Introduction
टाइप 1 मधुमेह (T1D) एक autoimmune रोग है कि autoreactive टी कोशिकाओं 1 द्वारा कोशिकाओं β इंसुलिन के उत्पादन आइलेट के विनाश की विशेषता है। T1D के निदान के लिए आम तौर पर एक दुबला, युवा व्यक्ति, जो इंसुलिन की कमी के सबूत के रूप ketoacidosis के साथ उपस्थित हो सकता है में hyperglycemia (रक्त ग्लूकोज> 200 एमजी / डीएल) की माप पर किया जाता है। 2 - (90% 50 से) T1D के निदान के समय में, वहाँ β सेल समारोह और बड़े पैमाने पर की पर्याप्त नुकसान के लिए सबूत है। नैदानिक अध्ययन में, कई प्रतिरक्षा modulatory दवाओं है कि निदान के समय में स्थापित किया गया β सेल समारोह (और शायद मास), लेकिन कोई नहीं के स्थिरीकरण में हुई रोग के नैदानिक छूट में हुई है, एक खोज है कि विकास के लिए कॉल उठाया गया है रोग का पहले पता लगाने के लिए और के लिए बायोमार्कर के संयोजन की प्रभावशीलता के अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग 3,4 उपचार। अंतरराष्ट्रीय भागीदारी के प्रयासों, इस तरह के एकएस हीथ 5 के राष्ट्रीय संस्थानों में मानव आइलेट अनुसंधान नेटवर्क कंसोर्टियम, बायोमार्कर कि β सेल तनाव और T1D में मौत पर ध्यान केंद्रित विकसित करने की आवश्यकता पर बल दिया है।
9 - इन प्रयासों के साथ लाइन में, हमारे समूह और दूसरों को हाल ही में बायोमार्कर assays कि घूम उपाय, epigenetically संशोधित डीएनए टुकड़े कि β कोशिकाओं मर 6 से मुख्य रूप से उठता है विकसित किया है। तिथि करने के लिए प्रकाशित assays के सभी में, ध्यान केंद्रित मानव जीन एन्कोडिंग preproinsulin (आईएनएस) है, जो अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में कोडिंग और प्रमोटर क्षेत्रों में unmethylated सीपीजी साइटों का अधिक से अधिक डिग्री दर्शाता है के quantitation पर दिया गया है। Unmethylated आईएनएस डीएनए टुकड़े की मुक्ति (परिगलित, apoptotic) β कोशिकाओं मरने से मुख्य रूप से उत्पन्न होने के रूप में धारणा थी। हमारे हाल के अध्ययनों से पता चला है जवानी में, स्थिति -69 बीपी पर दोनों unmethylated और मिथाइल आईएनएस डीएनए में उन्नयन (टी के सापेक्ष किवह साइट शुरू Transcriptional) नई शुरुआत T1D में मनाया गया, और साथ में इस आबादी के लिए 6 के रूप में विशिष्ट बायोमार्कर की सेवा की। ये बायोमार्कर assays सीरम या प्लाज्मा वाणिज्यिक स्पिन किट का उपयोग करने से सेल मुक्त डीएनए के अलगाव, पृथक डीएनए के एक bisulfite रूपांतरण के द्वारा पीछा शामिल (uracils करने के लिए गैर methylated cytosines परिवर्तित करने के लिए methylated cytosines बरकरार छोड़कर)।
इस रिपोर्ट में, हम विभिन्न methylated आईएनएस डीएनए के लिए सीरम नमूना संग्रह, सीरम से सेल मुक्त डीएनए, bisulfite रूपांतरण, और छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (इसके बाद, डिजिटल पीसीआर) के प्रदर्शन के अलगाव के तकनीकी पहलुओं का वर्णन है।
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Representative Results
उचित रूप से डेटा की व्याख्या करने के लिए, हम एक डिजिटल पीसीआर समय में दोनों unmethylated और मिथाइल लक्ष्य आईएनएस डीएनए के लिए प्लाज्मिड नियंत्रण का उपयोग। इन नियंत्रणों सुनिश्चित करना है कि methylated और unmethylated डीएनए के लिए इसी का संकेत स्पष्ट रूप से पहचाने हैं। चित्रा 1 2-डी बिखराव bisulfite परिवर्तित unmethylated आईएनएस डीएनए (चित्रा 1 ए) युक्त प्लाज्मिड नियंत्रण, मिथाइल आईएनएस डीएनए (चित्रा 1 बी) के लिए बूंदों के लिए इसी भूखंडों से पता चलता है, और एक 1: दो plasmids (चित्रा 1 सी) के 1 मिश्रण। Unmethylated आईएनएस युक्त प्लाज्मिड बूंदों 6-Carboxyfluorescein (परिवार) संकेत के लिए सकारात्मक ने संकेत दिया है, जबकि प्लाज्मिड methylated युक्त आईएनएस बूंदों विक संकेत के लिए सकारात्मक ने संकेत दिया है। 1: 1 प्लाज्मिड मिश्रण, डबल सकारात्मक बूंदों की आबादी में देखा जाता है, के दोनों प्रजातियों युक्त बूंदों के लिए इसीडीएनए। नकारात्मक बूंदों से सकारात्मक बूंदों भेद करने के लिए, डेटा इन 2-डी भूखंडों का उपयोग कर gated हैं। नोट चित्रा 1 ए में है, वहाँ विक चैनल में परिवार पॉजिटिव बूंदों के एक मामूली बदलाव है कि यह दर्शाता है कि मिथाइल आईएनएस डीएनए के लिए जांच unmethylated आईएनएस डीएनए के लिए कुछ पार जेट दर्शाती है। इसी तरह, चित्रा 1 बी में, वहाँ परिवार चैनल में विक पॉजिटिव बूंदों का एक बहुत ही मामूली बदलाव, डीएनए methylated साथ unmethylated डीएनए के लिए जांच के पार जेट का संकेत है। डिजिटल पीसीआर का एक प्रमुख लाभ यह अभी भी विशिष्ट संकेतों भेदभाव कर सकते हैं यहां तक कि जब जांच में 100% विशिष्ट नहीं कर रहे है। सॉफ्टवेयर द्वारा उचित पॉसों सांख्यिकीय गणनाओं के लिए, प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया, कम से कम 10,000 कुल बूंदों में विभाजन होना चाहिए नकारात्मक बूंदों के एक क्लस्टर प्रदर्शन, और एक स्पष्ट आयाम (विश्वसनीय gating के लिए) नकारात्मक और सकारात्मक बूंदों के बीच का अंतर दिखा। हमारे प्राइमरों के linearity प्रदर्शित करने के लिए, हम पीपरिमाण के कई आदेशों भर में दो plasmids के erformed मिश्रण। चित्रा 2 में दिखाया गया है, एक प्लाज्मिड के अलग सांद्रता रैखिक दूसरी प्लाज्मिड की एक निरंतर राशि की उपस्थिति में पता लगाया जा सकता है। नई प्रयोगशालाओं इस प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए, हम एक समान मिश्रण प्रयोग के निर्माण की सिफारिश सुनिश्चित करने के लिए कि परख एक रेखीय का पता लगाने के फैशन में काम कर रही है।
अगला, हम नई शुरुआत T1D के साथ तीन विषयों के सीरम प्राप्त T1D के बिना और तीन नियंत्रण व्यक्तियों (नैदानिक विशेषताओं के लिए 1 टेबल देखें) (निदान के 2 दिनों के भीतर)। प्रोटोकॉल इंडियाना विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया। उपलब्ध कराए गए विषयों के माता-पिता को सूचित सहमति लिखा है। चित्रा 3 की unmethylated और मिथाइल आईएनएस डीएनए संख्या / μl सीरम कॉपी quantitation पता चलता है, इन पर नियंत्रण और T1D विषयों से 10 प्रवेश करने के लिए बदल दिया। आंकड़ों से पता चलता है कि मैं नियंत्रण की तुलना में दोनों methylated और unmethylated आईएनएस डीएनए के T1D प्रदर्शनी ऊंचा स्तर के साथ ndividuals, पहले 6 रिपोर्ट डेटा के समान है।
चित्रा 1: प्लाज्मिड नियंत्रण के प्रतिनिधि 2-डी भूखंड। प्लाज्मिड मानकों आईएनएस करने पर स्थिति -69 बीपी रिश्तेदार bisulfite परिवर्तित आईएनएस डीएनए को शरण देने unmethylated या मिथाइल साइटोसिन के टुकड़े क्लोनिंग Transcriptional साइट शुरू द्वारा उत्पन्न किया गया। दिखाया 2-डी unmethylated (ए) और मिथाइल (बी) युक्त प्लाज्मिड का उपयोग कर भूखंडों आईएनएस डीएनए होते हैं और एक 1: दो plasmids (सी) के 1 मिश्रण। तीर, unmethylated methylated और unmethylated + methylated (सकारात्मक डबल) आईएनएस डीएनए युक्त बूंदों की पहचान। परिवार = लक्ष्य 1; विक = लक्ष्य 2।रेफरी = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: नियंत्रण प्लाज्मिड मिश्रण का उपयोग डीएनए लक्ष्य के quantitation। प्लाज्मिड आईएनएस करने पर स्थिति -69 बीपी रिश्तेदार bisulfite परिवर्तित आईएनएस डीएनए को शरण देने unmethylated या मिथाइल साइटोसिन का क्लोन टुकड़े युक्त Transcriptional साइट शुरू मानकों, दिखाए गए विभिन्न संयोजनों में मिलाया गया तो डिजिटल पीसीआर मल्टीप्लेक्स के अधीन है। आंकड़ा लक्ष्य डीएनए टुकड़े, के रूप में प्रतियां / μl प्रस्तुत की quantitation पता चलता है; आर 2 = 0.989 unmethylated आईएनएस डीएनए के लिए और आर 2 = 0.998 methylated आईएनएस डीएनए के लिए। करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 3: T1D के साथ नियंत्रण में unmethylated और methylated आईएनएस डीएनए स्तर और विषयों परिसंचारी। सीरम नमूनों नई शुरुआत T1D के साथ 4 युवाओं से एकत्र किए गए थे और 4 रोग मुक्त, असंबंधित नियंत्रण से, तो डिजिटल पीसीआर द्वारा विभिन्न methylated आईएनएस डीएनए की माप के लिए कार्रवाई की। दिखाया unmethylated (ए) और मिथाइल (बी) आईएनएस डीएनए के लिए डिजिटल पीसीआर assays के परिणाम हैं। डेटा अलग-अलग अंक के रूप में दिखाया गया है और ± SEM मतलब है। सांख्यिकी एक दो पूंछ पैरामीट्रिक छात्र टी परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया। Thi का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंएस आंकड़ा।
| नियंत्रण | शुरुआत में T1D | |
| उम्र साल) | 10.3 ± 1.3 | 9.2 ± 1.0 |
| महिला पुरुष | 1: 3 | 1: 3 |
| बीएमआई जेड स्कोर | 0.30 ± 0.9 | 0.74 ± 0.9 |
| एचबीए 1 सी (%) | 11.1 ± 0.6 | |
| सी-पेप्टाइड (pmol / एल) | 285.5 ± 37.0 |
तालिका 1: नियंत्रण और T1D के साथ विषय की जनसांख्यिकी।
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Discussion
डीएनए Methyltransferases द्वारा cytosines के मेथिलिकरण कई जीनों पर प्रतिलेखन के epigenetic नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। मानव में आईएनएस जीन लगभग विशेष कोशिकाओं β आइलेट में व्यक्त किया जाता है, और इसके प्रतिलेखन 11 का मुंह बंद करने के लिए आईएनएस जीन में cytosines के मेथिलिकरण की आवृत्ति के बीच एक संबंध होना करने के लिए वहाँ प्रकट होता है। 13 - इस तरह के रूप में, सबसे सेल प्रकार 11 कोशिकाओं बीटा की तुलना में विभिन्न cytosines पर आईएनएस जीन की मेथिलिकरण की काफी अधिक आवृत्तियों दिखा। यह प्रस्ताव किया गया है कि β कोशिका मृत्यु के प्रसार सेल मुक्त unmethylated आईएनएस डीएनए के सीरम का स्तर है, जो β कोशिकाओं है कि उनके डीएनए 12 आजाद कराने मरने से काफी हद तक पैदा होता है के विश्लेषण द्वारा नजर रखी जा सकती है।
Bisulfite प्रतिक्रिया, uracils में unmethylated cytosines धर्मान्तरित अपरिवर्तित 14 methylated cytosines जा रही है। अनुक्रमण या पीसीआर विश्लेषण ओएफ bisulfite परिवर्तित डीएनए इसलिए की है कि क्या मूल साइटोसिन methylated था या नहीं निर्धारण की अनुमति देता। मेथिलिकरण विशेष पीसीआर डाई आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग कर प्राइमरों और टेम्पलेट के बीच 3 'आधार जोड़ी बेमेल के कारण पीसीआर दक्षता में मतभेद कारनामे, और इस तरह डीएनए 15 के bisulfite रूपांतरण निम्नलिखित बनाम methylated cytosines unmethylated का गौरव प्राप्त की अनुमति देता है। तदनुसार, डाई आधारित पीसीआर T1D विषयों 12,16 के प्रारंभिक अध्ययन में methylated इन करने के लिए unmethylated के सापेक्ष अनुपात quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, डाई आधारित पीसीआर प्रौद्योगिकी लिमिटेड विशिष्टता, डीएनए टुकड़ा सांद्रता का पूर्ण quantitation की कमी है, और मल्टीप्लेक्स के लिए (यानी, एक ही प्रतिक्रिया में दोनों methylated और unmethylated डीएनए प्रजातियों का पता लगाने) असमर्थता सहित कई कमियां है। अन्य समूहों सेल मुक्त डीएनए टुकड़े के प्रत्यक्ष अनुक्रमण, एक तकनीक है कि बहुत महान के साथ कई विभिन्न methylated सीपीजी साइटों की निगरानी की अनुमति देता प्रदर्शन किया हैएर विशिष्टता 9। हालांकि, अनुक्रमण तकनीक, बड़े नमूना संस्करणों की आवश्यकता आसानी से बैंकिंग के नमूनों का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी नहीं है, और महंगी है।
इन सीमाओं, हमारे समूह और दूसरों को डिजिटल पीसीआर, एक तकनीक है कि डीएनए टुकड़े का पूर्ण quantitation प्रदान करता है कार्यरत है का एक परिणाम के रूप में, ताजा या बैंकिंग के नमूनों से सीरम का केवल microliter मात्रा की आवश्यकता है, बहुसंकेतन के लिए उत्तरदायी है, पारंपरिक मात्रात्मक पीसीआर की तुलना में अधिक से अधिक संवेदनशीलता से पता चलता है , और प्रत्यक्ष अनुक्रमण से कम खर्चीला है। डिजिटल पीसीआर प्रौद्योगिकी पारंपरिक प्राइमर / जांच assays के उपयोग और ~ 20,000 बूंदों में एक पानी में तेल पीसीआर प्रतिक्रिया का एक microfluidics आधारित विभाजन शामिल है। विभाजित प्रतिक्रिया के थर्मल साइकिल चालन के बाद, बूंदों बाद में एक प्रवाह कोशिकामापी से विश्लेषण कर रहे सकारात्मक और नकारात्मक संकेतों के साथ बूंदों की पहचान। पॉसों आँकड़े प्रत्येक डीएनए प्रजातियों की पूर्ण मात्रा (कॉपी संख्या) की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। वैचारिक घडिजिटल पीसीआर की etails कहीं और 17 में वर्णित किया गया है।
इस प्रोटोकॉल डिजिटल पीसीआर द्वारा विभिन्न methylated आईएनएस डीएनए को मापने के द्वारा मनुष्यों में β कोशिका मृत्यु का माप का वर्णन है। हमारे डेटा यहां प्रस्तुत किया है और कहीं और 6 शो है कि प्राइमर / जांच संयोजन है कि स्थिति -69 पर साइटोसिन के अंतर का पता लगाने के मेथिलिकरण (आईएनएस के transcriptional शुरू साइट के सापेक्ष) या तो unmethylated साइटोसिन (परिवार जांच) या मिथाइल साइटोसिन के लिए पर्याप्त विशिष्टता का प्रदर्शन ( विक जांच) (चित्रा 1 ए और बी देखें)। स्थिति में दोनों methylated और unmethylated आईएनएस टुकड़े युक्त -69 बीपी plasmids के मिश्रण (यानी, bisulfite परिवर्तित डीएनए या तो स्थिति -69 बीपी पर uracil या साइटोसिन वाले) प्रदर्शनी एक या अन्य प्लाज्मिड युक्त बूंदों या दोनों plasmids (डबल सकारात्मक संकेतों चित्रा 1C में)। पॉसों सांख्यिकीय गणना वीं का इस्तेमालई छोटी बूंद संख्या है कि किसी दिए जांच के लिए सकारात्मक है (चाहे एकल सकारात्मक या डबल सकारात्मक) प्रत्येक मिथाइल या unmethylated डीएनए टुकड़ा की प्रतिलिपि संख्या प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं।
जब सेल मुक्त डीएनए में स्थिति -69 बीपी (चित्रा 3) में विभिन्न methylated cytosines की माप के लिए मानव सीरम का उपयोग, हमारे डेटा दो प्रमुख विशेषताएं प्रदर्शित: (1) methylated आईएनएस के स्तर पर इन विषयों में उच्च 5-10 गुना कर रहे हैं unmethylated आईएनएस (निदान की परवाह किए बिना), और (2) दोनों unmethylated और मिथाइल आईएनएस के पूर्ण स्तर से नियंत्रण की तुलना में नई शुरुआत T1D के साथ विषयों में अधिक है। जबकि unmethylated आईएनएस की तुलना में मिथाइल आईएनएस के उच्च स्तर की संभावना सेल मुक्त डीएनए गैर-β कोशिकाओं से उत्पन्न की अधिक से अधिक बोझ को प्रतिबिंबित, नई शुरुआत T1D विषयों में आईएनएस के दोनों प्रजातियों के उच्च स्तर संभावना दोनों प्रचलित β में वृद्धि को दर्शाता कोशिका मृत्यु (unmethylated मेंएस), और संभवतः मौत / कि रोग राज्य (जैसे, सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं) के साथ जुड़े रहे हैं अन्य प्रकार की कोशिकाओं का कारोबार। नई शुरुआत T1D विषयों में आईएनएस के दोनों प्रजातियों के उन्नयन पर आगे अटकलें पहले से 6 चर्चा की गई। इन व्यक्तियों से सीरम में आईएनएस के दोनों प्रजातियों के स्रोतों के बावजूद, यह उल्लेखनीय है कि methylated इन करने के लिए unmethylated के अनुपात में पूर्ण स्तर में काफी अंतर उठाया है नहीं होगा (के रूप में प्रयोग डाई आधारित पीसीआर अन्य जांचकर्ताओं द्वारा रिपोर्ट) की माप यहाँ वर्णित है और हमारे हाल ही में प्रकाशन 6 में, इस प्रकार बायोमार्कर विश्लेषण के इस प्रकार के लिए डिजिटल पीसीआर की शक्ति पर बल।
कुछ सावधानियों और सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। हमें लगता है कि यह महत्वपूर्ण है कि रक्त संग्रह के 4 घंटा के भीतर कार्रवाई की है और या तो डीएनए अलगाव के लिए तुरंत इस्तेमाल किया है या भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। अप्रकाशित अध्ययन में, हम ओ बीएस हैनमूने के रूप में 18 वर्ष की लंबी अवधि के भंडारण के अध्ययन में देखा संग्रह के 4 घंटे के बाद डीएनए वसूली के कुछ नुकसान erved, शायद डीएनए के क्षरण के कारण,। डिजिटल पीसीआर की वृद्धि की संवेदनशीलता के कारण, विशेष देखभाल के नमूने के प्रदूषण है कि अन्यथा पारंपरिक qPCR में ध्यान देने योग्य नहीं होगा बचने के लिए लिया जाना चाहिए। अंत में, तकनीक का एक प्रमुख सीमा नमूनों में जो छोटी बूंद पीढ़ी ~ 10,000 बूंदों से अधिक नहीं है का विश्लेषण है। इस तरह के नमूने विश्वसनीय पॉसों आँकड़े प्रदान नहीं करते हैं, और इस तरह के रूप uninterpretable माना जा सकता है। इतनी कम छोटी बूंद पीढ़ी के कई कारणों में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों की गुणवत्ता से संबंधित नमूना हैंडलिंग में तकनीकी त्रुटियों, छोटी बूंद जनरेटर के साथ तकनीकी मुद्दों, या मुद्दों में शामिल हो सकता है।
सारांश में, इस रिपोर्ट स्थिति -69 डिजिटल पीसीआर द्वारा बीपी पर विभिन्न methylated, सेल मुक्त आईएनएस डीएनए की माप के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित किसी भी अनुकूलित किया जा सकताडीएनए प्रजाति है, जिसके लिए विभिन्न methylated cytosines का पता लगाने के लिए वांछित है, प्रचलन से या अलग कोशिकाओं और ऊतकों से हैं, और डीएनए टुकड़े का पूर्ण quantitation प्रदान कर सकते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
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