Introduction
En modelos in vivo del sistema nervioso central (SNC) requieren un suministro eficaz de sustancias exógenas, tales como medicamentos, agentes patógenos, o exosomas, en el cerebro. Por lo tanto, un método de entrega ideal debe causar un trauma mínimo para el animal, preservar la integridad de la red neuronal, y alcanzar altas concentraciones de sustancia en el cerebro 1.
Se han descrito varios métodos quirúrgicos de entrega sustancia local, incluyendo intra-vaina, intracerebral, y las inyecciones intraventriculares o implantes 2, 3, 4, 5. Estos enfoques, sin embargo, se consideran traumática en el sistema nervioso central, y permiten la administración de sólo volúmenes bajos de la sustancia de interés. Por otra parte, se ha sugerido que las sustancias exógenas pueden eliminarse rápidamente por el líquido cefalorraquídeo 6 7 cuando se emplean las técnicas antes mencionadas. Métodos de administración sistémicas, tales como administración oral, pulmonar, subcutánea, intravenosa, y se utilizan más comúnmente en modelos animales, a pesar de que exhiben una baja eficacia en la entrega de las sustancias en el sistema nervioso central, debido a la absorción por otros órganos 8, 9. Por lo tanto, estas vías de administración requieren dosis elevadas de las sustancias administradas, aumentando el riesgo de efectos secundarios y toxicidad 10, 11.
A continuación, describimos una técnica de microcirugía infusión de ratón, que permite suministrar sustancias directamente en el cerebro a través de la arteria carótida interna. Además de dirigirse a la entrega al sistema nervioso central, esta técnica no pasa por alto las barreras fisiológicas normales y por lo tanto es de gran importancia para biological procesos involucrados en los pasajes de la terapéutica o patógenos en el cerebro.
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Protocol
Los procedimientos involucrados en el siguiente protocolo han sido aprobados por la Universidad de Miami Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). Además, todos los procedimientos se llevan a cabo en las instalaciones aprobadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC).
1. Preparación de los ratones para la cirugía
- Anestesiar al ratón con isoflurano mezclado con oxígeno, utilizando un sistema de anestesia de laboratorio. Utilice isoflurano a establecer entre 4-5% y el flujo de oxígeno a 2 L / min en la máquina comercial (Ver Tabla de Materiales). Transferir el animal a la superficie de la cirugía, bajo un microscopio estereoscópico, y mantener la anestesia utilizando un cono de morro (utilizar la configuración 1.5 isoflurano - 2,5 y el oxígeno en el flujo de 2 L / min).
- Asegúrese de que la frecuencia respiratoria del ratón es de alrededor de 1 - 2 respiración / seg sin jadear. Además, asegúrese de que el animal no presenta reacción estimulación barbas y el pedal reflex (dedo del pie pellizco). Controlar la frecuencia y el esfuerzo de respiración durante la cirugía, por lo menos cada 5 minutos. Siga específica Institucional Cuidado de Animales y el empleo y las directrices veterinarios para el control de roedores anestesia.
- Aplicar una gota de lubricante oftálmica en cada ojo utilizando un hisopo estéril con el fin de evitar la sequedad. Se recomienda la administración de anti-inflamatorio y analgésico para aliviar el malestar.
- Con el animal tumbado sobre su espalda, mantener la anestesia utilizando un cono de nariz.
- Limpiar la zona del cuello del animal limpiando la zona tres veces con etanol 70% y clorhexidina. Afeitarse el área de la cirugía del animal usando una navaja de afeitar (que se detallan a continuación).
2. La disección de la arteria carótida común (CCA)
- Realizar todo el procedimiento de microcirugía bajo un microscopio estereoscópico. Con unas tijeras quirúrgicas y las pinzas realizar una incisión en la línea media de poca profundidad en el cuello, por encima del esternón hasta por debajo de tél mordaza (alrededor de 3 a 4 cm).
- El uso de pinzas graso cuidadosamente separado y el tejido conectivo para exponer la tráquea.
- Coloque una almohada (objeto redondo, alrededor de 0,5 cm de diámetro) en la parte posterior del cuello del ratón para extender el cuello, exponiendo aún más el área.
- Separar el tejido usando un retractor de tejidos o ganchos.
- En el lado izquierdo del animal de la tráquea, pinzas cuidadosamente con el tejido conectivo para exponer la CCA izquierda.
- Utilizando unas pinzas eliminan cuidadosamente todo el tejido conectivo para exponer la bifurcación CCA, y el comienzo de ambas arterias carótidas externa e interna.
3. Preparación de la CCA para la infusión de sustancias
- Inserte dos segmentos de sutura de nylon (aproximadamente 1 cm cada uno) en virtud de la arteria carótida externa (ACE), el uso de fórceps.
- Coloque un nudo permanente en el punto más alto posible de la ECA.
- En el punto más bajo posible de la ECA, inmediatamente por encima de la bifurcación de la ACC, lugarun nudo extraíble. Este nudo debe estar floja en comparación con el nudo superior.
- Cierre la CCA utilizando una grapa de vaso, en el punto más bajo posible.
- Cierre la arteria carótida interna (ACI) utilizando una grapa de vaso.
- Utilizando tijeras de primavera de microdisección realizar un pequeño corte en el ECA (aproximadamente 2 mm), entre los dos nudos.
4. La infusión de sustancias a través de la ACI
- Montar un sistema de infusión. Adjuntar 6 pulgadas de tubo capilar (dimensiones ideales: 2,5 mm x 1,2 mm) a una jeringa de tuberculina que contiene 250 l de la sustancia a infundir (fármacos, agentes patógenos, vesículas extracelulares, entre otros) e inserte la punta capilar suavemente en la incisión realizada en el paso 3.6.
- Continuar a deslizarse por el capilar hasta que alcanza un punto medio entre la bifurcación y el clip de cierre de la CCA.
- Atar el nudo CEPA inferior. Compruebe que el nudo es suficiente para permitir la fluidez capilar suelto y lo suficientemente apretado para evitar leakingramo.
- Retire el clip de la ACI.
- aplicar una suave presión a la infusión de sustancias permitiendo émbolo de la jeringa en aproximadamente 10 l por segundo.
5. Procedimientos después de la infusión
- Coloque el clip de nuevo en el ICA.
- Retire con cuidado el tubo capilar.
- Atar el nudo CEPA inferior por completo.
- Retire los clips de la ACI y el CCA.
6. Cierre la incisión y el cuidado post-operatorio
- Retire retractor de tejido o ganchos y almohada.
- área de sutura limpia usando una solución salina estéril.
- Cerrar la incisión utilizando nylon sutura / aguja y pinzas.
- Administrar anti-inflamatorio y analgésico para aliviar el malestar post-operatorio.
- Lugar de los animales en la jaula colocada en la pista de calentamiento durante al menos 1 hora y la recuperación del monitor.
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Representative Results
La técnica de microcirugía infusión de ratón descrito aquí es muy versátil y se ha utilizado para suministrar diferentes sustancias directamente en el cerebro, incluyendo la entrega de células tumorales en un modelo representativo de la formación de metástasis cerebral 1, 12.
Esta técnica también es adecuado para evaluar los aspectos patológicos de diferentes patógenos en el SNC. En un modelo de ratón de infección por VIH, la cirugía de infusión se utiliza para inyectar partículas virales directamente en el CCA. Se encontró que 7 días después de la cirugía, el SNC fue positivo para el VIH por PCR en tiempo real. Además, la infección hemisferio ipsilateral era 6-10 pliegues más alta que el hemisferio contralateral (Figura 2).
Otro enfoque adecuado de la cirugía de infusión descrito aquí es entregar vesículas extracelulares (ECV), principalmente exosomas, en el SNC. La figura 3 muestra la presencia de CD63, un marcador de exosomas, marcada con proteína fluorescente verde (GFP) en el cerebro de un ratón ipsilateral 24 hr después de la infusión.
Figura 1: Representación esquemática de la infusión a través de la arteria carótida interna. En el inserto (a) y (b) representan la localización de los nudos superiores e inferiores, respectivamente; (c) representa el pequeño corte en la CEPA, a través del cual se inserta el tubo capilar (línea gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2: Detección de VIH por PCR en tiempo real después de la infusión viral a través de la arteria carótida interna. Las barras indican los niveles medios de ADN del VIH recogidas de ratones 7 días después de la infusión a través de la arteria carótida interna izquierda. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inmunofluorescencia de etiquetado GFP-cerebro de ratón Sección representa a CD63, un marcador de exosomas, después de ECV infusión a través de la arteria carótida interna. La imagen representa a un representante de los microvasos de cerebro de ratón que expresan CD63 asociado con ECV (verde). Barra de escala: 50 micras.obtener = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La microcirugía de infusión descrito aquí se ha demostrado ser muy exitoso en la entrega de sustancias exógenas de diversas características biológicas en el SNC, la prevención de la difusión no deseada a través del cuerpo 1, 12. La interrupción de la barrera sangre-cerebro es una característica patológica de diversas enfermedades relacionadas con el SNC; por lo tanto, la evaluación de la relación de sustancias exógenas con la barrera sangre-cerebro es de gran importancia e interés.
Este modelo cirugía presentado causa trauma limitado a los animales y se asocia con muy baja mortalidad 1, 12. Además, el procedimiento no interfiere con la función del SNC o el flujo sanguíneo cerebral 1, 12. El aspecto más crítico de este procedimiento consiste en realizar el corte correcto de la ECA, que sólo debe permitir que elinserción del tubo capilar. Un corte más ancho causará fuga de la sustancia a infundir, que requiere otra cirugía CEPA en el lado opuesto. Con el fin de evitar esta situación, el tubo capilar debe tener un diámetro más grande que el corte, y también debe tener un borde afilado para facilitar su entrada a través de la arteria. En cuanto al aspecto técnico, un personal totalmente capacitado es capaz de realizar esta cirugía dentro de los 20 minutos.
La principal limitación de esta técnica es la posibilidad de infusión sólo una vez a través de la misma ICA. Para la entrega de sustancias repetida en el SNC, un recipiente de micrófonos tipo tiene que ser utilizado y se ha descrito anteriormente 1 .La técnica descrita aquí tiene el potencial para ayudar en los estudios sobre nuevas interacciones positivas y negativas dentro de la BBB, así como para entregar los patógenos , fármacos y agentes fisiológicos en el cerebro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
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