كتلة الأنسجة لتحديد تنكس عصبي في Published: December 15, 2016 doi: 10.3791/54809

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elizabeth R. Sunderhaus¹, Doris Kretzschmar¹

¹Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

Summary

يستخدم على نطاق واسع ذبابة الفاكهة كنظام نموذج لدراسة التنكس العصبي. يصف هذا البروتوكول الطريقة التي انحطاط، على النحو الذي يحدده تكوين فجوة في الدماغ، يمكن قياسها كميا. أنها تقلل أيضا الآثار الناجمة عن إجراء التجارب عن طريق تجهيز والسيطرة باجتزاء والذباب التجريبية كما عينة واحدة.

Abstract

أمراض الاعصاب التقدمية مثل مرض الزهايمر (م) أو مرض باركنسون (PD) هي تهديدا متزايدا لصحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أن نماذج الثدييات قدمت معلومات هامة في الآليات الكامنة وراء المرضية، ومدى تعقيد نظم الثدييات جنبا إلى جنب مع التكاليف الباهظة تحد استخدامها. لذلك، يوفر بسيطة ولكنها راسخة ذبابة الفاكهة نموذج نظام بديل عن التحقيق في المسارات الجزيئية التي تتأثر في هذه الأمراض. إلى جانب العجز السلوكية، وتتميز الأمراض العصبية التي كتبها الظواهر النسيجية مثل موت الخلايا العصبية وaxonopathy. لتحديد انحطاط الخلايا العصبية وتحديد كيف يتأثر بعوامل وراثية وبيئية، ونحن نستخدم منهج النسيجي التي تقوم على قياس الفجوات في العقول ذبابة الكبار. للحد من آثار خطأ منهجي ومقارنة مباشرة مقاطع من السيطرة وإكسبالذباب erimental في إعداد واحد، ونحن نستخدم طريقة "طوق" للأقسام البارافين. ثم يتم تقييم التنكس العصبي عن طريق قياس حجم و / أو عدد من الفجوات التي وضعت في الدماغ ذبابة. يمكن أن يتم ذلك إما من خلال التركيز على منطقة محددة من الفائدة أو من خلال تحليل الدماغ بأكمله من خلال الحصول على الأجزاء المتسلسلة التي تغطي الرأس الكامل. لذلك، هذا الأسلوب يسمح احد لقياس ليس فقط انحطاط شديد ولكن أيضا الظواهر خفيفة نسبيا ويمكن كشفها إلا في بعض الأقسام، كما يحدث أثناء الشيخوخة الطبيعية.

Introduction

مع زيادة في متوسط ​​العمر المتوقع، وأصبحت الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أو الشلل الرعاش تهديد الصحية المتزايدة للسكان عموما. ووفقا لمعاهد الصحة القومية، و 115 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وتوقع أن تتأثر الخرف في عام 2050. وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في تحديد الجينات وعوامل المخاطر التي ينطوي عليها بعض على الأقل من هذه الأمراض، وبالنسبة للكثيرين منهم، والكامنة الآليات الجزيئية لا تزال غير معروفة أو غير مفهومة جيدا.

بسيطة الكائنات نموذج اللافقارية مثل انواع معينة ايليجانس وذبابة الفاكهة توفر مجموعة متنوعة من المزايا التجريبية لدراسة آليات الأمراض العصبية، بما في ذلك دورة حياة قصيرة، عدد كبير من ذرية، وتوافر وسائل الوراثية والجزيئية راسخة وفريدة من نوعها في بعض الأحيان ^{1 -12.} وعلاوة على ذلك، هذه الكائنات قابلة للمنحازةشاشات التفاعل التي يمكن أن تحدد العوامل التي تسهم في هذه الأمراض آثار المشددة أو تخفيف على الظواهر العصبية.

تحليل هذه التفاعلات الوراثية وتقييم آثار الشيخوخة يتطلب بروتوكولات الكمي للكشف عن التنكس العصبي وقياس شدتها. ويمكن أن يتم هذا التقييم بسهولة نسبيا عند قياس الجوانب السلوكية في ذبابة الفاكهة، مثل التعلم حاسة الشم، انجذاب بالجاذبية السلبية، أو انجذاب ضوئي سريع، والتي توفر قيمة الأداء رقمية ^13-21. ومن الممكن أيضا لتحديد الآثار المترتبة على بقاء الخلايا العصبية عن طريق عد الخلايا العصبية. ومع ذلك، وهذا ممكن فقط عندما تركز على مجموعة سكانية محددة يمكن تحديده بوضوح، مثل الخلايا العصبية الدوبامين التي تتأثر في PD، وحتى ذلك الحين، كانت النتائج مثيرة للجدل ^22-24.

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم أسلوب طوق لأداء مسلسل أقسام البارافين، طريقةالتي وضعت أصلا من قبل هايزنبرغ وBöhl، الذي يستخدم لعزل المسوخ الدماغ التشريحية في ذبابة الفاكهة ^25. وفيما بعد تم تكييفها استخدام طريقة طوق، بما في ذلك في cryosections، vibratome أقسام، والأقسام البلاستيك ^26-28. هنا، يتم توظيف هذه الطريقة للحصول على أقسام المسلسل من رئيس الطيران بأكمله، والتي يمكن استخدامها لقياس الفجوات التي تنمي في الذباب مع الظواهر العصبية ^{16،21،29-32.} هذه القياسات يمكن القيام به في مناطق محددة في الدماغ أو يمكن أن تغطي الدماغ بأكمله؛ هذا النهج الأخير يسمح احد لتحديد حتى ضعف الظواهر التنكسية، كما لوحظ أثناء الشيخوخة. وأخيرا، عند استخدام الياقات، وتصل إلى 20 الذباب يمكن معالجتها على النحو إعداد واحدة، وهي ليست فقط أقل، ولكنه يسمح أيضا لتحليل السيطرة والذباب التجريبية في إعداد نفسها، والتقليل من القطع الأثرية نظرا للتغيرات طفيفة في تستغرق وقتا طويلا الإعداد.

Protocol

1. تحديد رئيس على الياقات وتضمينها في البارافين

ملاحظة: جميع الخطوات في عملية التثبيت وينبغي أن يتم في غطاء الدخان. Methylbenzoate، في حين لا يشكل خطرا صحيا، لها رائحة مميزة للغاية، والتي يمكن أن تكون ساحقة إذا لم يتم التعامل معها في غطاء الدخان.

1. قبل التخدير الذباب، ويشكلون 50 مل من محلول Carnoy بإضافة 15 مل من الكلوروفورم و5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 30 مل من 99٪ من الإيثانول (لا تخلط الكلوروفورم وحمض الخليك). سكبه في وعاء زجاجي مع مسطحة القاع، مثل طبق crystalizing، للتأكد من أن الياقات يمكن وضع مسطح وتغطيها تماما من الحل.
2. تخدير الذباب مع CO ₂ أو الأثير.
3. الذباب الموضوع (ما يصل الى 20 مع معظم الياقات) من أعناقهم في الياقات باستخدام ملقط. تذكر للتنسيق بين جميع رؤساء في نفس الاتجاه، كما رأينا في الشكل 1A، ويكون لطيف للتأكد من أن أي ضرر يحدث في الرأس أو العينين.
4. تشمل الذباب شرط oculis (الأسهم، الشكل 1A) في مواقع عشوائية بحيث ترتيب الذباب يمكن التعرف عليها بسهولة في الفروع. وبالإضافة إلى ذلك، في حالة وجود الذباب التجريبية خفيفة أو أبيض لون العين، والخيط بعض الذباب حمراء العينين، مثل النوع البري، بينهما لضمان أن الصباغ يكفي وجود وصمة عار على الشرائح. تسجيل ترتيب الذباب على ورقة البروتوكول جنبا إلى جنب مع عدد طوق في حالة استخدام طوق أكثر من واحد.
5. مرة واحدة وقد تم الانتهاء من ذوي الياقات البيضاء، وضعه في حل Carnoy استعدادا ل3،5-4 ساعة.
6. تفريغ الحل Carnoy في علبة التخلص المناسبة والبدء يغسل الايثانول. تأكد من أن تصب ببطء حتى لا تعكر صفو موضع الياقات في الحاوية.
7. غسل الياقات لمدة 30 دقيقة في 99٪ من الإيثانول مرتين.
8. غسل الياقات في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة. تأكد من تغيير يغسل في الوقت المناسب لمنع overdehydration.
9. وضع الياقات في methylbenzoateO / N في RT. ختم الحاويات مع بارافيلم لمنع تبخر methylbenzoate.
10. صب methylbenozate في وعاء القابل للتصرف السليم في غطاء الدخان. إضافة خليط معدة مسبقا من 1: 1 نقطة انصهار منخفضة (56-57 درجة مئوية) شمع البارافين وmethylbenzoate. من هذه النقطة، تحتاج الياقات إلى أن يوضع في حاضنة عند 65 درجة مئوية للتأكد من أن البارافين لا تتصلب.
11. من اجل الخروج من methylbenozate وخليط البارافين في وعاء القابل للتصرف السليم، وتصب المنصهر النقي شمع البارافين، وأبقى عند 65 درجة مئوية، على الياقات.
12. تغيير البارافين بعد 30 دقيقة، وكرر هذا 5 مرات على الأقل. يجب أن يتم تنفيذ 8 يغسل - 6 على الأقل.
13. وبمجرد أن يغسل كاملة، ووضع أطواق إلى علبة مكعبات الثلج المطاط مع فتحات تقريبا حجم الياقات. صب البارافين المنصهر عليها حتى تغطيها تماما والسماح لها تتصلب O / N (في محاولة لتجنب فقاعات الهواء).
14. إزالة كتل البارافين contaiنينغ الياقات من علبة مكعبات الثلج. فصل كتلة البارافين من ذوي الياقات البيضاء باستخدام شفرة حلاقة، وكسر بلطف من ذوي الياقات البيضاء. فإن رؤساء يكون في كتلة البارافين فيما تكون هيئات ستبقى في طوق. يمكن أن تظل لبنات في درجة حرارة الغرفة.
15. لتنظيف الياقات، نقع عليها في وكيل deparafinization عند 65 درجة مئوية لإزالة البارافين، نظيفة مع الغسل الخفيف، ويغسل في الإيثانول قبل إعادة.

2. باجتزاء وتركيب

1. تدفئة لوحة التدفئة إلى 50 درجة مئوية. وضع أصحاب كائن (أو كتل متزايدة المعادن) وشفرات الحلاقة على لوحة والسماح لهم الاحماء.
2. اعتمادا على الاتجاه المطلوب لباجتزاء، ونعلق كتلة البارافين إما مع رؤساء نحو الجانب (لأقسام أفقية) أو متجهة لأعلى (لأقسام الأمامية) إلى كتلة متزايدة ساخنة (ذوبان لفترة وجيزة كتلة في الجانب اتصال). إزالة كتلة من لوحة التدفئة والسماح لتبرد لا يقل عن 10 ميلن لضمان البارافين هو صلابة كافية لختم الصحيح على كتلة متزايدة. الحفاظ على صف من رؤساء الانحياز بالتوازي مع سطح كتلة قدر الإمكان لمنع أقسام متفاوتة.
3. تأخذ شفرة حلاقة وتقليم البارافين الزائدة بعيدا عن رؤساء الطيران بحيث لا يبقى سوى صف واحد صغير مع رؤساء جزءا لا يتجزأ من (شفرة حلاقة يمكن استعد لتسهيل تقليم). تأكد من عدم خفض أكثر من اللازم بحيث لا كسر البارافين خلال باجتزاء (المزيد تقليم يمكن القيام به خلال باجتزاء).
4. وضع كتلة متزايدة في حامل كائن من مشراح وضمان المواءمة بين صف من رؤساء موازية قدر الإمكان إلى حافة شفرة.
5. إعداد الشرائح المجهر من قبل تغطيتها بطبقة رقيقة من بولي-L-ليسين (PLL) حل والسماح لهم الجافة لمدة 5 دقائق. غطاء لهم مع الماء قبل وقت قصير من استخدامها.
6. قطع 7 ميكرون أقسام ونقل الشريط من المقاطع إلى الشريحة تطفو على الماء. <ر /> ملاحظة: للحصول على الدماغ بأكمله لأقسام أفقية، نقوم بجمع الشريط من عند بدء لقطع في العين حتى تم قطع رأسه تماما (قطع من خرطوم في الدماغ). قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من شريحة واحدة لجميع الرأس.
7. وضع الشريحة على طبق من الحرارة عند 37 درجة مئوية، والسماح للالشريط لتوسيع لمدة 1 دقيقة.
8. إزالة المياه الزائدة (بصب تشغيله أو استعمال المنديل) وتجفيف الشرائح O / N.
9. إزالة شمع البارافين من الشريحة من خلال وضع الشرائح في طويل القامة، الرأسي جرة الشريحة تلطيخ مليئة كيل deparafinization (تغطي تماما الأقسام). أداء 3 يغسل من 30 دقيقة - 60 دقيقة لكل منهما.
10. إزالة الشريحة من غسل النهائي. وضعت 2 قطرات من وسائل الإعلام تضمين على الشريحة، وتغطي مع ساترة كبيرة.

3. تصوير وتحليل الأقسام

1. السماح للشرائح مستعدة لتجف لمدة 1-2 د. ثم، دراستها على microsc مضانمكتب مستشار رئيس الوزراء تحت الضوء الأزرق.
2. استخدام التكبير السفلي لتحديد اتجاه الذباب وللعثور على المنطقة من اهتمام إذا التركيز على منطقة معينة.
   ملاحظة: للحصول على الذباب SWS (انظر الشكل 2)، نجد أن المقطع الذي يحتوي على الصوار الكبير والتقاط صورة (عادة في 40X التكبير). عند تحليل دماغ كامل (كما في الشكل 3)، ونحن تمرير خلال كافة الأقسام من الرأس وإما تصوير المقطع مع النمط الظاهري أشد أو جميع المقاطع التي تظهر فجوات.
3. للاطلاع على تحليل مزدوجة التعمية، واتخاذ وصور عدد من دون معرفة التركيب الوراثي وتسجيل عدد ذوي الياقات البيضاء ووضع الرأس في صف واحد لتتعرف عليها لاحقا.
4. بعد أخذ الصور وتحليلها باستخدام برامج التصوير.
5. حساب عدد من الفجوات في القسم أو في الرأس. لقياس حجم فجوة، افتح الصور في البرنامج وتحديد الفجوات مع مجموعة مختارة جدال. تحديد مقدار بكسل في فجوات المحدد.
6. لتحويلها إلى ميكرون ^2، والتقاط صورة لشريحة معايرة مرحلة ميكرومتر في التكبير المستخدمة للحصول على الصور. تحديد مقدار بكسل في 100 ميكرون ² لحساب عامل التحويل.
7. تحويل مجموع عدد بكسل إلى ميكرومتر ² بقسمة عدد البكسلات التي كتبها عامل التحويل المحسوبة في الخطوة أعلاه.

Representative Results

باستخدام نتائج الطريقة الموضحة في مسلسل أقسام الملون من العين الصباغ ³³ التي تشمل رأس ذبابة بأكمله. ويرد جزءا من هذا في الشكل 1B، حيث يتم عرض المقاطع من رئيس الفردية من أعلى إلى أسفل. وينظر تركت مقاطع من الذباب مختلفة إلى اليمين في هذا المثال. لتسهيل التوجه والتعرف على الذباب، هو عبارة عن ذبابة بلا عيون (oculis جيب) كعلامة على موقف 3 (السهم، الشكل 1B).

لتحديد التنكس العصبي، نقيس تشكيل الفجوات التي يمكن الكشف عنها في هذه المقاطع. وتحدد الفجوات كما جولة والبقع الداكنة التي تقع ضمن neuropil الفلورية الخضراء (النصال في الشكل 2 و 3) أو القشرة والتي هي واضحة في ما لا يقل عن 2 أقسام متتالية من الدماغ ذبابة. قياس تنكس عصبي من قبليمكن أن يتم ذلك إما فجوات قياس من خلال التركيز على منطقة محددة في الدماغ أو عن طريق تحليل الدماغ بأكمله. الحد من التحليل لمنطقة محددة من الدماغ هو مفيد في الحالات التي يؤثر طفرة فقط في منطقة معينة، مثل الفص الشم في futsch ^"OLK متحولة ^34، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم عندما يكون هناك انحطاط شديد في كل أو كثير مناطق الدماغ. مثال لهذا الأخير هو الجبن السويسري (SWS) متحولة (الشكل 2)، حيث قياس كل الفجوات سيكون تستغرق وقتا طويلا. لذا أخذنا صورة واحدة فقط، والتأكد من أن القياسات تم القيام به دائما في نفس المستوى، اتخذنا جميع الصور على مستوى الصوار الكبير (القيادة العامة، الشكل 2A)، الذي يرد فقط في واحد أو قسمين. في حين أننا لم يكشف عن تشكيل فجوة في ¹ الذباب SWS القديمة 1 يوما "(لا تظهر البيانات)، وفقدان وظيفة، أليل ^35، وكانت بعض الفجوات ط كشفهان SWS القديمة لمدة 7 أيام ^'1 الذباب (النصال، الشكل 2A). الشيخوخة الذباب إلى 14 د (الشكل 2B) و 21 د (الشكل 2C) زاد من هذا النمط الظاهري، والتي تبين طبيعته التقدمية. عد عدد من الفجوات في neuropil deutocerebral (DN) باستخدام الطريقة الموصوفة أكد زيادة كبيرة في عدد من الفجوات مع التقدم في السن. كما زاد مجموع مساحة التي يشملها الفجوات بشكل كبير مع الشيخوخة (الشكل 2D).

ومع ذلك، ليس كل المسوخ تظهر مثل هذا النمط الظاهري بالحدة SWS، وفي تلك الحالات، والاختلافات في انحطاط من الصعب تحديد متى التركيز على منطقة صغيرة. وبالمثل، فإن انحطاط الذي يحدث أثناء الشيخوخة معتدل جدا (الشكل 3A - C)، وبالتالي، قمنا بتحليل المخ بأكمله عند قياس هذا النمط الظاهري. تحديد مجموع كل الفجوات في الدماغ كشفوكانت زيادة كبيرة مع التقدم في السن، وهذا هو الحال أيضا عند قياس مجموع مساحة هذه الفجوات (الشكل 3D).

الشكل 1. البارافين أقسام المسلسل. أ) باستخدام طريقة طوق، الذباب التجريبية والضابطة يمكن معالجتها كما عينة واحدة من خيوط لهم على طوق واحد. يتم إدراج بلا عيون الذباب oculis شرط للتوجيه (السهام). ب) رسم تخطيطي يظهر توجه رؤساء الطيران في طوق. C) في هذه الصورة، موجهة يقم مقاطع من رؤساء الطيران مختلفة إلى اليمين على الشريحة. من أعلى إلى أسفل على الشريحة، مسلسل أقسام من رأس ذبابة نفسه يمكن أن ينظر إليه. في هذه الحالة، تم إدراجها ذبابة oculis شرط في موقف الثلاث (السهم). هي ملطخة المقاطع من قبل الصباغ العين الفلورسنت أن يغسل على أقسام بعد القطع. شريط النطاق في A = 5 ملم وفي C = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. تنكس عصبي التقدمي في المسخ السويسري الجبن. البارافين رئيس قسم من 7 اليوم-(A)، 14-اليوم-(ب) و 21-اليوم-SWS (C) القديمة ^"1 الذباب. وتشير النصال على الفجوات التي وضعت مع الشيخوخة. وكميا انحطاط المرتبطة بالعمر عن طريق حساب عدد من الفجوات وقياس مساحة إجمالية من (D). يشار إلى SEM وعدد من الذباب تحليلها. شريط مقياس = 25 ميكرون. *** ع <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. تنكس عصبي يحدث مع تقدم العمر. البارافين رئيس قسم من 10 اليوم-(A)، لمدة 30 يوم-(ب) و 60 اليوم-(C) البالغة من النوع البري الذباب. وتشير النصال على الفجوات التي وضعت في الذباب البالغ من العمر. وكميا انحطاط المرتبطة بالعمر عن طريق حساب عدد من الفجوات وقياس مساحة إجمالية من (D). يشار إلى SEM وعدد من الذباب تحليلها. شريط مقياس = 25 ميكرون. *** ع <0.001. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>

Discussion

يوفر طريقة وصفها وسيلة لقياس تنكس عصبي في الدماغ من ذبابة الفاكهة. في حين أساليب أخرى، مثل عد نوع خلية معينة، ويمكن استخدامها لتحديد التنكس العصبي، والاستفادة من هذه الطريقة هو أنه يمكن تطبيقها بشكل عام. عد الخلايا يتطلب أن هذه الخلايا يمكن التعرف بشكل موثوق سواء باستخدام الأجسام المضادة المحددة أو التعبير عن علامة خلية محددة، وهي ليست متوفرة دائما. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن نتائج مختلفة بشكل كبير ويمكن الحصول مع هذا الأسلوب ^24، ويفترض نظرا للظروف تستخدم لوضع العلامات وللكشف. طريقة أخرى للكشف عن خلايا التردي هو استخدام علامات موت الخلايا، مثل معاداة تفعيل كاسباس 3. ومع ذلك، وهذا يحدد فقط الخلايا التي تمر بنشاط موت الخلايا ومرة ​​واحدة لقوا حتفهم الخلايا، وأنها لم تعد للكشف. ميزة أخرى للطريقة المقترحة هنا هي أن هناك حاجة إلى تلطيخ بسبب autofluorescence الناجمة عن الصباغ العين، مما يوفر الوقت ويقلل من القطع الأثرية التي تسببها التغيرات في الظروف تلطيخ. ومن المهم أن نلاحظ أنه عند استخدام هذه الطريقة، وعيون الذباب "لديها ما يكفي من الصباغ وصمة عار على الشرائح. إذا كان لون العين خفيفة جدا، مضيفا ان بعض من النوع البري يطير إلى طوق سيكون من المستحسن لضمان كافية، وحتى تلطيخ عبر الشريحة. ميزة إضافية لهذه الطريقة هي أن مجالات متعددة يمكن فحصه، حتى في نفس الرأس. على الرغم من أننا لا يمكن أن تظهر البيانات، وقد استخدمنا هذه الأقسام لدراسة التنكس العصبي في فقدان الخلية الشبكية والدبقية في القشرة الصفيحة ^30،36. كما هو موضح هنا، وهذه الطريقة توفر أقسام أفقية، ولكن من خلال تحويل كتلة البارافين بنسبة 90 درجة عند ذوبان وضعها على حامل كائن، يمكن للمرء أيضا الحصول على المقاطع الأمامية. وهكذا، وهذا الأسلوب هو إجراء متعدد الاستعمالات التي تسمح لقياس سرعة وكفاءة من التنكس العصبي في الدماغ ذبابة. لأن تشكيل بطالةوقد لوحظ uoles في العديد من النماذج الطيران من أمراض الاعصاب الإنسان، بما في ذلك نماذج لميلادي، PD، التصلب الجانبي الضموري (ALS)، والأمراض التي تسببها polyglutamine-يكرر ^16،37-40، وهذه الطريقة يمكن استخدامها لقياس الظواهر العصبية في مجموعة متنوعة من نماذج المرض.

وعموما، هذا البروتوكول هو بسيط والانتهاء بسهولة مرة واحدة ويتم الإعداد الأولي للمعدات خارج. بعض الملاحظات أن نأخذ في الاعتبار هي لآخر بعناية يغسل الايثانول لتجنب الإفراط في جفاف رؤساء لتقليم بعناية كتل البارافين حتى لا تفقد أقسام أو رؤساء، وعدم overexpand الشريط على الماء عند الشريحة على كتلة الحرارة. إذا سمح الشريط لتوسيع بعيدا جدا، وتمزيق لرؤساء الطيران يمكن أن يؤدي وترتيب رؤوس في الشريط يمكن أن تضيع. وبالإضافة إلى ذلك، التعامي عن التركيب الوراثي أثناء القيام بتحليلات لا بد من تجنب التحيز. وأفضل طريقة لتحقيق ذلك من خلال وجود شخص واحد إعداد سليقصر وحفظ السجلات بينما شخص آخر يأخذ الصور والقيام القياسات. واحد من أوجه القصور في هذه الطريقة هو أن انحطاط سوى عدد قليل من الخلايا سيكون من الصعب جدا اكتشاف. في هذه الحالة، سيكون وصمة عار محددة من السكان خلية تتأثر يكون أكثر إفادة. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يسمح أحد للتمييز بين أنواع مختلفة من موت الخلايا، الأمر الذي يتطلب أساليب أكثر تحديدا، مثل تلطيخ النفق لتحديد أفكارك موت الخلية. وأخيرا، وهذه الطريقة لا يمكن التفريق بين موت الخلايا وانحطاط محور عصبي، والتي ستكون أيضا كشفها كما فجوات في neuropil.

كما هو مبين في نتائجنا، وهذه الطريقة يمكن استخدامها لمعالجة ضمور في مناطق محددة في الدماغ أو في الدماغ بأكمله. في تجربتنا، فمن المفيد تحليل فقط منطقة معينة عندما النمط الظاهري هو قوي جدا، حتى عندما تتأثر جميع مناطق الدماغ. وهذا يقلل إلى حد كبير من عبء العمل ولا يؤثر علىالنتيجة. قمنا بتحليل أصلا عدة مناطق في متحولة SWS ولاحظ النتائج متشابهة جدا في تطور النمط الظاهري عند المقارنة بين منطقة واحدة فقط وعند تحليل جميع المجالات (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المنطقة بشكل واضح للتعريف ينبغي اختيار لتجنب القطع الأثرية ويرجع ذلك إلى تحليل مختلف المجالات أو المناطق على مختلف المستويات.

في المقابل، في الحالات التي يكون فيها النمط الظاهري معتدل نسبيا، فمن الأفضل لتحليل الدماغ بأكمله، لأن احتمال العثور على فجوات في منطقة محددة منخفضة. على سبيل المثال، وهذا هو الحال عند تحديد التنكس العصبي المرتبط بالعمر، كما هو مبين في الشكل (3)، والذي ينتج فقط 4 - 5 فجوات في الدماغ بأكمله في الذباب القديمة لمدة 60 يوما. عندما عد فجوات في الدماغ بأكمله، على المرء أن يأخذ في الاعتبار أن فجوات صغيرة سوف تظهر فقط في قسم واحد، في حين أن أكبر منها سوف تمتد إلى عدة أقسام. فيما يخص الشرق الأوسط، وعلى مقربة من صفةأقسام acent عند استخدام هذه الطريقة (الشكل 1) توفر ميزة أخرى، لأنه من السهل نسبيا لتحديد ما إذا كان نفس فجوة موجودة في عدة أقسام.

في الختام، يمكن هذا البروتوكول يكون مفيدا لدراسة العديد من النماذج ذبابة الفاكهة من الأمراض العصبية المختلفة. تحديد البروتينات التفاعل أن تحسين أو تفاقم النمط الظاهري التنكسية يمكن تقديم رؤى حاسمة حول الآليات الكامنة التي تسبب أو تعديل أمراض مثل الزهايمر والشلل الرعاش. في هذا المنشور، ونحن نستخدم هذه الطريقة للكشف عن انحطاط يكون تقدميا، حيث تتطور الحيوانات عادة ولكن تبين زيادة انحطاط أثناء الشيخوخة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف هذه الطريقة لتحديد انحطاط التي يسببها العيوب التنموية، التي ينبغي أن تكون موجودة بالفعل في الذباب eclosed حديثا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500