Introduction
La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la destrucción de los islotes productoras de insulina por las células β células T autorreactivas 1. El diagnóstico de la diabetes tipo 1 se hace típicamente en la medición de (glucemia> 200 mg / dl) la hiperglucemia en un individuo joven magra, que podría presentar con cetoacidosis como evidencia de la deficiencia de insulina. En el momento del diagnóstico de T1D, hay evidencia de una pérdida sustancial de la función de células β y la masa (de 50 - 90%) 2. En estudios clínicos, varios fármacos moduladores inmunes que fueron instituidas en el momento del diagnóstico como resultado la estabilización de la función de las células β (y, presumiblemente, la masa), pero ninguno ha dado lugar a la remisión clínica de la enfermedad, un hallazgo que ha levantado la llamada para el desarrollo de biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad y para el seguimiento longitudinal de la efectividad de las terapias de combinación 3,4. Los esfuerzos de los consorcios internacionales, como unaEs la Red de Investigación Consorcio de islotes humanos en los Institutos Nacionales de Heath 5, han hecho hincapié en la necesidad de desarrollar biomarcadores que se centran en el estrés celular β y la muerte en la DM1.
En línea con estos esfuerzos, nuestro grupo y otros han desarrollado recientemente ensayos de biomarcadores que miden la circulación, fragmentos de ADN epigenetically modificados que se derivan principalmente de las células que mueren beta 6 - 9. En todos los ensayos publicados hasta la fecha, la atención se ha centrado en la cuantificación del gen humano que codifica la preproinsulina (INS), lo que demuestra un mayor grado de sitios CpG no metilados en las regiones codificantes y promotores en comparación con otros tipos de células. La liberación de fragmentos de ADN INS no metilados se planteó la hipótesis de que surja principalmente de la muerte (necrosis, apoptosis) las células beta. Nuestros estudios recientes demostraron que en la juventud, las elevaciones en el ADN INS tanto metilado y no metilado en la posición -69 pb (con relación al tél inicio de la transcripción sitio) se observaron en nueva aparición de diabetes tipo 1, y juntos sirvió como biomarcadores específicos para esta población 6. Estos ensayos de biomarcadores implican el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero o plasma usando kits comerciales de giro, seguido de una conversión de bisulfito del ADN aislado (para convertir las citosinas no metiladas a uracilos, dejando citosinas metiladas intacta).
En este informe, se describen los aspectos técnicos de la recogida de muestras de suero, el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero, la conversión de bisulfito, y el rendimiento de la PCR digital de la gotita (en adelante, digital PCR) para el ADN metilado diferencialmente INS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para interpretar los datos de forma adecuada, utilizamos plásmido controles tanto para el ADN diana INS no metilado y no metilado en cada PCR plazo digital. Estos controles aseguran que las señales correspondientes a ADN metilado y no metilado son claramente distinguibles. La Figura 1 muestra los gráficos de dispersión 2-D correspondientes a las gotas para los controles de plásmido que contienen bisulfito convertido no metilada de ADN INS (Figura 1A), DNA INS metilado (Figura 1B), y una mezcla 1: 1 de los dos plásmidos (Figura 1C). El plásmido que contiene no metilado INS se indica mediante las gotitas positivos para la señal de 6-carboxifluoresceína (FAM), mientras plásmido que contiene metiladas INS se indica mediante las gotitas positivos para la señal de VIC. En la mezcla 1: 1 de plásmido, una población de gotitas de doble positivas se ve, correspondiente a gotitas que contienen ambas especies deDNA. Para distinguir las gotitas positivas de gotitas negativos, los datos son cerradas usando estas parcelas 2-D. Tenga en cuenta que en la Figura 1A, hay un ligero desplazamiento de las gotitas de FAM-positiva en el canal VIC, lo que indica que la sonda para el ADN metilado INS exhibe cierta reactividad cruzada para el ADN no metilado INS. Del mismo modo, en la Figura 1B, hay un muy ligero cambio de las gotitas de VIC-positivas en el canal FAM, lo que indica la reactividad cruzada de la sonda para el ADN no metilado con ADN metilado. Una ventaja importante de PCR digital es que todavía puede discriminar señales específicas incluso cuando las sondas no son 100% específico. Para los cálculos estadísticos apropiados de Poisson por el software, cada reacción de PCR debería dividir en al menos 10.000 gotas totales, mostrar un grupo de gotas negativos, y muestran una diferencia de amplitud clara entre las gotitas de negativos y positivos (por gating fiable). Para demostrar la linealidad de nuestros cebadores, que pmezclas erformed de los dos plásmidos a través de varios órdenes de magnitud. Como se muestra en la Figura 2, concentraciones variables de un plásmido se pueden detectar de forma lineal en presencia de una cantidad constante de la segunda plásmido. Para los nuevos laboratorios de realizar este procedimiento, se recomienda la construcción de un experimento de mezcla similar para asegurar que el ensayo está funcionando en un modo de detección lineal.
A continuación, se tomaron muestras de sangre de tres sujetos con diabetes tipo 1 de inicio reciente (dentro de los 2 días del diagnóstico) y tres individuos de control sin diabetes tipo 1 (véase la Tabla 1 para las características clínicas). Protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Indiana. Los padres de los temas siempre el consentimiento informado por escrito. La Figura 3 muestra la cuantificación de ADN metilado y no metilado INS / números de suero l copia, se convirtió al log10 de estos controles y los sujetos T1D. Los datos muestran que i as personas con DM1 presentan niveles elevados de ADN INS tanto metilado y no metilado en comparación con los controles, de forma similar a los datos reportados previamente 6.
Figura 1: de 2-D Parcelas de plásmido controles. Normas de plásmidos se generaron mediante la clonación de fragmentos de ADN con bisulfito INS convertido albergar citosina no metilada o metilado en la posición -69 pb en relación con el INS inicio transcripcional sitio. Se muestran parcelas 2-D utilizando el plásmido que contienen no metilado (A) y metilado (B) DNA INS y para una mezcla 1: 1 de los dos plásmidos (C). Las flechas identifican la no metilado, metilado y no metilado + metilado (doble- positivo) del INS gotitas que contienen ADN. FAM = Objetivo 1; VIC = Objetivo 2.ref = objetivo "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La cuantificación de dianas de ADN plásmido utilizando Control de Mezclas. Normas plásmidos que contienen fragmentos clonados de ADN con bisulfito INS convertido albergar citosina no metilada o metilado en la posición -69 pb en relación con el INS sitio de inicio transcripcional se mezclaron a las diversas combinaciones que se muestran, después se sometió a PCR multiplex digital. La figura muestra la cuantificación de fragmentos de ADN diana, presentados como copias / l; r 2 = 0,989 para el ADN metilado INS y r2 = 0,998 para el ADN metilado INS. Por favor, haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los niveles circulantes de ADN metilado y no metilado INS en controles y los sujetos con diabetes tipo 1. Las muestras de suero se obtuvieron de 4 jóvenes con nueva aparición de diabetes tipo 1 y de 4, los controles no relacionados libres de la enfermedad, luego se procesan para la medición de ADN metilado diferencialmente INS por PCR digital. Se demuestran los resultados de los ensayos de PCR digitales para no metilado (A) y metilado (B) ADN INS. Los datos se muestran como puntos individuales y la media ± SEM. Las estadísticas se analizaron mediante una prueba t Estudiantes paramétricas de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de this figura.
| controles | DM1 en el inicio | |
| Años de edad) | 10,3 ± 1,3 | 9.2 ± 1.0 |
| Mujer hombre | 1: 3 | 1: 3 |
| Z-IMC | 0,30 ± 0,9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| C-péptido (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tabla 1: Datos demográficos de los controles y los sujetos con diabetes tipo 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La metilación de las citosinas por metiltransferasas de ADN permite el control epigenético de la transcripción en muchos genes. El gen INS en los seres humanos se expresa casi exclusivamente en los islotes β células, y no parece haber una correlación entre la frecuencia de metilación de citosinas en el gen INS para silenciamiento de su transcripción 11. Como tal, la mayoría de tipos de células muestran frecuencias sustancialmente más altos de metilación del gen INS en varias citosinas en comparación con las células ß 11-13. Se ha propuesto que la prevalencia de la muerte celular β podría ser controlado por el análisis de los niveles en suero de ADN no metilado INS libre de células, que surgirían en gran medida de la muerte las células ß que liberan su ADN 12.
La reacción de bisulfito convierte citosinas no metiladas en uracilos, dejando sin cambios las citosinas metiladas 14. La secuenciación o análisis de PCR of bisulfite convertido ADN, por tanto, permite la determinación de si la citosina metilada original o no. Metilación específica de PCR utilizando la tecnología basada en colorantes explota las diferencias en la eficiencia de la PCR debido a la inadecuación de 3 'de pares de bases entre los cebadores y la plantilla, y por lo tanto permite la distinción de no metilado frente a las citosinas metiladas después de la conversión de bisulfito de ADN 15. De acuerdo con ello, la PCR basada en colorantes se utilizó para cuantificar la proporción relativa de no metilado para INS metilado en los primeros estudios de T1D somete 12,16. Sin embargo, la tecnología PCR con base de tinte tiene varios inconvenientes, incluyendo una especificidad limitada, la falta de cuantificación absoluta de las concentraciones de fragmentos de ADN, y la incapacidad de multiplexar (es decir, detectar ambas especies de ADN metilado y no metilados en la misma reacción). Otros grupos han realizado la secuenciación directa de fragmentos de ADN libres de células, una técnica que permite la supervisión de varios sitios CpG metilados diferencialmente con mucho granespecificidad er 9. Sin embargo, la técnica de secuenciación requiere grandes volúmenes de muestra, no es fácilmente susceptible de uso de muestras en bancos, y es caro.
Como resultado de estas limitaciones, nuestro grupo y otros han empleado PCR digital, una técnica que proporciona la cuantificación absoluta de los fragmentos de ADN, sólo requiere cantidades microlitros de suero de las muestras frescas o en bancos, es susceptible de multiplexación, muestra una mayor sensibilidad que la PCR cuantitativa tradicional , y es menos caro que la secuenciación directa. tecnología PCR digital implica el uso de ensayos de cebador / sonda convencional y una partición basada en la microfluídica de una reacción de PCR de agua-en-aceite en ~ 20.000 gotitas. Después de los ciclos térmicos de la reacción particionada, las gotitas se analizaron posteriormente por un citómetro de flujo para identificar las gotitas con las señales positivas y negativas. las estadísticas de Poisson se utiliza para calcular las cantidades absolutas (número de copias) de cada especie de ADN. El d conceptualetails de digital de PCR se han descrito en otra parte 17.
Este protocolo describe la medición de la muerte celular β en los seres humanos mediante la medición de ADN INS diferencialmente metilado mediante PCR digital. Nuestros datos presentados aquí y en otros lugares 6 muestran que las combinaciones de cebadores / sondas que detectan la metilación diferencial de la citosina en la posición -69 (con relación al sitio de inicio transcripcional de INS) exhiben suficiente especificidad, ya sea para la citosina no metilada (sonda FAM) o la citosina metilada ( sonda VIC) (véase la Figura 1A y B). Mezclas de plásmidos que contienen fragmentos del INS tanto metilados y no metilados en la posición -69 pb (es decir, convertido-bisulfito de ADN que tiene uracilo o citosina en la posición -69 pb) señales de gotitas de exhibición que contienen uno o el otro plásmido, o ambos plásmidos (doble positivas en la Figura 1C). El cálculo estadístico de Poisson utiliza THnúmeros de gotitas e que son positivas para una sonda dada (ya sea de un solo positivo o de doble positivo) para derivar el número de copias de cada fragmento de ADN metilado o no metilado.
Cuando se utiliza suero humano para la medición de las citosinas metiladas diferencialmente en la posición -69 pb en el ADN libre de células (Figura 3), nuestros datos demuestran dos características principales: (1) los niveles de INS metilados son 5-10 veces más altos en estos sujetos que el INS no metilado (independientemente del diagnóstico), y (2) los niveles absolutos de ambos INS no metilados y metilados son mayores en los sujetos con diabetes tipo 1 de reciente comienzo en comparación con los controles. Mientras que los niveles más altos de INS metilados en comparación con los no metilado INS probablemente reflejan la mayor carga de ADN libre de células que emana de las células no beta, los niveles más altos de ambas especies de INS en temas T1D nueva aparición probablemente refleja tanto un aumento de β prevalente la muerte celular (IN no metiladoS), y posiblemente la muerte / volumen de negocios de otros tipos de células que se asocian con el estado de la enfermedad (por ejemplo, células del sistema inmune innato y adaptativo). Además la especulación sobre las elevaciones de las dos especies de INS en temas T1D de nueva aparición se discutió previamente 6. Independientemente de las fuentes de ambas especies de INS en el suero de estos individuos, es notable que la medición de las relaciones entre metilado a INS metilado (según lo informado por otros investigadores usando PCR basada en colorantes) no hubiera recogido las diferencias significativas en los niveles absolutos se describe aquí y en nuestra reciente publicación 6, destacando de este modo el poder de PCR digital para este tipo de análisis de biomarcadores.
Algunas precauciones y limitaciones deben tenerse en cuenta. Creemos que es importante que la sangre se procesa dentro de las 4 horas de la recogida y, o bien utilizarse inmediatamente para el aislamiento de ADN o se almacena a -80 ° C para su uso futuro. En los estudios no publicados, tenemos observed cierta pérdida de la recuperación de ADN después de 4 horas de la recogida, tal vez debido a la degradación del ADN, como se ve en los estudios de almacenamiento a largo plazo de las muestras de 18. Debido a la mayor sensibilidad de la PCR digital, se debe tener especial cuidado para evitar la contaminación de las muestras que de otro modo no sería claramente visible en el tradicional qPCR. Por último, una limitación clave de la técnica es el análisis de muestras en las que la generación de gotitas no exceda de ~ 10.000 gotitas. Estas muestras no proporcionan estadísticas de Poisson fiables, y como tales pueden ser considerados no interpretable. Múltiples causas de esta baja generación de gotas podrían incluir errores técnicos en la manipulación de muestras, problemas técnicos con el generador de gotas, o cuestiones relacionadas con la calidad de los reactivos utilizados.
En resumen, este informe se describe el protocolo detallado para la medición de ADN metilado diferencialmente, libre de células INS en la posición -69 pb por PCR digital. El protocolo aquí descrito se puede adaptar a cualquierespecies de ADN para la cual se desea la detección de citosinas metiladas diferencialmente, ya sea de la circulación o de las células y tejidos aislados, y pueden proporcionar la cuantificación absoluta de los fragmentos de ADN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
