Introduction
In vivo modeller af centralnervesystemet (CNS) sygdomme kræver en effektiv levering af eksogene stoffer, såsom narkotika, patogener eller exosomer, ind i hjernen. Derfor bør en ideel leveringsmetode forårsage minimal traume for dyret, bevare integriteten af den neuronale netværk, og opnå høje koncentrationer stof i hjernen 1.
Adskillige kirurgiske metoder til lokal stof levering er blevet beskrevet, herunder intra-kappe, intracerebral, og intraventrikulære indsprøjtninger eller implantater 2, 3, 4, 5. Disse tilgange er imidlertid anses traumatisk for CNS, og tillade indgivelse af kun små mængder af stoffet af interesse. Desuden er det blevet foreslået, at exogene stoffer kan fjernes hurtigt ved cerebrospinalvæsken 6 7, når de ovennævnte teknikker anvendes. Systemisk levering metoder, såsom oral, pulmonal, subkutan og intravenøs ruter, er mere almindeligt anvendt i dyremodeller, selvom de udviser lav effektivitet i at levere stofferne til CNS, på grund af optagelse af andre organer 8, 9. Derfor er disse administrationsveje kræver forhøjede doser af administrerede stoffer, hvilket øger risikoen for bivirkninger og toksicitet 10, 11.
Her beskriver vi en infusion mus mikrokirurgi teknik, som effektivt leverer stoffer direkte ind i hjernen via den interne carotidarterie. Ud over at målrette levering til CNS, er denne teknik ikke omgå normale fysiologiske barrierer og er derfor yderst relevant for Biológical processer involveret i passagerne of Therapeutics eller patogener ind i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De involverede i følgende protokol procedurer er godkendt af University of Miami Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Derudover er alle procedurer udføres i anlæg, der er godkendt af Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. Fremstilling af mus i Kirurgi
- Bedøver musen med isofluran blandet med oxygen, under anvendelse af et laboratorium anæstesi system. Brug isofluran ved indstilling mellem 4-5% og ilt flow ved 2 L / min på den kommercielle maskine (se Materialer tabel). Overfør dyret for kirurgi overflade, under et stereomikroskop, og opretholde anæstesi under anvendelse af en næsekegle (brug isofluran indstilling 1.5 - 2.5 og oxygenstrøm på 2 L / min).
- Sørg for, at musen respirationsfrekvens er omkring 1 - 2 ud respiration / sek uden at gispe. Derudover sikre, at dyret ikke udviser whiskers stimulation reaktion og pedal reFlex (tå knivspids). Overvåg respiration sats og indsats under operationen, mindst hver 5 min. Følg specifik Institutional Animal Care og brug Udvalg og veterinære retningslinjer for gnaver anæstesi overvågning.
- Påfør en dråbe oftalmisk smøremiddel på hvert øje under anvendelse af en steril podepind for at undgå tørhed. Administration af anti-inflammatoriske og analgetiske at lindre ubehag anbefales.
- Med dyret liggende på ryggen, opretholde anæstesi under anvendelse af en næsekegle.
- Rengør dyrets hals område ved at tørre området tre gange med 70% ethanol og klorhexidin. Barbere dyrets kirurgi område med en barbermaskine (beskrevet nedenfor).
2. Dissektion af den fælles Arteria carotis (CCA)
- Udfør hele mikrokirurgi procedure under et stereomikroskop. Anvendelse af kirurgiske sakse og tænger udføre en lavvandet midtlinjeincision i nakken, ovenfra brystbenet til under than kæbe (omkring 3 til 4 cm).
- Med pincet omhyggeligt adskilt fede og bindevæv at blotlægge trachea.
- Placer en pude (rund genstand, omkring 0,5 cm i diameter) på bagsiden af halsen af musen til at forlænge halsen, yderligere udsætte området.
- Adskil vævet under anvendelse af enten en vævssprededilatator eller kroge.
- På dyrets venstre side af luftrøret, omhyggeligt tweeze hinanden bindevævet at blotlægge venstre CCA.
- Brug pincet fjern forsigtigt alt bindevæv at eksponere CCA forgreningen, og i begyndelsen af både eksterne og interne halspulsårer.
3. Forberedelse af CCA for Substance Infusion
- Sæt to segmenter af nylon sutur (ca. 1 cm hver) under ekstern halspulsåre (ECA), med en pincet.
- Placer en permanent knude på det højest mulige i Revisionsrettens punkt.
- På den lavest mulige af Revisionsrettens punkt, umiddelbart over CCA tvedeling, steden aftagelig knude. Denne knude skal være løs i forhold til den øvre knude.
- Luk CCA ved hjælp af en beholder klip, til den lavest mulige point.
- Luk indre carotidarterie (ICA) under anvendelse af en beholder klip.
- Brug mikrodissektions foråret saks udføre et lille snit i ECA (ca. 2 mm), mellem de to knuder.
4. Stof Infusion via ICA
- Saml en infusion system. Vedhæft 6 inches af kapillarrør (ideelle dimensioner: 2,5 mm x 1,2 mm) til en tuberkulin sprøjte indeholdende 250 pi af stoffet, der skal infunderes (narkotika, patogener, ekstracellulære vesikler, blandt andre), og sæt det kapillære spidsen forsigtigt ind i snittet udføres i trin 3.6.
- Fortsæt med at glide ned kapillarrøret, indtil den når et midtpunkt mellem bifurkationen og klemmen lukker CCA.
- Bind ned lavere ECA knude. Kontroller, at knuden er løs nok til at tillade kapillar flydende og stram nok til at forhindre leaking.
- Fjern klip fra ICA.
- tryk forsigtigt til sprøjten stemplet tillader stof infusion med ca. 10 pi per sekund.
5. Indlæg Infusion Procedurer
- Placer klip tilbage på ICA.
- Fjern forsigtigt kapillære rør.
- Bind ned lavere ECA knude helt.
- Fjern klip fra ICA og CCA.
6. Incision Lukning og postoperativ pleje
- Fjern retractoren eller væv kroge og pude.
- Ren sutur område under anvendelse af sterilt saltvand.
- Lukke snittet under anvendelse nylonsutur / nål og pincet.
- Administrere anti-inflammatorisk og analgetisk at lindre postoperative ubehag.
- Placer dyr i bur placeret på varmepude i mindst 1 time og monitor opsving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Infusionen muse mikrokirurgi teknikken beskrevet her er meget alsidig og har været anvendt til at levere forskellige stoffer direkte ind i hjernen, herunder levering af tumorceller i en repræsentativ model af hjernemetastaser formation 1, 12.
Denne teknik er også egnet til at vurdere de patologiske aspekter af forskellige patogener i CNS. I en musemodel for HIV-infektion, blev infusionen kirurgi anvendes til at injicere viruspartikler direkte i CCA. Vi fandt, at 7 dage efter operationen, CNS var positiv for HIV ved real-time PCR. Endvidere den ipsilaterale hemisfære infektion var, 6-10 folder højere end den kontralaterale hemisfære (figur 2).
En anden egnet fremgangsmåde af den her beskrevne infusion kirurgi er at levere ekstracellulære vesikler (vitale klimavariabler), primært exosomer, ind i CNS. Figur 3 viser tilstedeværelsen af CD63, en markør for exosomer, mærket med grønt fluorescerende protein (GFP) i den ipsilaterale hjernen hos en mus 24 timer efter infusion.
Figur 1: Skematisk afbildning af infusion via arteria carotis interna. I indsatsen (a) og (b) viser lokaliseringen af de øvre og nedre knaster henholdsvis; (c) repræsenterer den lille snit i ECA, hvorigennem kapillarrør indsættes (grå linie). Klik her for at se en større version af dette tal.
4804fig2.jpg "/>
Figur 2: HIV Detection af Real-time PCR efter Viral Infusion via Arteria carotis interna. Barer angiver gennemsnitlige HIV-DNA-niveauer høstet fra mus 7 dage efter infusionen via venstre interne halspulsåre. Fejl barer skildrer standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immunofluorescens af Mouse Brain Sektion Depicting GFP-mærket CD63, en exosomet Marker, efter vitale klimavariabler Infusion via Arteria carotis interna. Det repræsentative billede forestiller en musehjerne mikrokar forbundet med CD63 udtrykker vitale klimavariabler (grøn). Scale bar: 50 pm.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infusionen mikrokirurgi beskrevet her har vist sig at være meget vellykket i at levere eksogene stoffer af forskellige biologiske funktioner i CNS, hvilket forhindrer uønsket udbredelse i hele kroppen en, 12. Afbrydelse af blod-hjerne-barrieren er en patologisk kendetegn ved adskillige CNS-relaterede sygdomme; derfor vurdering af forholdet af exogene stoffer med blod-hjerne-barrieren er af stor betydning og interesse.
Denne operation præsenterede model forårsager begrænset traume til dyrene og er forbundet med meget lav dødelighed 1, 12. Desuden indeholder fremgangsmåden ikke interferere med CNS-funktionen eller cerebral blodstrøm 1, 12. Det mest kritiske aspekt af denne procedure er at udføre den rigtige snit i ECA, som kun bør tilladeindsætning af kapillarrør. En bredere snit vil forårsage lækage af stoffet, der skal infunderes, der kræver en anden ECA kirurgi på den modsatte side. For at forhindre denne situation bør det kapillære rør har en større diameter end cut, og bør også have en skarp kant for at lette dets indgang gennem arterien. Med hensyn til det tekniske aspekt, en fuldt uddannet personale er i stand til at udføre denne operation inden for 20 minutter.
Den største begrænsning ved denne teknik er muligheden for infusion én gang gennem den samme ICA. For gentagen stof afgivelse til CNS, et fartøj microport skal anvendes, og er blevet beskrevet tidligere 1 .Den teknikken beskrevet her, har potentiale til at hjælpe med undersøgelserne vedrørende nye positive og negative interaktioner inden BBB, samt at levere patogener , narkotika og fysiologiske agenter ind i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
