Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Масса гистологии к Количественно нейродегенерации Published: December 15, 2016 doi: 10.3791/54809
Automatic Translation
1, 1
1Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

Summary

Drosophila широко используется в качестве модельной системы для изучения нейродегенерации. Этот протокол описывает метод, с помощью которого вырождение, как определено образованием вакуолей в головном мозге, могут быть определены количественно. Это также сводит к минимуму эффекты, связанные с экспериментальной процедуры по обработке и секционирования контрольных и экспериментальных мух в качестве одного образца.

Abstract

Прогрессивные нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD) или болезнь Паркинсона (БП) создает все большую угрозу для здоровья людей во всем мире. Хотя модели млекопитающих предоставили важную информацию о механизмах, лежащих в основе патогенности, сложность систем млекопитающих вместе с их высокой стоимости ограничивают их использование. Таким образом, простой , но хорошо создана модель Drosophila-система представляет собой альтернативу для исследования молекулярных путей, которые страдают при этих заболеваниях. Помимо нарушений поведения, нейродегенеративные заболевания характеризуются гистологические фенотипы, такие как гибель нейронов и аксонопатии. Для количественной оценки дегенерацию нейронов и определить, как он влияет на генетических и экологических факторов, мы используем гистологический подход, который основан на измерении вакуоли в мозге взрослых мух. Чтобы свести к минимуму влияние систематических ошибок и непосредственно сравнивать разделы из-под контроля и ехрerimental мух в одном препарате, мы используем метод «воротник» для парафиновых срезов. Нейродегенерации затем оценивали путем измерения размера и / или количества вакуолей, которые развились в летучей мозге. Это может быть сделано путем сосредоточения внимания на конкретной области, представляющей интерес, или анализируя весь мозг путем получения серийных срезов, которые охватывают полную голову. Таким образом, этот метод позволяет измерять не только тяжелой дегенерации, но и относительно умеренные фенотипы, которые могут быть обнаружены только в нескольких секциях, как это происходит во время нормального старения.

Introduction

В связи с увеличением продолжительности жизни, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона стала растущая угрозу для здоровья населения в целом. По данным Национального института здравоохранения, 115 миллионов человек во всем мире, согласно прогнозам, будут затронуты слабоумия в 2050 году Несмотря на значительный прогресс был достигнут в идентификации генов и факторов риска, связанных с по крайней мере, некоторые из этих заболеваний, для многих из них, лежащие в основе молекулярные механизмы до сих пор неизвестны или не очень хорошо понял.

Простые беспозвоночные модельные организмы , как Caenorhabditis Элеганс и дрозофилы предлагают множество экспериментальных преимуществ для изучения механизмов нейродегенеративных заболеваний, в том числе за короткий жизненный цикл, большое количество потомства, а также наличие устоявшихся , а иногда и уникальных генетических и молекулярных методов 1 -12. Кроме того, эти организмы поддаются несмещеннойЭкраны взаимодействия, которые могут идентифицировать факторы, способствующие этим заболеваниям их отягчающих или улучшающее воздействие на нейродегенеративных фенотипов.

Анализ таких генетических взаимодействий и оценки эффектов старения требует количественных протоколов для обнаружения нейродегенера- и измерить его тяжесть. Эта оценка может быть сделано относительно легко при измерении поведенческих аспектов в дрозофилы, такие как обучение, обонятельной отрицательные geotaxis, или быстрой фототаксиса, которые обеспечивают числовое значение производительности 13-21. Кроме того, можно определить влияние на выживание нейронов путем подсчета нейронов. Тем не менее, это возможно только при фокусировке на конкретной группе населения, которая четко определить, как дофаминергические нейроны, которые затронуты в ПД, и даже тогда, результаты были противоречивыми 22-24.

Протокол, описанный здесь используется метод воротник для выполнения парафиновые серийных срезов, методкоторый был первоначально разработан Гейзенберга и Böhl, которые использовали его для выделения анатомическими мутантов мозга у дрозофилы 25. Использование метода воротниковой впоследствии был адаптирован, в том числе в криосрезах, vibratome секции и пластмассовых секций 26-28. Здесь этот метод используется для получения последовательных секций всей головы летучей, который затем может быть использован для измерения вакуоли , которые развиваются у мух с нейродегенеративными фенотипов 16,21,29-32. Эти измерения можно сделать в определенных областях мозга, или может покрывать весь мозг; последний подход позволяет выявить даже слабые дегенеративные фенотип, как это наблюдалось во время старения. И, наконец, при использовании воротники, до 20 мух могут быть обработаны, как один препарат, который не только занимает меньше времени, но также позволяет проводить анализ контрольных и экспериментальных мух в том же препарате, сводя к минимуму артефактов из-за небольших изменений подготовка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Фиксация головы на воротники и вложении в парафиновые

Примечание: Все шаги в процессе фиксации должно быть сделано в вытяжном шкафу. Метилбензойной, а не создает опасности для здоровья, имеет весьма отчетливый запах, который может быть подавляющим, если не обрабатывается в вытяжном шкафу.

  1. Перед тем как обезболивающее мух, составляют 50 мл раствора Карнуа добавлением 15 мл хлороформа и 5 мл ледяной уксусной кислоты к 30 мл 99% этанола (не смешивают хлороформ и уксусную кислоту). Налейте его в стеклянную емкость с плоским дном, такой как crystalizing блюдо, чтобы гарантировать, что воротники могут лежать и полностью покрыты раствором.
  2. Обезболить мух CO 2 или эфиром.
  3. мухи темы (до 20 с большинством воротников) их шеи в воротники с помощью щипцов. Не забудьте выровнять все главы в той же ориентации, как показано на рисунке 1А, и быть нежным , чтобы гарантировать , что никаких повреждений не происходит в голове или в глаза.
  4. Включите синусоидальные oculis мух (стрелки, рис 1А) в случайных позициях , так что порядок мух могут быть легко определены в секциях. Кроме того, если экспериментальные мухи имеют легкий или белый цвет глаз, нить некоторые красные глаза мух, таких, как дикого типа, между ними, чтобы гарантировать, что достаточное количество пигмента присутствует для окрашивания слайд. Запишите порядок мух на листе протокола вместе с номером воротниковой при использовании более одного воротник.
  5. После того, как воротник был закончен, поместите его в приготовленный раствор Карнуа в течение 3,5 - 4 ч.
  6. Дамп решение Carnoy в соответствующий канистры утилизации и начать промывок этанол. Убедитесь в том, чтобы вылить медленно, чтобы не мешать размещение воротников в контейнере.
  7. Вымойте воротники в течение 30 мин в 99% этанола в два раза.
  8. Промыть воротники в 100% этаноле в течение 1 ч. Обязательно изменить промывок вовремя, чтобы предотвратить overdehydration.
  9. Поместите борты в метилбензоатаO / N при комнатной температуре. Уплотнение контейнера с парафином, чтобы предотвратить испарение метилбензойной кислоты.
  10. Налейте methylbenozate в соответствующую одноразовой емкости в вытяжном шкафу. Добавление предварительно приготовленной смеси 1: 1 с низкой температурой плавления (56 - 57 ° C), парафин и метилбензойной кислоты. С этого момента, воротники должны храниться в термостате при 65 ° С, чтобы убедиться, что парафин не затвердеет.
  11. Слить methylbenozate и парафиновой смеси в надлежащей одноразовой емкости, и заливают расплавленный чистый парафин, выдерживают при температуре 65 ° С, на ободков.
  12. Изменение парафина через 30 мин и повторить это по крайней мере в 5 раз. По крайней мере, на 6 - 8 промывок должны быть выполнены.
  13. После завершения промывки, поместите воротники в резиновый лоток для льда с прорезями примерно размером воротников. Залить расплавленным парафином над ними до тех пор, пока полностью покрыты и дайте ему затвердеть O / N (старайтесь избегать пузырьков воздуха).
  14. Удалите парафиновые блоки содернин воротники из лотка для кубиков льда. Отделить блок парафина от воротника, используя лезвие бритвы, аккуратно разрывая воротник. Главы будут находиться в блоке парафина в то время как тела будут оставаться в воротнике. Блоки могут храниться при комнатной температуре.
  15. Для очистки воротники, замочить их в deparafinization агента при 65 ° С для удаления парафина, чистая с легким промывке, и промойте в этаноле перед повторным использованием.

2. Секционирование и монтаж

  1. Теплый нагревательную плиту до 50 ° C. Поместите держатели объекта (или монтажа металлических блоков) и бритвенных лезвий на тарелку и дайте им прогреться.
  2. В зависимости от желаемой ориентации для секционирования, прикрепить парафиновый блок либо с головками в направлении стороны (для горизонтальных участков) или вверх (для фронтальных срезах) к монтажному блоку нагретую (кратко расплавления блок на стороне контакта). Удалить блок из нагревательной плиты и дайте ему остыть в течение по крайней мере 10 мильN, чтобы гарантировать, что парафин затвердевает достаточно для надлежащего уплотнения на монтажный блок. Хранить ряд головок выровненными параллельно с поверхностью блока в максимально возможной степени, чтобы предотвратить неравномерное секций.
  3. Возьмите лезвие бритвы и обрежьте излишки парафина подальше от мух головок так, что лишь небольшая строка с вложенными головок остается (лезвие бритвы может быть разогрет для облегчения обрезки кромок). Убедитесь в том, чтобы не обрезать слишком много, чтобы парафин не ломается во время секционирования (больше зачистка может быть сделано во время секционирования).
  4. Поместите монтажный блок в держатель объекта микротома и гарантировать, что выравнивание ряда головок в параллель, как можно ближе к кромке лопасти.
  5. Подготовьте предметные стекла микроскопа, покрывая их тонким слоем (PLL) раствор L-лизин-поли и дайте им высохнуть в течение 5 мин. Покройте их с водой непосредственно перед применением.
  6. Вырезать 7 мкм секций и перенесите ленту секций к каретке, плавающего на воде. <бр /> Примечание: Чтобы получить весь мозг для горизонтальных сечений, мы собираем ленту с момента, когда начинают врезаться в глаза, пока головка не была полностью разорвана (вырезка из хоботка в мозг). Более чем один слайд может понадобиться для всей головы.
  7. Поместите предметное стекло на нагревательной пластине при 37 ° С и позволяют ленты расширяться в течение примерно 1 мин.
  8. Удалите излишки воды (путем заливки его или используя ткань) и высушить слайды O / N.
  9. Удалите парафин из слайда путем размещения слайдов в высоком вертикальном слайд-окрашивания банку, заполненную deparafinization агентом (полностью покрывающей секции). Выполните 3 стирок 30 мин - 60 мин каждый.
  10. Удалить слайд из окончательной промывки. Поместите 2 капли вложения средств массовой информации на слайде и покрыть ее с большим покровным.

3. Фотографирование и анализируя разделы

  1. Разрешить подготовленные слайды высохнуть в течение 1 - 2 дней. Затем, осмотрите их на флуоресцентном microscОПЕ под голубым светом.
  2. Используйте меньшее увеличение, чтобы определить ориентацию мух и найти интересующую область, если сосредоточив внимание на конкретном регионе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для SWS мух (рисунок 2), находим раздел , который содержит большой спайки и сделайте снимок (обычно при 40 - кратном увеличении). При анализе весь мозг (как показано на рисунке 3), мы пролистать все разделы из головы и либо сфотографировать участок с наиболее тяжелой фенотип или всех секций , которые показывают вакуоли.
  3. Для двойного слепого анализа, взять и номер изображения, не зная генотип и записать номер воротник и положение головы в строке, чтобы идентифицировать их позже.
  4. После того, как изображения были взяты, анализировать их с помощью программного обеспечения визуализации.
  5. Подсчитайте количество вакуолей в секции или на голове. Для измерения размера вакуоли, открыть изображения в программе и выбрать вакуоли с выбором слишкомл. Определить количество пикселей в выбранных вакуолей.
  6. Для преобразования в 2 мкм, сфотографируйте стадии калибровки микрометра слайда при увеличении используемого для получения фотографий. Определить количество пикселей в 100 мкм 2 , чтобы вычислить коэффициент пересчета.
  7. Преобразование общее количество пикселов в мкм 2 путем деления числа пикселей на коэффициент пересчета , рассчитанного на предыдущей стадии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью описанных результатов методов в серийных срезов , окрашенных пигментом глаз 33 , которая охватывала всю голову мухи. Часть этого показан на рисунке 1В, где участки от индивидуальной головки показаны сверху вниз. Секции из разных мух рассматриваются слева направо в этом примере. Для облегчения ориентации и идентификации мух, безглазым муха (синусоидальный oculis) вставляется в качестве маркера в положении 3 (стрелка, рис 1B).

Для количественной оценки нейродегенерации, измерять образование вакуолей, которые могут быть обнаружены в этих секциях. Вакуоли определяются как круглые, темные пятна , которые находятся в пределах зеленого флуоресцентного нейропиля (размерные стрелки на рисунке 2 и 3) или кора головного мозга и которые видны по крайней мере 2 последовательных участков мозга мухи. Количественная нейродегенера- поизмерительные вакуоли могут быть либо сделано путем сосредоточения внимания на конкретном регионе мозга или анализируя весь мозг. Ограничение анализа к конкретной области мозга полезно в тех случаях , когда мутация влияет только на определенную область, как и обонятельных долей в futsch 'ОЛК мутанта 34, но он также может быть использован , когда есть тяжелая дегенерация во всех или многих области мозга. Примером последнего является швейцарский сыр (SWS) мутант (рисунок 2), где все измерения вакуоли было бы слишком много времени. Поэтому мы взяли только одно изображение и, чтобы гарантировать , что измерения всегда делается на том же уровне, мы взяли все изображения на уровне великого спайки (дс, рис 2А), которое содержится только в одном или двух секций. В то время как мы не обнаружили вакуоли образование в 1 мух 1-дневных SWS "(данные не показан), с потерей функции аллель 35, некоторые вакуоли были обнаружены я1 мух N 7-дневных SWS '(наконечники стрел, Рисунок 2А). Старение мух до 14 г (рис 2В) и 21 г (рис 2С) дополнительно увеличил этот фенотип, показывая его прогрессивный характер. Подсчет количества вакуолей в deutocerebral нейропиля (Dn) с использованием описанного способа подтвердили значительное увеличение числа вакуолей с возрастом. Кроме того , суммарная площадь охватывается вакуолей была значительно увеличена со старением (рис 2D).

Однако, не все мутанты обнаруживают такой тяжелый фенотип как РКС, а также в тех случаях, различия в перерождения трудно определить , когда фокусировка на небольшом участке. Точно так же, вырождение , которое происходит в процессе старения достаточно мягкая (рис 3A - C) и , следовательно, мы проанализировали весь мозг при количественной оценке этот фенотип. Определение суммы всех вакуолей в мозге выявленозначительное увеличение с возрастом, и это было также случай , когда измерения суммарная площадь этих вакуолей (рис 3D).

Рисунок 1
Рисунок 1. Парафин Серийные срезы. А) С помощью метода петелька, экспериментальных и контрольных мух могут быть обработаны в качестве одного образца путем закручиванием их на один воротник. Безглазое синус oculis мухи вставляются для ориентирования (стрелки). Б) Схематическое изображение ориентации Мухи головок в воротнике. C) На этом снимке, секции из разных головок муха ориентированы слева направо , на слайде. Сверху вниз на слайде, последовательные секции из той же головы мухи можно увидеть. В этом случае синусоидальной oculis Муха был вставлен в положении три (стрелка). Срезы окрашивали с помощью флуоресцентного пигмента глаз, который омывает над секции после резки. Шкала бар A = 5 мм и С = 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Прогрессивное нейродегенерации в швейцарском сырной мутанта. Парафин головной секции с 7-дня- (А), 14-день- (В) и 21-дня- (C) старый SWS '1 летает. Стрелки указывают на вакуолей, которые развились со старением. Дегенерация связанная с возрастом количественно путем подсчета количества вакуолей и измеряя их общую площадь (D). СЭМ и число анализируемых мух указывается. Шкала бар = 25 мкм. *** Р <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. нейродегенерации происходит с возрастом. Парафин головной секции с 10-дня- (А), 30-день- (B) и 60-дня- (С) старых мух дикого типа. Стрелки указывают на вакуолей, которые развились в возрасте от мух. Дегенерация связанная с возрастом количественно путем подсчета количества вакуолей и измеряя их общую площадь (D). СЭМ и число анализируемых мух указывается. Шкала бар = 25 мкм. *** Р <0,001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </ А>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный способ обеспечивает средство для количественной оценки нейродегенерации в мозге дрозофилы. В то время как другие методы, такие как подсчет определенного типа клеток, может быть использован для идентификации нейродегенерации, преимущество этого способа состоит в том, что он может быть применен в более общем смысле. Подсчет клеток требует, чтобы эти клетки могут быть надежно идентифицированы с использованием либо специфических антител или экспрессию клеточного специфического маркера, который не всегда доступен. Кроме того, было показано , что существенно разные результаты могут быть получены с этим методом 24, по- видимому из - за условий , используемых для маркировки и для обнаружения. Другой метод обнаружения дегенерирующем клеток является использование маркеров клеточной гибели, как анти-активированный каспазы 3. Тем не менее, это только идентифицирует клетки активно претерпевают гибель клеток и как только клетки умерли, они больше не обнаруживаются. Другим преимуществом предложенного метода является то, что нет окрашивания не требуется в связи с autofluценции вызвано пигментом глаз, что позволяет экономить время и сводит к минимуму артефакты, вызванные изменениями условий окраски. Важно отметить, что при использовании этого метода, глаза мух "имеют достаточно пигмента для окрашивания слайд. Если цвет глаз слишком светлый, добавив некоторые дикого типа летит к ошейнику бы целесообразно, чтобы обеспечить достаточное и даже окрашивания по стеклу. Дополнительным преимуществом этого метода является то, что несколько областей могут быть изучены, даже в той же голове. Несмотря на то, что мы не показываем данные, мы использовали эти разделы для изучения нейродегенера- в гибели клеток сетчатки и глии в коре пластинки 30,36. Как описано здесь, этот метод обеспечивает горизонтальные участки, но при повороте парафиновый блок на 90 ° при плавлении его на держатель объекта, можно также получить фронтальных срезах. Таким образом, этот метод является универсальным процедура, которая позволяет своевременно и эффективно измерения нейродегенерации в летучей мозга. Поскольку формирование ВПТuoles наблюдается во многих моделях мух нейродегенеративных заболеваний человека, в том числе моделей AD, PD, боковой амиотрофический склероз (БАС), а также заболевания , вызванные полиглутаминовых-повторами 16,37-40, этот метод может быть использован для количественного нейродегенеративных фенотип в разнообразие моделей заболеваний.

В целом, этот протокол является простым и легко завершается после первоначальной установки оборудования осуществляется. Некоторые примечания, чтобы иметь в виду, должны тщательно раз, когда промывок этанол, чтобы избежать чрезмерного обезвоживания головы, тщательно обрезать парафиновые блоки таким образом, чтобы не потерять секций или головы, и не overexpand ленту на воде, когда слайд на тепловом блоке. Если лента позволило расширить слишком далеко, разрывая Мухи головок может привести и порядок глав в ленте могут быть потеряны. Кроме того, будучи слепым к генотипу, делая анализы необходимо избегать предвзятости. Это лучше всего достигается за счет одного человека подготовке технологии SLIдез и ведение записей в то время как другой человек принимает фотографии и делать измерения. Одним из недостатков этого метода является то, что вырождение лишь несколько клеток будет очень трудно обнаружить. В этом случае конкретная окраска пораженной клеточной популяцией, было бы более информативным. Кроме того, этот метод не дает возможности проводить различие между разными видами гибели клеток, что требует более специфических методов, таких как TUNEL окрашивания для определения апоптотической гибели клеток. И, наконец, этот метод не может дифференцировать между смертью клеток и дегенерации аксонов, что также будет обнаружить, как вакуолей в нейропиля.

Как показано в результатах, этот метод может быть использован для решения вырождение в определенных областях мозга, или во всем головном мозге. По нашему опыту, полезно анализировать только определенную область, когда фенотип достаточно сильна, даже тогда, когда все области мозга пострадавших. Это значительно снижает рабочую нагрузку и не влияет нарезультат. Сначала мы проанализировали несколько областей , в SWS мутанта и наблюдали очень близкие результаты в прогрессии фенотипа при сравнении только в одной области , и при анализе всех областей (данные не показаны). Тем не менее, следует отметить, что четко идентифицирующая область должна быть выбрана, чтобы избежать артефактов из-анализа различных областей или областей, на разных уровнях.

В отличие от этого, в случаях, когда фенотип относительно мягким, то лучше анализировать весь мозг, так как вероятность нахождения вакуолей в конкретном регионе является низким. Например, это имеет место при определении возрастной нейродегенерации, как показано на рисунке 3, что приводит только 4 - 5 вакуолей во всем головном мозге в 60-дневных мух. При подсчете вакуолей во всем мозге, необходимо учитывать, что небольшие вакуоли будут отображаться только в одной секции, в то время как более крупные из них будут распространяться на несколько разделов. Что касается последнего, непосредственная близость прилacent секции при использовании этого метода (Рисунок 1) дает еще одно преимущество, потому что это относительно легко определить, присутствует ли в нескольких секциях то же вакуоли.

В заключение, этот протокол может оказаться полезной для изучения многих моделей Drosophila различных нейродегенеративных заболеваний. Идентификация взаимодействующих белков, которые улучшают или ухудшают дегенеративный фенотип может дать важные идеи о механизмах, лежащих, которые вызывают или модифицируют заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. В этой публикации, мы используем этот метод для выявления дегенерации, что является прогрессивным, где животные развиваются нормально, но показывают увеличение вырождение в процессе старения. Кроме того, этот способ может быть также выполнен с возможностью определения дегенерации, которая вызвана дефектами развития, которые должны уже присутствовать в недавно eclosed мух.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Tags

Neuroscience выпуск 118 нейробиологии дегенеративные заболевания вакуоли гистологии парафиновые срезы, Для взрослых нервной системы
Масса гистологии к Количественно нейродегенерации<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D.… More

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter