Introduction
Merkezi sinir sisteminin in vivo modellerde (CNS) hastalıkları, beyin bu tür ilaçlar, patojenlerin veya eksozom gibi eksojen madde, etkili bir teslim gerektirir. Bu nedenle, ideal bir dağıtım yöntemi, hayvana en az travmaya neden nöronal ağ bütünlüğünü korumak ve beyin 1 yüksek madde konsantrasyonları elde etmelidir.
Yerel madde sağlama çeşitli cerrahi yöntem içi kılıf, intraserebral, intraventriküler enjeksiyonlar veya implantlar, 2, 3, 4, 5 de dahil olmak üzere tarif edilmiştir. Bu yaklaşımlar, ancak, CNS travmatik kabul ve ilgi maddenin sadece düşük hacimli yönetimine izin vardır. Ayrıca, dış kaynaklı maddelerin hızlı bir şekilde beyin omurilik sıvısı 6 çıkarılabilir ileri sürülmüştür 7 gözlenmiştir. Bunlar merkezi sinir sistemine maddeleri sunan düşük etkinliği sergileyen ancak örneğin oral, akciğer, deri altı ve damar içi yollar gibi sistemik uygulama yöntemleri, daha yaygın olarak diğer organlarda 8, 9 alımı nedeniyle, hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bu nedenle, teslimat bu rotalar yan etki ve toksisite 10, 11 riskini artıran, yönetilen maddelerin yüksek dozda gerektirir.
Burada, etkili doğrudan internal karotid arter yoluyla beyine maddeleri sağlayan bir fare infüzyon mikrocerrahi tekniği, açıklar. CNS teslimat hedeflemenin yanı sıra, bu teknik, normal fizyolojik engelleri aşmak ve bu nedenle biologica son derece alakalı değilbeyne terapötik veya patojenlerin pasajlar yer l süreçleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokolde yer alan işlemler Miami Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Buna ek olarak, tüm işlemler laboratuvar Animal Care International Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından onaylanan tesislerinde yürütülmektedir.
Cerrahi Farelerin 1. Hazırlık
- Bir laboratuvar anestezi sistemi kullanılarak, oksijen ile karışık izofluran ile fare anestezisi. 2 L% ve oksijen akışı 4-5 arasında ayarında izofluran kullanın / ticari makinede dak (Malzeme Tablosu bakınız). Bir stereomikroskop altında, cerrahi yüzeyine hayvan aktarın ve bir burun konisi kullanılarak anestezi sürdürmek (- 2 L / dk 2.5 ve oksijen akışını 1.5 ayarını izofluran kullanın).
- nefes nefese kalmadan 2 solunum / sn - fare solunum hızı 1 civarında olduğundan emin olun. Buna ek olarak, hayvan bıyık stimülasyon reaksiyonu ve pedal r sergilemez sağlamakeflex (ayak tutam). Ameliyat sırasında en az her 5 dk solunum hızı ve çaba izleyin. Kemirgen anestezi izlenmesi için özel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve veteriner kurallara uyun.
- kuruluğunu önlemek amacıyla steril bir bez kullanılarak her bir göze göz kayganlaştırıcı bir damla uygulayın. anti-enflamatuar ve rahatsızlığı azaltmak için analjezik uygulanması tavsiye edilir.
- Hayvan sırtında yatarken ile bir burun konisi kullanılarak anestezi korumak.
- parkı etanol% 70 ve klorheksidin ile üç kez silerek hayvanın boyun bölgesini temizleyin. (Aşağıda ayrıntılı) bir jilet kullanarak hayvanın ameliyat alanını tıraş.
Ortak Karotis Arter 2. Diseksiyon (CCA)
- Bir stereomikroskop altında tüm mikrocerrahi prosedürü uygulayın. Cerrahi makas kullanarak ve forseps göğüs yukarıdan t altına, boyun sığ bir ensizyon gerçekleştirinO (yaklaşık 3 ila 4 cm) çene.
- Forseps dikkatle ayrı yağlı ve bağ dokusu kullanılarak trakea ortaya çıkarmak.
- bölgeyi daha fazla açığa boyun uzatmak için farenin ensesine bir yastık (yuvarlak nesneyi, çapı yaklaşık 0.5 cm) yerleştirin.
- Bir doku retraktörü veya kanca kullanarak doku ayırın.
- trakea hayvanın sol tarafında dikkatle sol CCA maruz bağ dokusu ayrı tweeze.
- Forseps dikkatle CCA çatallanma ortaya çıkarmak için tüm bağ dokusu, hem dış ve iç karotid arterlerin başlangıcını kaldırın.
Madde İnfüzyon için CCA 3. hazırlanması
- forseps kullanarak, eksternal karotid arter altında naylon sütür (yaklaşık 1 cm her) iki kesimleri (ECA) yerleştirin.
- ECA mümkün olan en yüksek noktasında kalıcı bir düğüm yerleştirin.
- ECA mümkün olan en düşük noktası, hemen CCA çatallanma üzerinde yer atçıkarılabilir düğüm. Bu düğüm, üst düğüm kıyasla gevşek olmalıdır.
- mümkün olan en düşük noktada, bir gemi klibi kullanarak CCA kapatın.
- Bir gemi klibi kullanarak internal karotis arter (ICA) kapatın.
- Kullanılarak mikrodisseksiyon yaylı makas, iki düğüm arasındaki ECA (yaklaşık 2 mm) küçük bir kesim yapmak.
ICA aracılığıyla 4. Madde İnfüzyon
- bir infüzyon sistemi monte edin. Kılcal boru (6 inç doğru boyutları: 2.5 mm x 1.2 mm) takın maddenin 250 ul ihtiva eden bir tüberkülin şırıngaya (ilaçlar, patojenler, diğerleri arasında hücre dışı veziküller) aşılanmış ve yapılan kesi içine yavaşça kılcal ucu eklemek için adım 3.6.
- o çatallanma ve CCA kapanış klibi arasında bir orta nokta ulaşıncaya kadar kılcal aşağı kaydırmaya devam edin.
- Alt ECA düğüm aşağı kravat. düğüm kılcal akışkanlığını sağlayacak kadar gevşek ve Leakin önlemek için yeterince sıkı olduğundan emin olunörn.
- ICA klipsi çıkartın.
- Yavaşça şırınga pistonu sağlayan madde infüzyon saniyede yaklaşık 10 ul baskı uygulamak.
5. Mesaj İnfüzyon Prosedürleri
- Yeri ICA geri klibi.
- Yavaşça kılcal boru kaldırın.
- tamamen alt ECA düğüm aşağı kravat.
- ICA ve CCA klipleri çıkarın.
6. Kesi Kapanış ve Post-operatif Bakım
- toplayıcı veya doku kanca ve yastık çıkarın.
- steril serum fizyolojik ile temizleyin dikiş alanı.
- naylon sütür / iğne ve forseps kullanarak kesi kapatın.
- anti-enflamatuar ve analjezik ameliyat sonrası rahatsızlığı azaltmak için uygulayınız.
- en az 1 saat ve monitör kurtarma için ısıtma pedi üzerine yerleştirilir kafeste hayvan yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen fare infüzyon mikrocerrahi tekniği çok yönlüdür ve beyin metastaz oluşumunun 1, 12 ait temsili bir modelinde tümör hücrelerinin verilmesi de dahil olmak üzere, doğrudan beyin içine farklı maddelerin aktarılması için kullanılmıştır.
Bu teknik aynı zamanda CNS farklı patojenlerin patolojik açıdan değerlendirmek için uygundur. HIV enfeksiyonu olan bir fare modelinde, infüzyon cerrahi CCA doğrudan viral partikülleri enjekte etmek için kullanıldı. Biz 7 gün ameliyattan sonra, MSS gerçek zamanlı PCR ile HIV pozitif olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, ipsilateral hemisfer enfeksiyonu 6-10 kontralateral yarımkürede (Şekil 2) daha yüksek kıvrımlar oldu.
Burada tarif edilen infüzyon cerrahi Uygun olan bir başka yaklaşım, sunmaktır CNS'ye hücre dışı veziküller (ECVs), esas olarak eksozomlar. Şekil 3, infüzyon sonrası fare 24 saat ipsilateral beyne yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş CD63, eksozom bir işaretin varlığını gösterir.
Şekil 1: İnternal Karotid Arter yoluyla İnfüzyon şematik gösterimi. Insert (a) ve (b) sırasıyla, üst ve alt knot, lokalizasyonu tasvir; (c) kapiler boru sokulduğu ECA küçük bir kesim (gri çizgi) gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4804fig2.jpg "/>
İnternal Karotis Arter aracılığıyla Viral İnfüzyon sonra Real-time PCR ile HIV Algılama: Şekil 2. Barlar 7 gün sol internal karotis arter yoluyla infüzyon sonrası farelerden alınan hasat ortalama HIV DNA seviyelerini göstermektedir. Hata çubukları, standart sapmayı tasvir etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: internal karotid arter yoluyla ECVs İnfüzyon sonra Fare Beyin Bölüm Simgelendiği GFP etiketli CD63, bir Exosome Marker, immünofloresan. Örnek görüntü CD63 eksprese ECVs (yeşil) ile ilişkili bir fare beyin mikrodamar tasvir etmektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron.= "_ Blank" olsun> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan infüzyon mikrocerrahi gövdesi 1, 12 boyunca istenmeyen yayılmasını önleyerek, CNS içine çeşitli biyolojik özellikleri eksojen maddelerin teslim çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Kan-beyin bariyerinin bozulması çok merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıkların patolojik özelliğidir; Bu nedenle, kan-beyin bariyeri ile ekzojen maddelerin ilişkisini değerlendirmek büyük önem ve ilgi konusudur.
Sunulan bu cerrahi model hayvanlar sınırlı travma neden olur ve çok düşük ölüm 1, 12 ile bağlantılıdır. Ayrıca, işlem merkezi sinir sistemi işlev ya da serebral kan akımı 1, 12 ile karışmaz. Bu prosedürün en kritik yönü sadece izin vermelidir ki, ECA doğru kesim yapmaktırKılcal boru yerleştirme. Daha geniş kesim karşısındaki sitede başka ECA cerrahi gerektiren, maddenin sızdıran infüzyon neden olur. Bu durumu önlemek için, kılcal boru kesme daha büyük bir çapa sahip olmalıdır ve aynı zamanda arter yoluyla girişini kolaylaştırmak için keskin bir kenara sahip olmalıdır. Teknik açıdan ilgili olarak, bir tam eğitimli personel 20 dakika içinde bu ameliyatı gerçekleştirmek için yapabiliyor.
Bu tekniğin en önemli kısıtlılığı, aynı ICA boyunca sadece bir kez infüzyon olasılığıdır. CNS, kullanılması gereken ve daha önce tarif Burada açıklanan 1 .bir tekniği BBB içinde yeni, pozitif ve negatif etkileşimleri çalışmalarda yardımcı olmak için, hem de patojen sağlama potansiyeline sahiptir mikroport bir kap içine tekrar madde sağlama için , uyuşturucu ve beyne fizyolojik ajanlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
