to knop.
4. Stoff Infusion via ICA
- Monter en infusjonssystem. Fest 6 inches av kapillarrør (ideelt mål: 2,5 mm x 1,2 mm) til en tuberkulinprøve sprøyte inneholder 250 mL av stoffet som skal infunderes (narkotika, patogener, ekstracellulære vesikler, blant annet), og sett kapillær spissen forsiktig inn i snittet utføres i trinn 3,6.
- Fortsett å skli ned kapillær til den når et midtpunkt mellom delinger og klippet lukke CCA.
- Bind ned nedre ECA knute. Kontroller at knuten er løs nok til at kapillær flyt og stramt nok til å hindre leaking.
- Fjern klipp fra ICA.
- Press forsiktig på sprøyten stempelet slik at stoffet infusjon på ca 10 mL per sekund.
5. Post Infusjons Prosedyrer
- Plasser klippet tilbake på ICA.
- fjerne kapillarrøret forsiktig.
- Bind ned nedre ECA knute helt.
- Fjern klipp fra ICA og CCA.
6. Snitt Closing og postoperativ omsorg
- Fjern retractor eller vev kroker og pute.
- Clean sutur området med sterilt saltvann.
- Lukk snittet ved hjelp av nylon sutur / nål og pinsett.
- Administrere anti-inflammatorisk og smertestillende for å lindre postoperativ smerte.
- Plasser dyr i bur plassert på varmepute i minst en time og monitor utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen infusjon mikro teknikk som er beskrevet her er meget allsidig og har vært brukt til å levere forskjellige stoffer direkte inn i hjernen, herunder levering av tumorceller i en representativ modell av hjernemetastaser formasjon 1, 12.
Denne teknikken er også egnet til å vurdere de patologiske aspekter av forskjellige patogener i CNS. I en musemodell av HIV-infeksjon, ble infusjonen kirurgi benyttes til å injisere viruspartikler direkte inn i CCA. Vi fant at 7 dager etter operasjonen, CNS var positivt for HIV ved real-time PCR. Videre er den ipsilaterale hemisfæren infeksjon var 6-10 bretter høyere enn den kontralaterale hemisfære (figur 2).
En annen egnet metode for infusjon operasjonen som er beskrevet her er for å levere ekstracellulære vesikler (ECVs), hovedsakelig exosomes, inn i CNS. Figur 3 viser tilstedeværelse av CD63, en markør for exosomes, merket med grønt fluorescerende protein (GFP) i den ipsilaterale hjernen av en mus 24 timer etter infusjon.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av Infusion via arteria carotis interna. I innsatsen (a) og (b) viser lokaliseringen av de øvre og nedre knop, henholdsvis; (c) representerer lite snitt i ECA, gjennom hvilken kapillarrøret er satt inn (grå linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4804fig2.jpg "/>
Figur 2: HIV Detection ved Real-time PCR etter Viral Infusion via arteria carotis interna. Linjene indikerer gjennomsnittlig HIV DNA nivåer høstet fra mus 7 dager etter infusjon via venstre arteria carotis interna. Feilfelt skildre standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescensanalyse av Mouse Brain § skildrer GFP-merket CD63, et Exosome Marker, etter ECVs Infusion via arteria carotis interna. Representanten Bildet viser en musehjerne microvessel forbundet med CD63 uttrykker ECVs (grønt). Skala: 50 mikrometer.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infusjonsmikrobeskrives her har vist seg å være meget vellykket i å levere eksogene substanser av forskjellige biologiske funksjoner i CNS, noe som forhindrer uønsket spredning i hele kroppen 1, 12. Forstyrrelse av blod-hjerne-barrieren er et patologisk trekk ved en rekke CNS-relaterte sykdommer; derfor å vurdere relasjonen av eksogene substanser med blod-hjerne barrieren er av stor betydning og interesse.
Denne operasjonen modellen presenteres bevirker begrenset traumer til dyrene og er forbundet med meget lav dødelighet 1, 12. Dessuten gjør fremgangsmåten ikke forstyrre CNS-funksjonen eller cerebral blodstrøm 1, 12. Den mest kritiske aspekt ved denne fremgangsmåten er å utføre den korrekte snitt i ECA, som skal kun tillateinnføring av kapillarrøret. Et bredere kutt vil føre til lekkasje av stoffet som skal infuseres, hvilket krever en annen ECA kirurgi på motsatt området. For å forhindre denne situasjonen bør kapillarrøret har en større diameter enn det kuttet, og bør også ha en skarp kant for å lette dens inngang gjennom arterien. Angående det tekniske aspektet, er en fullt utdannet personell i stand til å utføre denne operasjonen innen 20 minutter.
Den store begrensning av denne teknikk er muligheten for infusjon en gang gjennom den samme ICA. For gjentatt stoffavgivelsen inn i CNS, et fartøy microport må brukes og har blitt beskrevet tidligere en sikret teknikken beskrevet her har potensial til å bistå i studier av nye positive og negative interaksjoner innen BBB, så vel som for å levere patogener , narkotika og fysiologiske midler inn i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
