Introduction
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto - immune qui se caractérise par la destruction des îlots de Langerhans productrices d'insuline par les cellules β des cellules T autoréactives 1. Le diagnostic de DT1 est généralement faite sur mesure (glycémie> 200 mg / dl) de l'hyperglycémie chez un jeune individu maigre, qui pourrait présenter une acidocétose comme preuve d'une carence en insuline. Au moment du diagnostic de diabète de type 1, il existe des preuves pour une perte substantielle de la fonction des cellules β et la masse (50-90%) 2. Dans les études cliniques, plusieurs médicaments modulateurs immunitaires qui ont été instituées au moment du diagnostic ont donné lieu à la stabilisation de la fonction des cellules β (et probablement de masse), mais aucune n'a abouti à une rémission clinique de la maladie, une constatation qui a soulevé l'appel pour le développement de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et pour le suivi longitudinal de l' efficacité de la combinaison des thérapies 3,4. Les efforts déployés par des consortiums internationaux, une telleest le Consortium Réseau de recherche sur l' îlot humain au National Institutes of Heath 5, ont souligné la nécessité de développer des biomarqueurs qui mettent l' accent sur le stress cellulaire β et la mort dans le DT1.
Conformément à ces efforts, notre groupe et d' autres ont récemment mis au point des tests de biomarqueurs qui mesurent en circulation, des fragments d'ADN épigénétique modifiés qui découlent principalement de la mort des cellules ß 6-9. Dans tous les essais publiés à ce jour, l'accent a été mis sur la quantification du gène humain codant pour la préproinsuline (INS), ce qui démontre un plus grand degré de sites CpG non méthylés dans les régions codantes et du promoteur par rapport à d' autres types de cellules. La libération de fragments d' ADN non méthylé INS a émis l' hypothèse que découlant principalement de la mort (nécrotiques, apoptotiques) cellules ß. Nos études récentes ont montré que chez les jeunes, les élévations de l'ADN non méthylé INS à la fois et méthylé en position -69 pb ( par rapport à til transcriptionnelle site de départ) ont été observés dans la nouvelle apparition du DT1, et ensemble a servi en tant que biomarqueurs spécifiques pour cette population 6. Ces dosages de marqueurs biologiques impliquent l'isolement de l'ADN acellulaire de sérum ou de plasma en utilisant des kits commerciaux de rotation, suivie d'une conversion au bisulfite de l'ADN isolé (pour convertir les cytosines non méthylées à uraciles, en laissant intact cytosines méthylées).
Dans ce rapport, nous décrivons les aspects techniques de la collecte des échantillons de sérum, l' isolement de l' ADN sans cellules à partir de sérum, conversion au bisulfite, et les performances des gouttelettes PCR numérique (désormais, PCR numérique) pour l' ADN méthylé INS différentiellement.
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Representative Results
Pour interpréter les données de manière appropriée, nous utilisons des contrôles plasmidiques tant pour l'ADN cible non méthylé et méthylé INS dans chaque essai de PCR numérique. Ces contrôles assurent que les signaux correspondant à l'ADN méthylé et non méthylé se distinguent clairement. La figure 1 montre les diagrammes de dispersion 2-D correspondant aux gouttes pour les contrôles de plasmide contenant le bisulfite converti méthylé INS ADN (figure 1A), l' ADN INS méthylés (figure 1B) et un mélange 1: 1 des deux plasmides (figure 1c). Le plasmide contenant méthylé INS est indiqué par les gouttelettes positives pour le signal 6-carboxyfluorescéine (FAM), alors que plasmide contenant méthylés INS est indiqué par les gouttelettes positives pour le signal VIC. Dans le mélange 1: 1 de plasmide, une population de gouttelettes double est considéré positif, correspondant à des gouttelettes contenant les deux espèces deADN. Pour distinguer des gouttelettes positives de gouttelettes négatives, les données sont déclenchés en utilisant ces parcelles 2-D. Notez que dans la figure 1A, il y a un léger décalage des gouttelettes FAM positif dans le canal VIC, ce qui indique que la sonde pour l'ADN méthylé INS présente une certaine réactivité croisée pour l'ADN non méthylé INS. De même, la figure 1B, il y a un très léger décalage des gouttelettes VIC-positives dans le canal FAM, indiquant la réactivité croisée de la sonde pour l'ADN non méthylé avec de l' ADN méthylé. Un avantage majeur de la PCR numérique est elle peut encore discriminer des signaux spécifiques, même lorsque les sondes ne sont pas 100% spécifique. Pour Poisson calculs statistiques appropriées par le logiciel, chaque réaction PCR devrait se répartir dans au moins 10.000 gouttelettes au total, afficher un cluster de gouttelettes négatives, et montrent une différence d'amplitude nette entre gouttelettes négatives et positives (pour gating fiable). Pour mettre en évidence la linéarité de nos amorces, nous pmélanges erformed des deux plasmides à travers plusieurs ordres de grandeur. Comme on le voit sur la figure 2, des concentrations variables d'un plasmide peuvent être détectés de façon linéaire , en présence d'une quantité constante du second plasmide. Pour les nouveaux laboratoires d'effectuer cette procédure, nous vous recommandons de construire une expérience de mélange similaire pour assurer que le test fonctionne dans un mode de détection linéaire.
Ensuite, nous avons obtenu le sérum de trois sujets avec le DT1 nouvelle apparition (dans les 2 jours suivant le diagnostic) et trois individus témoins sans DT1 (voir le tableau 1 pour les caractéristiques cliniques). Les protocoles ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel Université de l'Indiana. Les parents des sujets fournis le consentement éclairé. La figure 3 montre la quantification de l' ADN non méthylé et méthylé INS nombre de copies / ul de sérum, converti en log 10 de ces contrôles et les sujets DT1. Les données montrent que i es personnes avec DT1 présentent des niveaux élevés de l' ADN à la fois INS méthylé et non méthylé par rapport aux témoins, semblables aux données rapportées précédemment 6.
Figure 1: Représentant Parcelles 2-D des contrôles plasmidiques. Normes de plasmides ont été générés par clonage de fragments d'ADN de bisulfite INS converti hébergeant cytosine non méthylés ou méthylés en position -69 pb par rapport à l'INS transcription de site de départ. On peut voir ici deux emplacements en utilisant le plasmide-D contenant méthylée (A) et méthylés (B) SIN l' ADN et un mélange 1: 1 des deux plasmides (C). Les flèches identifient le + méthylé, méthylé et non méthylé méthylé (double - positif) SIN ADN contenant des gouttelettes. FAM = Cible 1; VIC = Target 2.ref = cible "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Quantification des cibles d'ADN en utilisant Control Plasmid mélanges. Normes de plasmides contenant des fragments clonés de SIN ADN de bisulfite converti hébergeant cytosine non méthylés ou méthylés en position -69 pb par rapport à l'INS transcription de site de départ ont été mélangés aux différentes combinaisons indiquées, puis soumis à une PCR multiplex numérique. La figure montre la quantification des fragments d'ADN cible, présentés sous forme de copies / ul; r 2 = 0,989 pour l' ADN non méthylé INS et r 2 = 0,998 pour l' ADN méthylé INS. S'il vous plaît cliquer ici pourvoir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: taux circulants non méthylés et méthylés d' ADN INS dans les contrôles et les sujets avec le DT1. Des échantillons de sérum ont été prélevés sur 4 jeunes nouveaux cas de DT1 et de 4 exemptes de maladies, des contrôles indépendants, puis traitées pour la mesure de l' ADN méthylé INS différentiellement par PCR numérique. Montré sont les résultats des tests de PCR numériques pour non méthylé (A) et méthylé (B) INS ADN. Les données sont affichées comme des points individuels et la moyenne ± SEM. Les statistiques ont été analysées par un élève paramétriques t test bilatéral. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de this figure.
| Contrôles | DT1 au début | |
| Âge (années) | 10,3 ± 1,3 | 9,2 ± 1,0 |
| Femelle mâle | 1: 3 | 1: 3 |
| BMI Z-Score | 0,30 ± 0,9 | 0,74 ± 0,9 |
| HbA 1C (%) | 11,1 ± 0,6 | |
| Peptide C (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tableau 1: Démographie des contrôles et sujets avec le DT1.
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Discussion
La méthylation de cytosines par ADN méthyltransférases permet le contrôle épigénétique de la transcription de nombreux gènes. Le gène de l' INS chez l'être humain est presque exclusivement exprimée dans des cellules d' îlots β, et il semble y avoir une corrélation entre la fréquence de méthylation de cytosine dans le gène INS silençage de sa transcription 11. En tant que tel, la plupart des types de cellules présentent sensiblement plus hautes fréquences de méthylation du gène de l' INS à diverses cytosines par rapport à des cellules ß 11 - 13. Il a été proposé que la prévalence de la mort cellulaire β peut être contrôlée par l' analyse des niveaux d'ADN méthylé INS acellulaire sériques, qui résulteraient en grande partie des cellules mourantes ß qui libèrent leur ADN 12.
La réaction au bisulfite convertit les cytosines non méthylées en uraciles, en laissant inchangés 14 cytosines méthylées. Le séquençage ou l'analyse par PCR of ADN converti au bisulfite permet donc de déterminer si la cytosine original était méthylée ou non. Spécifique à la méthylation PCR en utilisant la technologie à base de colorant exploite des différences d'efficacité PCR en raison de l' inadéquation 3 'de paires de bases entre les amorces et modèle, et permet ainsi de distinction non méthylé vs cytosines méthylés suivante conversion au bisulfite de l' ADN 15. Par conséquent, la PCR à base de colorant a été utilisé pour quantifier le rapport relatif des non méthylés à l' INS méthylé dans les premières études de DT1 soumet 12,16. Cependant, la technologie de PCR à base de colorant présente plusieurs inconvénients, y compris une spécificité limitée, l' absence de quantification absolue des concentrations de fragments d'ADN, et l'incapacité à multiplexer (c. -à détecter à la fois des espèces d'ADN méthylé et non méthylé dans la même réaction). D'autres groupes ont effectué le séquençage direct de fragments d'ADN sans cellules, une technique qui permet la surveillance de plusieurs sites CpG méthylés différentiellement avec beaucoup de grandeer spécificité 9. Cependant, la technique de séquençage nécessite de grands volumes d'échantillon, ne sont pas facilement se prêtent à l'utilisation d'échantillons mis en réserve, et il est coûteux.
En raison de ces limitations, notre groupe et d'autres ont employé PCR numérique, une technique qui permet la quantification absolue de fragments d'ADN, exige des quantités microlitres seulement de sérum à partir d'échantillons frais ou en banque, se prête au multiplexage, montre une plus grande sensibilité que la PCR quantitative traditionnelle , et est moins cher que le séquençage direct. La technologie PCR numérique implique l'utilisation d'essais d'amorce / sonde classique et une séparation microfluidique à base d'une réaction eau-dans-huile PCR dans ~ 20.000 gouttelettes. À la suite de cyclage thermique de la réaction partitionné, les gouttelettes sont ensuite analysées par un cytomètre de flux afin d'identifier des gouttelettes avec des signaux positifs et négatifs. les statistiques de Poisson est utilisé pour calculer les quantités absolues (nombre de copies) de chaque espèce d'ADN. Le d conceptuelÉTAILS de numérique PCR ont été décrites ailleurs 17.
Ce protocole décrit la mesure de la mort des cellules β chez l' homme par la mesure de l' ADN méthylé SIN par PCR différentielle numérique. Nos données présentées ici et ailleurs 6 montrent que les combinaisons d' amorce / sonde qui détectent la méthylation différentielle de cytosine en position -69 ( par rapport au site de début de transcription de l' INS) présentent une spécificité suffisante pour soit la cytosine non méthylés (sonde FAM) ou cytosine méthylé ( sonde VIC) (voir la figure 1A et B). Mélanges de plasmides contenant des fragments INS à la fois méthylés et non méthylés en position -69 pb (ie, bisulfite converti ADN ayant soit uracile ou cytosine en position -69 pb) signaux de gouttelettes d'exposition contenant l' un ou l'autre plasmide, ou les deux plasmides (double positifs la figure 1C). Le calcul statistique Poisson utilise enombre de gouttelettes d'e qui sont positifs pour une sonde donnée (si simple positif ou double-positif) pour calculer le nombre de copies de chaque fragment d'ADN méthylé ou non méthylé.
Lors de l' utilisation du sérum humain pour la mesure de cytosines différentiellement méthylés en position -69 pb dans l' ADN sans cellule (Figure 3), nos données montrent deux caractéristiques principales: (1) les niveaux de SIN méthylés sont 5-10 fois plus élevée chez ces sujets que méthylé INS (indépendamment du diagnostic), et (2) les niveaux absolus des deux INS non méthylés et méthylés sont plus élevés chez les sujets avec le DT1 nouvelle apparition par rapport aux témoins. Considérant que les niveaux supérieurs de l' INS méthylés par rapport à méthylé INS reflètent probablement la plus grande charge de l' ADN sans cellules provenant de cellules non-ß, les niveaux plus élevés des deux espèces de SIN chez les sujets DT1 d'apparition reflète probablement à la fois une augmentation de la β répandue la mort cellulaire (IN méthyléS), et peut - être la mort / chiffre d' affaires d'autres types de cellules qui sont associés à l'état de la maladie (par exemple, les cellules immunitaires innées et adaptatives). En outre la spéculation sur les élévations des deux espèces de SIN chez les sujets DT1 d'apparition a été discuté précédemment 6. Quelles que soient les sources des deux espèces d'INS dans le sérum de ces personnes, il est notable que la mesure des rapports de non méthylé à méthylé INS (tel que rapporté par d' autres chercheurs utilisant la PCR à base de colorant) ne serait pas ramassé les différences significatives dans les niveaux absolus décrite ici et dans notre récente publication 6, soulignant ainsi la puissance de PCR numérique pour ce type d'analyse de biomarqueurs.
Quelques précautions et limitations doivent être notées. Nous pensons qu'il est important que le sang est traitée dans les 4 heures de collecte et soit utilisé immédiatement pour l'isolement de l'ADN ou stocké à -80 ° C pour une utilisation future. Dans les études non publiées, nous avons obsdé- laissées une certaine perte de récupération de l' ADN après 4 h de collecte, peut - être en raison de la dégradation de l' ADN, comme on le voit dans les études sur le stockage à long terme des échantillons 18. En raison de la sensibilité accrue du PCR numérique, un soin particulier doit être pris pour éviter la contamination des échantillons qui seraient autrement pas être visible dans qPCR traditionnelle. Enfin, une limitation essentielle de la technique est l'analyse des échantillons dans lesquels la génération de gouttelettes ne dépasse pas 10.000 ~ gouttelettes. Ces échantillons ne fournissent pas de statistiques fiables Poisson, et en tant que tels peuvent être considérés comme ininterprétable. Causes multiples de cette faible génération de gouttelettes peuvent inclure des erreurs techniques dans la manipulation des échantillons, des problèmes techniques avec le générateur de gouttelettes, ou des problèmes liés à la qualité des réactifs utilisés.
En résumé, ce rapport décrit le protocole détaillé pour la mesure de l' ADN méthylé différentiellement exempt de cellules INS à la position -69 pb par PCR numérique. Le protocole décrit ici peut être adapté à touteles espèces d'ADN pour lesquelles la détection de cytosines méthylées différentiellement est souhaitée, que ce soit de la circulation ou à partir des cellules et des tissus isolés et peuvent fournir une quantification absolue de fragments d'ADN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
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