Introduction
Typ 1 diabetes (T1D) är en autoimmun sjukdom som kännetecknas av destruktion av insulinproducerande ö-β-celler genom autoreaktiva T-celler 1. Diagnosen T1D typiskt görs vid mätning av hyperglykemi (blodglukos> 200 mg / dl) i en mager, ung individ, som kan uppvisa ketoacidos som bevis på insulinbrist. Vid tidpunkten för diagnos av T1D, finns det bevis för väsentlig förlust av β-cellfunktion och massa (50-90%) 2. I kliniska studier, flera immunmodulerande läkemedel som inletts vid tidpunkten för diagnos ledde till stabilisering av β cellfunktionen (och förmodligen massa), men ingen har resulterat i klinisk remission av sjukdomen, ett konstaterande som har höjt kravet på att utveckla av biomarkörer för tidig upptäckt av sjukdomen och för längsgående spårning av effektiviteten av kombinationsterapier 3,4. Ansträngningar från internationella konsortier, en sådans Human Islet Research Network Consortium vid National Institutes of Heath 5, har betonat behovet av att utveckla biomarkörer som fokuserar på β cellstress och död i T1D.
I linje med dessa ansträngningar, har vår grupp och andra nyutvecklade biomarkörer analyser som mäter cirkulerande, epigenetiskt modifierade DNA-fragment som uppstår i första hand från att dö p-celler 6-9. I samtliga av de publicerade analyserna hittills har fokus varit på kvantifiering av den humana genen som kodar preproinsulin (INS), som visar större grad av ometylerade CpG platser i de kodande och promotorregioner jämfört med andra celltyper. Befrielsen av ometylerade INS DNA-fragment var hypotes som uppstår i första hand från att dö (nekrotiska, apoptotiska) p-celler. Våra senare studier har visat att i ungdomen, höjder både ometylerade och metylerade INS DNA vid position -69 bp (i förhållande till than transkriptions start site) observerades i nydebuterat T1D, och tillsammans tjänade som specifika biomarkörer för denna population 6. Dessa biomarkörer analyser innefattar isolering av cellfria DNA från serum eller plasma med hjälp av kommersiella spin kit, följt av en bisulfit omvandling av den isolerade DNA (för att konvertera icke-metylerade cytosiner till uraciler, lämnar metylerade cytosiner intakt).
I denna rapport beskriver vi de tekniska aspekterna av serum provtagning, isolering av cellfritt DNA från serum, bisulfit konvertering och prestanda för dropp digital PCR (hädanefter, digital PCR) för differentiellt metylerade INS DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att tolka data på lämpligt sätt, använder vi plasmid kontroller för både ometylerade och metylerade mål INS DNA i varje digital PCR-körning. Dessa kontroller säkerställa att signaler som motsvarar metylerade och ometylerade DNA är klart urskiljbara. Figur 1 visar de 2-D spridningsdiagram som motsvarar till droppar för plasmid kontroller innehållande bisulfit-omvandlas ometylerade INS-DNA (figur 1 A), metylerad INS-DNA (figur 1B), och en 1: 1 blandning av de två plasmiderna (figur 1C). Plasmid innehållande ometylerade INS indikeras av de små dropparna positiva för signalen 6-karboxifluorescein (FAM), medan plasmiden innehållande metylerat INS indikeras av de små dropparna positiva för VIC-signalen. I 1: 1 plasmid blandning är en population av dubbel-positiva droppar sett motsvarar droppar som innehåller båda arterna avDNA. För att skilja positiva droppar från negativa droppar, är uppgifter gated med hjälp av dessa två-D tomter. Notera att i figur 1 A, finns det en viss förskjutning av de FAM-positiva droppar in i VIC-kanalen, vilket indikerar att sonden för den metylerade INS-DNA uppvisar viss korsreaktivitet för ometylerade INS-DNA. På liknande sätt, i figur 1B, finns det en mycket liten förskjutning av de VIC-positiva droppar in i FAM-kanalen, vilket tyder på korsreaktivitet hos sonden för ometylerade DNA med metylerat DNA. En stor fördel med digital PCR är det fortfarande kan diskriminera specifika signaler, även när sonderna är inte 100% specifik. För lämpliga Poisson statistiska beräkningar av programvaran, bör varje PCR-reaktion fördelas i åtminstone 10.000 totalt droppar, visar ett kluster av negativa droppar, och visar en tydlig amplitud skillnad mellan negativa och positiva droppar (för tillförlitlig gating). För att demonstrera linearitet våra primrar, vi performed blandningar av de två plasmiderna över flera tiopotenser. Såsom visas i figur 2, kan varierande koncentrationer av en plasmid vara linjärt detekteras i närvaro av en konstant mängd av den andra plasmiden. För nya labb utför den här proceduren, rekommenderar vi att bygga en liknande blandning experiment för att säkerställa att analysen fungerar på ett linjärt detektions mode.
Därefter fick vi serum av tre patienter med ny debut T1D (inom 2 dagar efter diagnos) och tre kontrollindivider utan T1D (se tabell 1 för kliniska egenskaper). Protokoll har godkänts av Indiana University Institutional Review Board. Föräldrar till ämnen som skriftligt informerat samtycke. Figur 3 visar kvantifiering av ometylerade och metylerade INS DNA kopiera nummer / il serum, omvandlas till log 10 från dessa kontroller och T1D ämnen. Data visar att i ndividuals med T1D uppvisar förhöjda halter av både metylerade och ometylerade INS DNA jämfört med kontroller, liknande uppgifter tidigare sex rapporterats.
Figur 1: Representativa 2-D Tomter av plasmid Controls. Plasmid standarder genererades genom att klona fragment av bisulfit-konverterade INS DNA hyser ometylerade eller metylerade cytosin vid position -69 bp i förhållande till INS transkriptions start site. Visas är 2-D tomter med användning av plasmiden innehållande ometylerade (A) och metylerade (B) INS-DNA och för en 1: 1 blandning av de två plasmiderna (C). Pilar identifiera ometylerade, metanol och ometylerade + metyleras (dubbel positiv) INS DNA-innehållande droppar. FAM = Mål 1; VIC = Target 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av DNA-mål med hjälp av kontrollplasmid Blandningar. Plasmid standardlösningar som innehåller klonade fragment av bisulfit-konverterade INS DNA hyser ometylerade eller metylerade cytosin vid position -69 bp i förhållande till INS transkriptions start site blandades vid olika kombinationer visade utsattes sedan för multiplex digital PCR. Figuren visar kvantifiering av mål-DNA-fragment, som presenteras som kopior / ul; r2 = 0,989 för ometylerade INS DNA och r2 = 0,998 för metylerat INS DNA. Klicka här för atten större version av denna siffra.
Figur 3: Cirkulerande ometylerade och metylerade INS DNA-nivåer i kontrollgruppen och ämnen med T1D. Serumprover togs från fyra ungdomar med ny debut T1D och från 4 sjukdomsfria, orelaterade kontroller bearbetas sedan för mätning av differentiellt metylerad INS DNA genom digital PCR. Visas är resultatet av digitala PCR-analyser för icke-metylerad (A) och metylerade (B) INS-DNA. Data visas som enskilda punkter och medelvärde ± SEM. Statistik analyserades med en två-tailed parametriska studenter t-test. Klicka här för att se en större version av this siffra.
| kontroller | T1D vid insjuknandet | |
| Ålder (år) | 10,3 ± 1,3 | 9,2 ± 1,0 |
| Kvinna man | 1: 3 | 1: 3 |
| BMI Z-Score | 0,30 ± 0,9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| C-peptid (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tabell 1: Demografi av kontroller och ämnen med T1D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metylering av cytosiner genom DNA metyltransferaser möjliggör epigenetisk reglering av transkription på många gener. INS-genen hos människa är nästan uteslutande uttrycks i ö-β-celler, och det verkar finnas ett samband mellan frekvensen av metylering av cytosiner i INS-genen till att tysta av dess transkription 11. Som sådan, de flesta celltyper visar betydligt högre frekvenser av metylering av INS-genen vid olika cytosiner jämfört med P-celler 11-13. Det har föreslagits att förekomsten av β celldöd kan övervakas genom analys av serumnivåer av cellfritt ometylerade INS DNA, som skulle uppstå i hög grad från att dö p-celler som frigör deras DNA 12.
Bisulfit reaktion omvandlar ometylerade cytosiner i uraciler, lämnar metylerade cytosiner oförändrade 14. Sekvensering eller PCR-analys of bisulfit-konverterade DNA kan därför bestämma om den ursprungliga cytosin var denaturerad eller inte. Metylering-specifik PCR med hjälp av färgbaserad teknik utnyttjar skillnader i PCR effektivitet på grund av tre 'baspar obalanser mellan primers och mall, och därmed möjliggör åtskillnad av ometylerade kontra metylerade cytosiner efter bisulfit omvandling av DNA 15. Följaktligen sändes färgämnesbaserade PCR användes för att kvantifiera det relativa förhållandet mellan ometylerade till metylerat INS i tidiga studier av T1D utsätter 12,16. Emellertid har färgbaserade PCR-teknik flera nackdelar, däribland begränsad specificitet, brist på absolut kvantifiering av DNA-fragmentkoncentrationer, och oförmågan att multiplexera (dvs upptäcka både metylerade och ometylerade DNA-arter i samma reaktion). Andra grupper har utförts direkt sekvensering av cellfria DNA-fragment, en teknik som medger övervakning av flera differentiellt metylerade CpG platser med mycket storer specificitet 9. Kräver emellertid sekvenseringsteknik stora provvolymer, är inte lätta att använda i cellbanker prover, och är dyrt.
Som ett resultat av dessa begränsningar, vår grupp och andra har använt digital PCR, en teknik som ger absolut kvantifiering av DNA-fragment, kräver endast mikroliter mängder av serum från färska eller bankas prover, är mottaglig för multiplexering, visar större känslighet än traditionell kvantitativ PCR är och billigare än direkt sekvensering. Digital PCR-teknik innebär användning av konventionella primer / probanalyser och mikrofluidik baserad uppdelning av en vatten-i-olja PCR-reaktion i ~ 20.000 droppar. Efter termisk cykling av den partitionerade reaktionen, är de små dropparna därefter analyseras med en flödescytometer för att identifiera små droppar med positiva och negativa signaler. Poisson statistik används för att beräkna absoluta mängder (antalet kopior) av varje DNA-art. Den konceptuella details av digitalt PCR har beskrivits på annan plats 17.
Detta protokoll beskriver mätning av β celldöd hos människor genom att mäta differentiellt metylerade INS DNA genom digital PCR. Våra data som presenteras här och på andra ställen 6 visar att primer / probkombinationer som detekterar differentiell metylering av cytosin vid position -69 (i förhållande till transkriptionsstartstället av INS) uppvisar tillräcklig specificitet för antingen den icke-metylerad cytosin (FAM prob) eller den metylerade cytosin ( VIC sond) (se Figur 1A och B). Blandningar av plasmider innehållande både metylerade och ometylerade INS-fragmenten vid position -69 bp (dvs bisulfit-konverterade DNA med antingen uracil eller cytosin vid position -69 bp) uppvisar droppar som innehåller en eller den andra plasmiden, eller båda plasmider (dubbel-positiva signaler i figur 1C). Poisson statistisk beräkning använder the dropp siffror som är positiva för en viss sond (om enkel positiv eller dubbel positiv) för att härleda antalet kopior av varje metylerade eller ometylerade DNA-fragment.
Vid användning av humant serum för mätning av differentiellt metylerade cytosiner i position -69 bp cellfria DNA (Figur 3), våra data visar två viktiga funktioner: (1) halter av metylerade INS är 5-10 gånger högre hos dessa patienter än ometylerad INS (oavsett diagnos), och (2) absoluta nivåer av både ometylerade och metylerade INS är högre hos patienter med nydebuterad T1D jämfört med kontroller. Medan de högre nivåerna av metylerade INS jämfört med ometylerade INS återspeglar sannolikt större börda av cellfritt DNA som härrör från icke-p-celler, de högre nivåerna av båda arterna av INS i nydebuterade T1D ämnen sannolikt återspeglar både en ökning av förhärskande β celldöd (ometylerade INS), och eventuellt dödsfall / omsättning av andra celltyper som är förknippade med sjukdomstillståndet (t.ex. medfödda och adaptiva immunceller). Ytterligare spekulation på förhöjning av båda arterna av INS i nydebuterade T1D ämnen diskuterades tidigare sex. Oavsett källorna båda arterna av INS i serum från dessa individer, är det anmärkningsvärt att mäta förhållandet mellan ometylerade till metylerat INS (som rapporterats av andra forskare med hjälp av färgämnesbaserat PCR) skulle inte har plockat upp de stora skillnaderna i absoluta nivåer beskrivs här och i vår senaste publikation 6, vilket understryker kraften i digital PCR för denna typ av biomarkör analys.
Vissa försiktighetsåtgärder och begränsningar bör noteras. Vi anser att det är viktigt att blodet behandlas inom fyra timmar för insamling och antingen användas omedelbart för DNA-isolering eller förvaras vid -80 ° C för framtida bruk. I opublicerade studier har vi observed viss förlust av DNA återhämtning efter fyra timmar för insamling, kanske på grund av DNA nedbrytning, vilket kan ses i studier av långtidsförvaring av prover 18. På grund av den ökade känsligheten hos digital PCR, bör särskild försiktighet iakttas för att undvika kontaminering av prover som annars inte skulle märkas i traditionell qPCR. Slutligen är en viktig begränsning av tekniken analys av prover som dropp generation inte överstiger ~ 10.000 droppar. Dessa prover ger inte tillförlitlig Poisson statistik, och som sådan kan betraktas som tolkningsbara. Flera orsaker till så låg dropp generation kan innehålla tekniska fel i provhantering, tekniska problem med droppgeneratorn, eller frågor som rör kvaliteten på de reagenser som används.
Sammanfattningsvis beskriver rapporten kommer den detaljerade protokoll för mätning av differentiellt metylerade, cellfritt INS DNA vid position -69 bp av digital PCR. Protokollet som beskrivs här kan anpassas till varjeDNA-arter för vilka detektion av differentiellt metylerade cytosiner önskas, vare sig omsättning eller från isolerade celler och vävnader, och kan ge absolut kvantifiering av DNA-fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
