Summary
ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。
Abstract
アルツハイマー病（AD）またはパーキンソン病（PD）などの進行性神経変性疾患は、世界中のヒトの健康に増加脅威です。哺乳動物のモデルは病原性の基礎となるメカニズムに重要な洞察を提供してきたが、一緒に高コストの哺乳動物系の複雑さは、その使用を制限しています。したがって、シンプルだが十分に確立されたショウジョウバエモデル・システムは、これらの疾患に影響される分子経路を調査するための代替手段を提供します。行動障害のほか、神経変性疾患は、神経細胞死と軸索障害などの組織学的表現型によって特徴付けられます。神経変性を定量化するために、それが遺伝的要因と環境要因によって影響される方法を決定するために、我々は大人のハエの脳内の空胞を測定することに基づいている組織学的アプローチを使用しています。系統誤差の影響を最小限に抑えるために、直接制御とEXPからの切片を比較します1つの製剤でerimentalハエは、我々はパラフィン切片のための「カラー」メソッドを使用します。神経変性は、その後、ハエの脳に開発した空胞のサイズ及び/又は数を測定することによって評価されます。これは、いずれかの特定の関心領域に焦点を合わせることによって、または完全長に及ぶ連続切片を得ることにより脳全体を分析することによって行うことができます。通常の老化時に起こるようなので、この方法は、1が厳しい変性だけでなく、いくつかのセクションにのみ検出され、比較的穏やかな表現型だけでなく、を測定することができます。
Introduction
平均余命の増加に伴い、アルツハイマー病やパーキンソンなどの神経変性疾患は、一般人口の増大する健康への脅威となっています。国立衛生研究所によると、115万人が世界中で、基礎となる重要な進歩は、それらの多くは、これらの疾患のうちの少なくともいくつかに関与する遺伝子および危険因子を同定することにしたが2050年に認知症により影響を受けると予測されます分子メカニズムはまだ不明かよく理解しています。
線虫（Caenorhabditis elegans）およびキイロショウジョウバエのような単純な無脊椎動物のモデル生物は、短いライフサイクル、子孫の数が多いと、十分に確立し、時にはユニークな遺伝的および分子的方法1の可用性を含む神経変性疾患のメカニズムを研究するための実験種々の利点を提供しています-12。さらに、これらの生物は、公平に適しています神経変性の表現型に対するそれらの悪化または改善効果によって、これらの疾患の要因を特定することができる相互作用の画面。
そのような遺伝的相互作用を分析し、高齢化の影響を評価することは神経変性を検出するために、その重症度を測定するための定量的なプロトコルが必要です。数値性能値13から21を提供するような嗅覚学習、負の走地性、または高速走光性ショウジョウバエにおける行動の側面を、測定するときにこの評価は、比較的容易に行うことができます。ニューロンを計数することによりニューロンの生存に対する効果を決定することも可能です。 PDに影響されるドーパミン作動性ニューロンのように、明確に識別可能である特定の集団に着目した場合ただし、これは可能であり、その後も、結果は22-24議論されています。
ここで説明するプロトコルは、パラフィン連続切片を実行するために、カラー方式を使用して、方法それは、もともとショウジョウバエ 25に解剖学的脳の突然変異体を単離するためにそれを使用しハイゼンベルクとBöhl、によって開発されました。カラー方法の使用は、その後凍結切片、ビブラトーム切片及びプラスチックセクション26-28に含むように適合されています。ここでは、この方法は、次に、神経変性表現型16,21,29-32とハエに開発空胞を測定することができる全体フライヘッドの連続切片を得るために使用されます。これらの測定は、特定の脳領域で行うことができ、または脳全体を覆うことができます。後者のアプローチは、老化中に観察されたように、1つは、弱い変性表現型を識別することができます。最後に、20ハエまで、カラーを使用している場合だけでなく、より少ない時間がかかるだけでなく、原因のわずかな変化にアーティファクトを最小化する、同じ製剤中に対照および実験ハエの分析を可能にする1つの製剤として処理することができます準備。
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Protocol
1.首輪にヘッドを固定し、パラフィンに埋め込み
注：固定プロセスの手順はすべて、ドラフト内で行う必要があります。安息香酸メチルは、健康上のリスクをもたらすものではないが、ドラフト内で処理されない場合は圧倒的なことができ非常に明確な臭気を持っています。
- ハエを麻酔する前に、（クロロホルム及び酢酸を混在させないでください）99％エタノール30 mLに氷酢酸のクロロホルム5mLを15mLのを追加することにより、カルノア液の50ミリリットルを構成しています。カラーは平らでき、完全に解決策で覆われていることを確実にするために、このようなcrystalizing皿のように、平らな底部を有するガラス容器にそれを注ぎます。
- CO 2またはエーテルでハエを麻酔。
- スレッドは、ピンセットを用いてカラーに首によって（ほとんどの襟付き20まで）飛びます。 図1Aに見られるように、同じ方向に頭の全てを合わせ、損傷が頭や目に発生しないことを確実にするために穏やかであることを忘れないでください。
- ハエの順序を容易セクションで識別できるように、ランダムな位置での正弦oculisハエ （矢印、 図1A）を含みます。また、場合実験ハエが十分な顔料は、スライドを染色するために存在することを確認するために、それらの間のような野生型のようないくつかの赤い目ハエを、スレッド、光や白の目の色を持っています。複数のカラーを使用した場合はカラー番号とともにプロトコルシートにハエの順序を記録します。
- 4時間 - 襟が終了した後、3.5用に準備カルノア液に入れてください。
- 適切な処分キャニスターにカルノア液をダンプし、エタノール洗浄を開始します。コンテナ内のカラーの配置を乱さないようにゆっくりと注ぐようにしてください。
- 二度99％のエタノール中で30分間のカラーを洗ってください。
- 1時間100％エタノール中でカラーを洗ってください。 overdehydrationを防ぐために、時間に洗浄液を必ず変更してください。
- 安息香酸メチルにカラーを入れてO / RTでN。安息香酸メチルの蒸発を防ぐためにパラフィルムで容器を密閉します。
- ヒュームフード内で適切な使い捨て容器にmethylbenozateを注ぎます。 （ - 57°C 56）パラフィンワックス、メチルベンゾ1低融点：1の以前に調製された混合物を追加します。この時点から、カラーはパラフィンが硬化しないことを確認するために、65℃のインキュベーター内に保持する必要があります。
- 適切な使い捨て容器にmethylbenozateとパラフィンの混合物を注ぐ、溶融純粋パラフィンワックスを注ぐ、カラーの上に、65℃に保ちました。
- 30分後にパラフィンを変更し、この少なくとも5回繰り返します。少なくとも6から8回の洗浄を実施すべきです。
- 洗浄が完了すると、約スロット襟の大きさのゴムアイスキューブトレイにカラーを配置します。完全に覆われるまで、それらの上に溶融パラフィンを注ぎ、それがO / N（気泡を回避しよう）を硬化することを可能にします。
- パラフィンブロックcontaiを削除します寧アイスキューブトレイからカラー。そっと襟を折っ、カミソリの刃を使用して、襟からパラフィンブロックを区切ります。体が襟にとどまる一方でヘッドがパラフィンブロックになります。ブロックを室温で維持することができます。
- 首輪をきれいにするには、光洗浄できれいにパラフィンを、削除し、再利用する前にエタノールで洗浄するために65℃でdeparafinization剤でそれらを浸します。
2.セクショニングと取り付け
- 50℃に加熱プレートを温めます。プレート上のオブジェクトの所有者（または金属マウントブロック）とかみそりの刃を配置し、それらをウォームアップしましょう。
- （簡潔に接触側のブロックを溶融）加熱された取り付けブロックに（正面セクションに対して）切片のための所望の向きに応じて、（水平部のため）のいずれかの側に向かってヘッドをパラフィンブロックを添付したり、上向きに。加熱プレートからブロックを削除し、それは少なくとも10マイルのために冷却することができますパラフィンは、取り付けブロックの上に適切なシールのために十分に硬化されることを保証するn個。不均一なセクションを防ぐために、できるだけ多くのブロックの表面に平行に整列ヘッドの行を保管してください。
- カミソリの刃を取り、埋め込まれた頭を持つ唯一の小さな行が残るように離れてハエの頭から余分なパラフィンをトリム（かみそりの刃は簡単にトリミングのためにウォームアップすることができます）。パラフィンは、（切片中に行うことができ、よりトリミング）を切片中に破損しないようにあまりにも多くをトリミングすることがないことを確認してください。
- ミクロトームのオブジェクトホルダーに取り付けブロックを配置し、ヘッドの列の整列は、ブレードのエッジにできるだけ平行であることを確認してください。
- ポリ-L-リジン（PLL）溶液の薄い層で覆うことにより、顕微鏡スライドを調製し、5分間、それらを乾燥させます。使用直前に水でそれらをカバーしています。
- 7μmのセクションをカットし、水に浮かぶスライドにセクションのリボンを転送します。<BR />注：水平方向のセクションの脳全体を得るために、我々は、（脳に口吻から切断）ヘッドが完全に切断されるまで目にカットし始めたときから、リボンを集めます。複数のスライドは、ヘッド全体のために必要とされてもよいです。
- 37℃の熱板上でスライドを置き、リボンが約1分間拡大することができます。
- （それを注ぐまたは組織を使用して）過剰の水を除去し、スライドO / Nを乾燥させます。
- （完全にセクションをカバーする）deparafinization剤が充填された背の高い、縦スライド染色ジャーにスライドを配置することによって、スライドからパラフィンワックスを除去します。 60分ごと - 30分の3回の洗浄を行います。
- 最終洗浄からスライドを削除してください。スライドに埋め込むメディアの2滴を置き、大きなカバースリップでそれをカバーしています。
3.セクションを撮影し、分析
- 2 D - 準備されたスライドが1のために乾燥することができます。その後、蛍光microscでそれらを調べます青色光下でのOPE。
- ハエの向きを決定するために、特定の地域に焦点を当てた場合に関心領域を見つけるために、低倍率を使用してください。
注：SWSのハエ（ 図2を参照）のために、我々は偉大な交連を含むセクションを見つけて、（通常は40倍の倍率で）画像を取ります。 （ 図3のように）脳全体を分析するとき、私たちは頭からすべてのセクションをスクロールし、いずれかの最も深刻な表現型または液胞を示すすべてのセクションとセクションを撮影します。 - 二重盲検分析のために、取ると数の画像遺伝子型を知らなくても、後でそれらを識別するための行のカラー番号とヘッドの位置を記録します。
- 画像が撮影されると、画像処理ソフトウェアを使用して分析します。
- セクションごとや頭あたりの空胞の数をカウントします。 、液胞のサイズを測定するソフトウェアプログラムで画像を開いて、あまりにも選択で空胞を選択するにはリットル。選択された空胞内のピクセルの量を決定します。
- μmの2への変換のために、写真を取得するために使用される倍率でステージマイクロメータ用較正スライドの写真を撮ります。変換係数を計算するためには100μm2のピクセルの量を決定します。
- 上記のステップで算出された変換係数によって画素数を割ることによってミクロン2に総画素数を変換します。
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Representative Results
全体フライヘッドを包含する眼の色素33によって染色された連続切片で説明した方法の結果を使用。この部分は、個々のヘッドのセクションが上から下に表示され、図1Bに示されています。別のハエのセクションは、この例では左から右に見られます。配向およびハエの識別を容易にする、アイレスフライ（正弦oculis）が 3位（矢印、 図1B）におけるマーカーとして挿入されています。
神経変性を定量するために、我々は、これらのセクションで検出することができる小胞の形成を測定します。液胞は、ラウンドのように定義され、緑色蛍光神経網内（ 図2の矢頭および3）であるか、または皮質とダークスポットは、ハエの脳の少なくとも2個の連続セクションに表示されます。によって神経変性を定量化測定液胞は、いずれの特定の脳領域に焦点を合わせることによって、または脳全体を分析することによって行うことができます。脳の特定の領域に分析を制限することfutsch 'OLK変異体34における嗅覚ローブのような変異は、特定の領域に影響を与える場合に有用であるが、すべてまたは多数の深刻な変性が存在する場合にも使用することができます脳の領域。後者の例は、すべての空胞を測定することは、あまりにも時間がかかるだろうスイスチーズ（SWS）の変異体（ 図2）、です。したがって、我々は、我々は1つまたは2つのセクションに含まれている偉大な交連（GC、 図2A）、のレベルですべての画像を取り、1つの画像だけを取って、測定値が常に同じレベルで行われたことを確認します。私たちは1日齢SWS」1ハエ（データは示していない）、機能喪失型対立遺伝子35で空胞形成が検出されなかったのに対し、いくつかの空胞は検出私ましたnは7日齢のSWS」1ハエ（矢じり、 図2A）。 14日（ 図2B）、21 D（ 図2C）にハエを老化一層の進行性の性質を示す、この表現型を増加させました。記載された方法を用いてdeutocerebral神経網（DN）で空胞の数を計数すると、年齢との空胞の数の有意な増加を確認しました。また、空胞に包含される合成領域を大幅に老化（ 図2D）で増加しました。
しかしながら、全ての変異体は、SWSのような重度の表現型を示し、これらの場合において、変性の差が小さい領域に着目すると判断することが困難です。同様に、老化の間に生じる変性は、（ 図3A - C）かなりマイルドであり、この表現型を定量化する際に、したがって、我々は、脳全体を分析しました。明らかに脳内のすべての空胞の合計を決定しますこれらの液胞（ 図3D）の合計面積を測定する際に重要な年齢とともに増加し、これもそうでした。
1. パラフィン連続切片を 図 。 A）襟法を用いて、実験群および対照ハエは1襟にそれらをねじ込むことによって一つのサンプルとして処理することができます。アイレス正弦oculisハエは向き（矢印）のために挿入されています。 B）回路図は、カラーでのハエの頭の向きを示します。 C）この画像では、異なるハエの頭からの切片は、スライド上の左から右に配向されています。スライドの上から下へ、同じフライヘッドからの連続切片を見ることができます。この場合、 正弦oculisのフライは、位置3（矢印）に挿入しました。切片をかけて洗う蛍光目の色素で染色されています切断後のセクション。 A = 5ミリメートルおよびC = 0.5ミリメートルでのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
スイスチーズ ミュータント で 2 プログレッシブ神経変性図 。 7-昼（A）、14-昼（B）からのパラフィンヘッド部と21-昼（C）旧SWS '1ハエ。矢じりは、加齢に伴って開発した空胞を指します。加齢関連変性は、空胞の数をカウントし、その合わせた領域（D）を測定することによって定量化されます。 SEM及び分析ハエの数が示されています。 =25μmのスケールバー。 *** P <0.001。csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "ターゲット=" _空白"> この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 神経変性は、加齢に伴って発生します。 10日- （A）、30日- （B）及び60日- （C）齢の野生型ハエからパラフィンヘッド部。矢じりは、高齢のハエに開発した空胞を指します。加齢関連変性は、空胞の数をカウントし、その合わせた領域（D）を測定することによって定量化されます。 SEM及び分析ハエの数が示されています。 =25μmのスケールバー。 *** P <0.001。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 </ A>
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Discussion
記載された方法は、 ショウジョウバエの脳における神経変性を定量化する手段を提供します。他の方法は、特定の細胞型を計数するように、神経変性を同定するために使用することができるが、この方法の利点は、より一般的に適用できることです。細胞を計数することは、これらの細胞が確実に特異的な抗体や、常に利用可能でない細胞特異的マーカーの発現、のいずれかを用いて同定することができることが必要です。さらに、劇的に異なる結果がおそらく標識および検出のために使用される条件に、その方法24を用いて得られることが示されています。変性細胞を検出するための別の方法は、抗活性化カスパーゼ3のような細胞死マーカーの使用は、しかし、これは、積極的に細胞死を受けている細胞を特定していない細胞が死亡していると、それらはもはや検出可能です。ここで提案した方法の別の利点は、染色が原因でautofluに必要とされないことです時間を節約し、染色条件の変化に起因するアーチファクトを最小限に目顔料によって引き起こさorescence。この方法を使用する場合に、ハエの目のスライドを染色するのに十分な顔料を有することに留意することが重要です。目の色が薄すぎる場合は、いくつかの野生型を追加するだけでは十分であっても、スライド全体に染色確保することをお勧めだろうカラーに飛びます。この方法のさらなる利点は、複数の領域があっても、同一のヘッドにおいて、調べることができることです。我々はデータを示していないが、我々はラミナ皮質30,36における網膜やグリア細胞の損失の神経変性を調べるために、これらのセクションを使用しています。ここで説明したように、この方法は、水平セクションを提供するが、物体ホルダの上に溶融したときに90°パラフィンブロックを回転させることによって、1つはまた正面セクションを得ることができます。したがって、この方法は、ハエの脳における神経変性のタイムリーかつ効率的な測定を可能にする多目的な手順です。 VACの形成ので、uolesがADのモデルを含む、人間の神経変性疾患の多くのフライモデルにおいて観察されており、PD、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、およびポリグルタミンリピート16,37-40によって引き起こされる疾患は、この方法は、神経変性表現型を定量化するために使用することができ疾患モデルの様々な。
全体として、このプロトコルは単純で装置の初期設定が行われた後、容易に完了する。心に留めておくべきいくつかの注意事項を慎重に時間エタノール洗浄は、セクションや頭を失うしないように慎重にパラフィンブロックをトリミングする、オーバー脱水ヘッド避けるために、スライドがあると水の上にリボンを過剰に膨らませるしないようにしていますヒートブロック上。リボンはすぎ拡大させた場合、ハエ頭部の引裂きをもたらすことができるリボンにおけるヘッドの順序が失われることができます。また、分析をしている間の遺伝子型に盲目であることはバイアスを避けるために不可欠です。これは最高のSLIを準備する1人を持つことにより達成されますDESと他の人が写真を撮ると、測定を行っている間に、レコードを保持します。この方法の制限の一つは、数個の細胞の変性を検出するのが非常に困難になることです。その場合には、影響を受けた細胞集団の特異的染色は、より有益であろう。また、この方法は、1つは、アポトーシス細胞死を決定するために、そのようなTUNEL染色のようなより具体的な方法を必要とする細胞死の異なる種類を区別することはできません。最後に、この方法はまた、神経網内の液胞として検出されるであろう、細胞死と軸索変性を区別することはできません。
我々の結果に示すように、この方法は、特定の脳領域または脳全体での変性に対処するために使用することができます。我々の経験では、その表現型はすべての脳領域が影響を受ける場合でも、非常に強い場合、特定の領域を分析するのに有用です。これは、大幅に作業負荷を軽減し、影響を与えません結果。我々は当初SWS変異体のいくつかの領域を分析し、1つの領域のみを比較するときの表現型の進行に非常に類似の結果を観察し、すべての領域を分析する場合（データは示さず）。しかし、明確に識別可能な領域は、異なるレベルの異なる領域または領域の分析によるアーチファクトを回避するために選択されるべきであることに留意すべきです。
対照的に、表現型は比較的穏やかである場合には、特定の領域内空胞を見つける可能性が低いため、脳全体を分析することをお勧めします。 60日齢のハエにおける脳全体で5胞 - 加齢に関連する神経変性を決定する際にのみ4の結果、図3に示すように、例えば、これは、そうです。脳全体に空胞をカウントすると、1は大きいものがいくつかのセクションに及ぶであろう一方、小さな空胞のみ、1セクションに表示されますことを考慮する必要があります。 ADJの後者に関しては、近接それは、同じ空胞が複数のセクションに存在するか否かを決定することは比較的容易であるためacentセクションこの方法を用いて（ 図1）は 、別の利点を提供します。
結論として、このプロトコルは、様々な神経変性疾患の多くのショウジョウバエモデルを研究するための有用であることを証明することができます。変性表現型を改善または悪化させる相互作用するタンパク質を同定することは、原因や、アルツハイマー病やパーキンソンなどの疾患を変更根底にある機構についての重要な洞察を提供することができます。この公報では、動物は正常に発育進行性で変性を、検出したが、エージング中に変性を増やす表示するには、このメソッドを使用します。さらに、この方法は、既に新しくeclosedハエで存在すべき発達障害によって引き起こされる変性を決定するように適合させることができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made-to-fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor - Use in fume hood! |
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-Lysine Solution (PLL) | Sigma Life Science | P8290-500 |
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